馮 華，薛洪剛，徐玉秀

(遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團阜新礦總醫(yī)院a.兒科；b.呼吸內科；c.檢驗科，遼寧阜新 123000）

肺炎支原體肺炎是小兒常見的呼吸系統(tǒng)感染性疾病，該病具有自限性，大多數(shù)患兒病情輕，經(jīng)大環(huán)內脂類抗生素治療后可痊愈。但是有少部分患兒經(jīng)足夠療程治療后臨床癥狀仍未見好轉甚至加重，屬于難治性肺炎支原體肺炎（refractoryMycoplasma pneumoniaepneumonia，RMPP）[1-2]。RMPP 如若不積極治療可發(fā)展為肺不張、胸腔積液、壞死性肺炎，延長患兒住院時間，增加醫(yī)療負擔，嚴重者可導致死亡[3-4]。早期識別RMPP 有助于規(guī)范臨床治療，避免不必要的抗生素暴露，減少嚴重并發(fā)癥的發(fā)生?，F(xiàn)有研究顯示RMPP 與機體過度炎癥反應有關[5]。長鏈非編碼核糖核酸（long non-coding ribonucleic acid，LncRNA）是一類長度超過200nt，自主轉錄的非編碼RNA，主要作用為表觀遺傳、調控轉錄及轉錄后基因表達，現(xiàn)有研究顯示LncRNA 肺腺癌轉移相關轉錄因子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）可抑制乳腺癌易感基因1（ breastcancer susceptibility gene 1，BRCA1）表達促使中性細胞遷移浸潤，誘導炎性因子釋放，加重炎癥反應[6]。LncRNA 煙酰胺核苷酸反義轉氫酶RNA1（nicotinamide nucleotide transhydrogenase -antisense RNA1, NNT AS1）可通過miR-582-5p/ FBXO11 信號通路誘導慢性阻塞性肺疾病炎癥反應[7]。然而，LncRNA MALAT1，LncRNA NNT AS1 異常表達是否與RMPP 發(fā)病有關尚不清楚，本研究擬探討LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 在RMPP 患兒中的表達情況，并分析其與RMPP 發(fā)病以及治療療效的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018年1月1日～2021年1月1日遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團阜新礦總醫(yī)院收治的200 例肺炎支原體肺炎患兒，其中43 例為RMPP（RMPP 組），男性27 例，女性16 例；年齡1 ～12（6.02±2.16）歲。157 例為普通肺炎支原體肺炎（普通肺炎組），男性89 例，女性68 例，年齡2 ～12（6.11±2.45）歲。納入標準：①病原學檢查確認為肺炎支原體感染；②符合第8 版《諸福棠實用兒科學》中肺炎支原體肺炎診斷標準[8]；③CT 提示肺部感染病灶。排除標準：①并發(fā)其它病原菌感染；②并發(fā)呼吸道感染、哮喘、慢性肺疾病、免疫性疾??；③肺炎支原體肺炎反復住院者，呼吸偽影干擾CT檢查者，病歷資料缺失者。RMPP 判定標準[9]：規(guī)律應用大環(huán)內酯類抗生素治療7天及以上仍有發(fā)熱、咳嗽等臨床癥狀，C 反應蛋白（CRP）＞40mg/L，肺部影像學加重。另選擇同期于遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團阜新礦總醫(yī)院體檢健康的100 例兒童為對照組，其中男性55 例，女性45 例，年齡2 ～10(6.33±2.11)歲。三組受試兒童一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），本研究獲得遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團阜新礦總醫(yī)院倫理學委員會批準，患兒監(jiān)護人均知情同意并簽署同意書。

1.2 儀器與試劑 Trizol 試劑(美國Thermo Fisher公司)，M-MLV 逆轉錄酶(Epicentre 公司)，7500型qRT-PCR 儀(美國ABI 公司)。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒(美國R&D 公司)，儀器為瑞士Hamilton FAME 全自動酶聯(lián)免疫分析儀；羅氏Cobas e601 型全自動電化學發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)。

