彭芳 趙盼 宋惠彬 劉東成 鄒暢

1.深圳市人民醫(yī)院健康管理中心 暨南大學第二臨床醫(yī)學院 南方科技大學第一附屬醫(yī)院，廣東深圳 518020；2.深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心 暨南大學第二臨床醫(yī)學院 南方科技大學第一附屬醫(yī)院，廣東深圳 518020

肺癌是我國最常見的癌癥，據(jù)最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肺癌的發(fā)病率和病死率在我國男性中位居第一，在女性中位居第二。非小細胞肺癌（non–small cell lung cancer，NSCLS）是肺癌的主要亞型（約85%），每年全球新增肺癌病例僅次于乳腺癌，發(fā)病率高達11.4%，5 年生存率低于15%。在過去的10 年中，對肺癌基因組和信號通路的深入分析進一步將非小細胞肺癌定義為一組具有遺傳和細胞異質(zhì)性的不同疾病。在NSCLC 的治療方面，靶向藥物的出現(xiàn)為肺癌患者帶來了全新的希望，但也僅有約40%患者攜帶符合靶向藥物的基因突變，仍有一半左右的患者需接受傳統(tǒng)化療或其他方法進行治療。甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase–like，METTL）是一個多樣化的蛋白質(zhì)家族，其特征是存在甲基轉(zhuǎn)移酶樣結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)上保守的S–腺苷甲硫氨酸（S–adenosylmethionine，SAM）結(jié)合結(jié)構(gòu)域，有研究表明甲基化能直接影響染色質(zhì)組織并調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，且不會使基因本身突變。此外，甲基轉(zhuǎn)移酶在遺傳疾病、癌癥和代謝疾病的發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白–7B（methyltransferase–like 7B，METTL7B）是甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白家族中的一員，近期有研究證明其與非小細胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，但其影響非小細胞肺癌的進展的機制尚不清楚，因此本文主要探討METTL7B 促進非小細胞肺癌細胞侵襲的機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細胞肺癌細胞A549 購自中國cellcook 公司，DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，胎牛血清購自美國Hyclone 公司，青霉素–鏈霉素購自上海麥克林生化科技有限公司，METTL7B 抗體購自英國Abcam 公司，Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen公司，蛋白提取以及蛋白定量的試劑均購于美國Thermo 公司，PCR 引物購于中國廣東艾基生物公司，提取總RNA 試劑、RT–qPCR 試劑盒均購自美國Invitrogen 公司。

1.2 實驗方法

（1）細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：A549 細胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃，5%CO的細胞培養(yǎng)箱中。按照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將 METTL7B 過表達慢病毒載體（pLV–METTL7B–Flag）及陰性對照慢病毒載體（pLV–NC–Flag）感染A549 細胞，培養(yǎng)6h 后換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，然后胰酶消化細胞，800g 離心5min，棄上清，收集細胞，備用。

（2）RT–qPCR 檢測：A549 細胞和BEAS–2B細胞的總RNA 利用TRIzol 法提取獲得，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。METTL7B 引物序列：上游5’–CCAGATAAA GGGGCTTACAGGAG–3’，下游5’–TCAGCCATGCT CTTTGTCAGG–3’。依照RT–qPCR 說明書進行PCR反應，條件設為：95℃預變性10min，95℃、35s，62℃、35s，72℃、5min，連續(xù)40 個循環(huán)，每組設3個重復孔。分析RT–qPCR 的擴增及溶解曲線并計算目的基因的相對表達量=2。

（3）Western blotting 法檢測：將METTL7B 過表達的A549 細胞和對照組收細胞并提取細胞總蛋白，利用BCA 試劑盒法測定蛋白濃度。上樣蛋白量為50μg/孔，等量的蛋白質(zhì)樣品通過SDS–PAGE 上傳和分離，然后電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene，PVDF）膜上。膜是在室溫下封閉在5%脫脂奶粉中1h，然后在4℃孵育過夜。然后將膜與室溫下HRP偶聯(lián)二抗1h。條帶信號由ECL 試劑檢測，以目的條帶與內(nèi)參β–actin 的比值作為半定量依據(jù)。