1.3 方法 所有患兒于入院后（對照組體檢當日）第2 天抽取空腹靜脈血3ml 注入干燥試管，待血液自然凝固后離心10min（3 000r/min，半徑10cm）取上清液上機檢測。Trizol 法提取RNA，M-MLV逆轉錄酶將A260nm/A280nm比值位于1.9 ～2.1 的RNA逆轉錄為cDNA，反應體系20 μl，反應條件:16℃15 min，42℃ 5 min，95℃ 30 s。qRT-PCR 儀檢測血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 相對表達量，取2μl cDNA 樣品加入qRT-PCR 體系，除cDNA樣品外還包括SYBR?Premix Ex Taq? II（2×）12.5μl，dNTP1.6μl，Taq DNA 聚合酶1μl，上下游引物 10μmol/L 各1μl，反應緩沖液5.9μl。反應條件：95℃預變性10 min, 95℃變性10s, 60℃退火20s, 72 ℃延伸10s，一共做40 個循環(huán)。引物合成及序列測定由上?；瞪锛夹g有限公司完成，引物序列：LncRNA MALAT1，上游：5’-CTCCCCACACAAGCAACTTCTC-3’，下游：5’-TTCAACCCACCAAAGACCTC-3’；LncRNA NNTAS1，上游：5’-TGAAGTTTTCAGGGACACAT-3’，下游：5’-TTTAGACCTGTTTCTTTGTT-3’；β-actin，上游：5’-TGCGTGACATTAAGGAGAA-3’，下游：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGT-3’。以β-actin RNA為內參，2-ΔΔCt法計算LncRNA MALAT1，Lnc RNA NNT-AS1 相對表達量。另取血清樣品，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平。采用羅氏Cobas e601 型全自動電化學發(fā)光免疫分析儀檢測血清CRP，降鈣素原（procalcitonin，PCT）水平。

收集并整理所有患兒的臨床資料，包括性別、年齡、發(fā)病季節(jié)、熱程、體溫、病程、血細胞檢測指標（白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)）、影像學特點（受累肺部范圍、有無肺大片實變影、有無胸腔積液）、肺外并發(fā)癥（食欲不振、嗜睡、嘔吐、心率加快等）。

臨床治療以及療效評價：按照《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識(2015年版)》[9]治療原則給予退熱、止咳、平喘等支持治療，并給予米諾環(huán)素口服治療，首劑頓服4 mg/kg，后2mg/(kg·d)，12 h/次，連續(xù)治療5 天。同時增加甲潑尼龍1 ～2 mg/（kg·d）靜脈點滴治療，療程3 ～5 天，后改為口服1 mg/（kg·d）治療5 ～7 天。呼吸道黏液阻塞患兒給予支氣管鏡治療。療效標準[10]：顯效：治療后體溫恢復正常，咳嗽癥狀消失，肺喘鳴音及啰音消失，胸片或CT 示陰影消失；有效：治療后體溫基本恢復正常，咳嗽癥狀緩解，肺部喘鳴音及啰音明顯減少，胸片或CT 顯示陰影吸收；無效：治療后體溫、咳嗽癥狀、肺部喘鳴音及啰音無明顯改善或加重，胸片或CT 示陰影無明顯變化或明顯加重。以顯效和有效為有效，43 例RMPP 患兒治療有效38 例（有效組），無效5 例（無效組）。

1.4 統(tǒng)計學分析 SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)分析。K-S法檢驗計量資料擬合優(yōu)度，以均數(shù)±標準差(±s)表示正態(tài)分布計量資料，以中位數(shù)（P25，P75）[M（Q1，Q3）]表示偏態(tài)計量資料，分別采用單因素方差分析（兩兩對比采用LSD-t檢驗），Wilcoxon秩和檢驗。以率(%)表示計數(shù)資料，采用χ2檢驗。Pearson 相關系數(shù)描述血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 表達與炎癥因子之間的相關性。Logistic 逐步回歸分析RMPP 發(fā)生的影響因素。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 三組血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNTAS1 及炎癥因子水平比較 見表1。RMPP 組血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 及CRP，PCT，IL-8，TNF-α 水平高于普通肺炎組(t=21.087,20.704, 50.002, 15.858, 14.366, 13.653, 均P=0.000)和對照組（t=21.356, 21.235, 180.879, 23.716, 28.244,19.777, 均P=0.000），差異均有統(tǒng)計學意義。普通肺炎組血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1及CRP，PCT，IL-8，TNF-α 水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=5.343, 6.905, 47.336, 29.067,20.071, 10.143, 均P=0.000）。

2.2 血 清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1表達與炎癥因子的相關性 RMPP 組血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 表達水平與CRP，PCT，IL-8，TNF-α 水平均呈正相關（r=0.922, 0.823,0.786, 0.821；0.873, 0.715, 0.804, 0.812,均P=0.000）。

表1 三組血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 及炎癥因子水平比較(±s)

表1 三組血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 及炎癥因子水平比較(±s)

項 目RMPP 組（n=43）普通肺炎組（n=157）對照組（n=100）F 值P 值LncRNA MALAT13.26±0.851.32±0.411.05±0.37335.6930.000 LncRNA NNT-AS13.38±0.921.41±0.401.06±0.39335.8280.000 CRP（mg/L）45.24±2.0119.02±3.273.26±0.774 207.1640.000 PCT（μg/L）1.58±0.520.82±0.160.31±0.09457.1870.000 IL-8（μg/L）42.77±8.8426.35±5.9113.02±3.79410.3000.000 TNF-α（μg/L）9.22±2.615.02±1.493.32±0.96214.8750.000

2.3 RMPP 發(fā)病的影響因素 RMPP 組熱程、體溫、病程、白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、肺受累范圍≥2/3 肺葉人數(shù)占比、肺大片實變影人數(shù)占比、肺外并發(fā)癥發(fā)生率均大于普通肺炎組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；兩組在年齡、性別、發(fā)病季節(jié)、有無胸腔積液方面比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。以是否患RMPP 為因變量，以LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1，CRP，PCT，IL-8，TNF-α，熱程、體溫、病程、白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、受累肺部范圍、肺大片實變影、肺外并發(fā)癥為自變量納入Logistic 逐步回歸分析，向后逐步法排除無關變量，結果顯示肺大片實變影、CRP 高表達、LncRNA MALAT1 高表達、LncRNA NNT-AS1 高表達是RMPP 發(fā)病的危險因素（均P＜0.05），見表3。

表2 RMPP 組和普通肺炎組臨床資料比較[x±s, n(%), M(Q1,Q)]

表3 RMPP 發(fā)病影響因素的Logistic 逐步回歸分析

2.4 不同療效RMPP 血清LncRNA MALAT1，Lnc RNA NNT-AS1表達水平比較 有效組血清LncRNA MALAT1（3.16±0.24），LncRNA NNT-AS1（3.29±0.20）表達水平低于無效組（4.02±0.09，4.06±0.10），差異有統(tǒng)計學意義（t=7.869，8.406，均P＜0.05）。

3 討論

肺炎支原體肺炎是兒童社區(qū)獲得性肺炎最常見的形式之一，雖然肺炎支原體感染通常具有自限性，但仍有部分病例在大環(huán)內酯類抗生素治療7 天或更長時間后仍未得到緩解。難治性肺炎支原體肺炎（RMPP）的發(fā)病原因復雜，與大環(huán)內酯類耐藥、并發(fā)其它病原體感染和免疫紊亂等有關。RMPP 與普通性肺炎支原體肺炎具有相似臨床癥狀，發(fā)病早期難以鑒別，當RMPP 確診時患兒可能已經(jīng)出現(xiàn)嚴重的肺部損傷和肺外并發(fā)癥，延誤治療時機，加之抗生素濫用、耐藥以及糖皮質激素的不規(guī)范使用，導致治療難度大大增加。因此亟需找到可早期診斷RMPP 發(fā)生的指標。近年來國內外研究普遍認為細胞免疫介導的炎癥反應與RMPP 有關，炎性因子的過度合成和釋放被認為是引起RMPP 的主要相關因素[5,11]。

LncRNA 是具有高度組織特異性的RNA，人類和哺乳動物大多數(shù)基因組產(chǎn)物以LncRNA 形式存在，LncRNA 可調節(jié)絕大多數(shù)生理和病理過程，具有調控表觀遺傳、轉錄后調節(jié)基因表達、調控微小RNA，基因結構重塑、組蛋白修飾等多種生物學功能[12]?，F(xiàn)有研究顯示多種LncRNA 參與炎性反應調節(jié)過程，在急性痛風性關節(jié)炎、慢性阻塞性肺疾病、潰瘍性結腸炎等炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[13-15]。