（4）Transwell 細胞侵襲實驗：用0.25%的胰蛋白酶消化過表達METTL7B 的A549 細胞與對照組細胞，每孔加入1×10個/400μl 細胞于DMEM 無血清培養(yǎng)基中，將Transwell 小室放入24 孔板中，小室中加100μl 的細胞懸液，下室中加500μl 的細胞完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的DMEM），每組3 個重復孔。將細胞培養(yǎng)于37℃，5% CO細胞培養(yǎng)箱中24h，取出小室，PBS 洗2 次，棉簽輕擦掉未遷移的上層細胞，遷移的細胞用4%的多聚甲醛固定30min，結(jié)晶紫染色，PBS 漂洗，干燥后，取5～10 個高倍鏡視野觀察并計數(shù)。

（5）雙向電泳第一向電泳：取過表達MTTL7B的A549 細胞和未處理的A549 細胞混合蛋白，加樣于pH 梯度干膠條上，再根據(jù)等電聚焦儀操作方法設置相關(guān)程序。第二向垂直電泳：十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰氨凝膠電泳膠濃度為12%，電泳條件為：50V，30min；300V，5h。重復3 次。并利用膠體考馬斯亮藍進行凝膠染色。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 METTL7B 在A549 細胞系中的表達

qPCR 和Western blotting 法分析結(jié)果一致，與BEAS–2B 細胞相比，A549 細胞系中METTL7B 表達顯著升高（<0.05），詳見圖1A、B。

圖1 METTL7B 在非小細胞肺癌細胞系中的表達

2.2 過表達METTL7B 對A549 細胞的侵襲作用

實驗前，通過Western blotting 法驗證了METTL7B在A549 細胞中的過表達情況，結(jié)果顯示，METTL7B在A549 細胞中過表達成功，詳見圖2A。為了評估METTL7B 對非小細胞肺癌細胞的侵襲影響，進行侵襲試驗，結(jié)晶紫染色24h 后統(tǒng)計分析進入小室的細胞量可以發(fā)現(xiàn)，A549–METTL7B 組侵襲細胞數(shù)量明顯多于A549–NC 組（<0.05），即METTL7B 過表達可增強A549 細胞的侵襲能力，詳見圖2B、C。

圖2 METTL7B 過表達對A549 細胞的侵襲作用

2.3 過表達METTL7B 非小細胞肺癌細胞中蛋白質(zhì)組學分析

可獲得分辨率和重復率較高的A549–NC 和A549–METTL7B 的蛋白2–DE 圖譜，凝膠圖譜中清晰可辨的有效蛋白點數(shù)平均分別為（813±21）個和（879±30）個，圖譜兩者匹配率為81%，詳見圖3A。

A549–NC 與A549–METTL7B 兩組的2–DE 差異蛋白比較有12 個差異蛋白點，其中有6 個差異蛋白點在A549–METTL7B 細胞中表達上調(diào)，6 個差異蛋白點是表達下調(diào)，主要分布在25～63kDa，詳見表1。另外進一步通過Western blotting 法實驗驗證發(fā)現(xiàn)上調(diào)的基因SOD1 和SAE1 在A549–METTL7B 細胞中高表達，詳見圖3C 與雙向電泳分析結(jié)果一致，詳見圖3B。

表1 過表達METTL7B 非小細胞肺癌細胞中差異蛋白

圖3 過表達METTL7B 非小細胞肺癌細胞中蛋白組分析

3 討論

肺癌在全球是最常見的惡性腫瘤之一，也是男性發(fā)病率最高和癌癥死亡的主要原因。近年來，隨著環(huán)境污染及其他因素的惡化，肺癌發(fā)生率呈逐年上升趨勢，但其發(fā)病機制非常復雜，導致其防治形勢非常嚴峻。因此迫切需要確定特定的分子生物標志物，尤其是以前未被識別的分子，用于肺癌早期診斷及為肺癌的治療提供新思路。METTL7B 是哺乳動物甲基轉(zhuǎn)移酶樣家族的一員，有研究表明甲基轉(zhuǎn)移酶樣家族的成員參與了各種生物學功能和在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。然而，METTL 家族其他成員在癌癥發(fā)展中的作用在很大程度上仍未被探討。