LncRNA MALAT1 是最早被鑒定的與人類疾病相關的LncRNA 之一，已知其參與多種惡性腫瘤的進展和轉移過程[16]。近期發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1在炎性疾病中也起著重要的調節(jié)作用，LncRNA MALAT1 通過調控miR 146a/核因子 κB（NF κB）促炎信號通路參與脂多糖誘導的急性腎損傷發(fā)病過程[17]。LncRNA MALAT1 還可通過miR 149 /髓樣分化因子88（MyD88）/NF κB 軸調控炎性因子TNF-α，白細胞介素 1β 和白細胞介素-6 釋放，在脂多糖誘導的急性肺損傷中發(fā)揮重要作用[18]。LncRNA MALAT1 是否參與RMPP 發(fā)病尚不清楚，本研究發(fā)現(xiàn)RMPP 組血清LncRNA MALAT1表達水平明顯上調，LncRNA MALAT1 表達水平與炎性因子CRP，PCT，IL-8，TNF-α 水平均呈正相關，Logistic 逐步回歸分析結果表明LncRNA MALAT1 高表達是RMPP 發(fā)病的危險因素，說明LncRNA MALAT1 可能通過調控炎性因子表達參與RMPP 發(fā)病。CAO 等[19]人研究結果顯示LncRNA MALAT1 過表達可通過miR 181c 5p/高遷移率族1（HMGB1）軸加劇缺血性腦組織炎癥反應，敲低LncRNA MALAT1 可下調HMGB1 表達，抑制炎癥反應，說明LncRNA MALAT1 在炎性疾病中發(fā)揮促炎作用機制，支持本研究結論。推測LncRNA MALAT1 參與RMPP 發(fā)病的機制為：NF κB 參與肺炎支原體肺炎的炎癥反應過程[20]，LncRNA MALAT1 異常表達依賴NF κB，LncRNA MALAT1通過與NF κB相互作用參與炎癥反應調節(jié)過程[21]，因此LncRNA MALAT1 可能通過調節(jié)NF κB 活化來調節(jié)炎癥反應，誘導RMPP 發(fā)生。

LncRNA NNT- AS1 是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞質LncRNA，定位于人類5 號染色體，通過與miRNA競爭性影響多種信號通路調控大量下游基因表達參與惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展[22]。MEI 等[7]人發(fā)現(xiàn)LncRNA NNT- AS1 通過調節(jié)miR-582-5p / FBXO11信號促使氣道炎癥反應和重塑，提示LncRNA NNTAS1 具有炎性調節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)LncRNA NNTAS1 在RMPP 組表達水平明顯上調，LncRNA NNTAS1 高表達是RMPP 發(fā)病的危險因素之一，說明LncRNA NNT- AS1 與RMPP 發(fā)病有關。MEI 等[7]人報道顯示LncRNA NNT-AS1 在香煙煙霧提取物處理的16HBE 細胞中表達上調，敲低LncRNA NNT-AS1 表達可抑制消除香煙煙霧提取物介導的氣道炎癥反應，說明LncRNA NNT- AS1 在氣道炎癥疾病中發(fā)揮促炎作用，該作用與LncRNA NNTAS1/miR-582-5p/FBXO11 信號軸調控作用有關。本研究相關性分析結果顯示LncRNA NNT -AS1 表達水平與炎性因子CRP，PCT，IL-8，TNF-α 水平呈正相關，推測LncRNA NNT-AS1 過表達可能通過促進炎性反應，誘導和擴大肺部炎癥反應，參與RMPP 發(fā)病過程。本研究Logistic 逐步回歸分析顯示CRP 高表達、肺大片實變影與RMPP 發(fā)病也密切相關，翟佳羽等[23]人報道也指出肺部影像學表現(xiàn)加重是識別RMPP 的影像學指標，血清CRP 水平升高是RMPP 的獨立危險因素，提示血清CRP水平、肺大片實變影也可作為鑒別普通肺炎支原體肺炎和RMPP 的依據(jù)，臨床可結合患兒肺部CT 及血清CRP，LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1檢測進行綜合評估。本研究無效組血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 表達高于有效組，提示血清LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 表達與RMPP 臨床治療療效也存在密切關系，可作為評估臨床療效的指標。

綜上，RMPP 患兒血清LncRNA MALAT1, Lnc RNA NNT-AS1 均呈高表達，且LncRNA MALAT1，LncRNA NNT-AS1 與RMPP 發(fā)病、機體炎癥反應以及臨床治療效果均有關。