本研究對過表達METTL7B 影響非小細胞肺癌細胞侵襲機制進行了初步研究，結(jié)果表明，過表達METTL7B 可增強非小細胞肺癌的侵襲能力，并通過雙向電泳技術(shù)分析了過表達METTL7B 細胞中差異蛋白，發(fā)現(xiàn)共有12 個差異表達蛋白，其中上調(diào)6個，下調(diào)6 個，并對上調(diào)差異蛋白的驗證發(fā)現(xiàn)，過表達METTL7B 細胞中的SOD1 和SAE1 的表達也是上調(diào)的。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物體內(nèi)減輕氧化應激損傷主要的抗氧化酶之一，具有捕獲或中和自由基以阻止進一步氧化損傷的作用，因而也是ROS 清除的第一道防線。首次證實銅/鋅超氧化物歧化酶（superoxide dismutase 1，SOD1）的酶促功能是在1969年。隨后數(shù)十年的研究揭示了SOD1 生物學的幾個關(guān)鍵方面，包括作為活性二聚體的SOD1 的結(jié)構(gòu)，其必需的金屬輔助因子（銅和鋅）以及將超氧自由基轉(zhuǎn)化為分子氧和過氧化氫的能力。在疾病背景下，SOD1 以其在家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥（familial amyotrophic lateral sclerosis，fALS）中的作用而聞名，其中各種各樣的SOD1 突變增加SOD1 聚集的傾向，這被認為最終誘導運動神經(jīng)元死亡。此外，SOD1 在多種癌癥中也被發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)。Liu等研究發(fā)現(xiàn)SOD1 通過miR–409–3p/SOD1/SETDB1 正反饋環(huán)路促進非小細胞肺癌的增殖、遷移和侵襲。Gomez等發(fā)現(xiàn)SOD1對于癌基因驅(qū)動的增殖至關(guān)重要，但與妊娠相關(guān)的乳腺或其他正常增殖組織（如皮膚和腸道）的正常增殖并非如此，且表明癌基因ErbB2 的激活與ROS 增加有關(guān)，且ErbB2 癌細胞的高ROS 亞群顯示SOD1 升高。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達METTL7B 細胞中SOD1 是上調(diào)的，與Song等最新研究表明在過表達METTL7B 的肺腺癌細胞系中SOD1 顯著上調(diào)的趨勢一致；其次，小泛素樣修飾劑（small ubiquitin–like modifier，SUMO）是一種蛋白質(zhì)修飾途徑，可調(diào)節(jié)多種生物過程，包括細胞分裂、DNA 復制/修復、信號轉(zhuǎn)導和細胞代謝。SUMO 通過由SUMO 特異性激活酶（E1）、綴合酶（E2）和連接（E3）酶催化的異肽鍵與靶蛋白中的賴氨酸殘基綴合。SUMO 激活酶E1（SUMO–activating enzyme subunit 1，SAE1）屬于泛素激活酶E1 家族成員，其前體包含101 個氨基酸，且具有一個靈活的NH末端，COOH 末端的4個氨基酸被SUMO 異肽酶切割，以揭示與靶蛋白的賴氨酸殘基形成異肽鍵所需的保守二甘氨酸殘基，其主要定位于細胞核，在很多組織中表達。SAE1 主要介導乙酰化修飾和磷酸化翻譯修飾途徑，在染色體分裂和細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。有研究表明，SAE1 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在肝癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)SAE1 有不同程度的表達上調(diào)。Ong等研究表明，SAE1 在肝癌組織中的過表達與正常癌旁組織相比，SAE1 高表達與疾病轉(zhuǎn)移和進展密切相關(guān)且上調(diào)的SAE1 的致癌作用與失調(diào)的癌癥代謝信號傳導有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)過表達METTL7B 細胞中SAE1 是上調(diào)的，與朱嘉微發(fā)現(xiàn)SAE1 在肺癌中表達上調(diào)結(jié)果趨勢一致。因此，得出METTL7B 可能通過上調(diào)SOD1 和SAE1 的表達，從而增強非小細胞肺癌細胞的侵襲能力。