王 維，唐 靜，楊永紅，薛 峰

（1.成都市龍泉驛區(qū)婦幼保健院 a.檢驗(yàn)科；b.婦產(chǎn)科，成都 610100;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院龍泉醫(yī)院檢驗(yàn)科，成都 610100）

妊娠期高血壓疾病是妊娠相關(guān)疾病。子癇前期（preeclampsia，PE）是嚴(yán)重的妊娠并發(fā)癥之一，全球約有4%～5%的妊娠婦女受其影響，全身多系統(tǒng)受累，重者將導(dǎo)致嚴(yán)重母嬰不良事件的發(fā)生[1-3]。隨著孕周增加，滋養(yǎng)層細(xì)胞將從增殖型轉(zhuǎn)化為侵襲型，利于胎盤著床。而胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞遷移侵襲能力缺陷將導(dǎo)致胎盤淺著床，促進(jìn)妊娠期高血壓疾病的發(fā)生[4]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)葉酸代謝異常，相關(guān)基因多態(tài)性與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生具有一定的相關(guān)性[5]，子癇前期患者胎盤組織中甲硫氨酸合成酶(methionine synthase，MTR)的表達(dá)顯著增加。MTR 是葉酸代謝的關(guān)鍵基因之一，催化同型半胱氨酸的再甲基化，形成甲硫氨酸以及S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosylmethionine，SAM）[6]。甲硫氨酸[7]及SAM[8-9]均被報(bào)道具有抑制細(xì)胞的遷移及侵襲能力，提示MTR 的表達(dá)異?？赡軈⑴c妊娠期高血壓的胎盤淺著床過程。本研究將進(jìn)一步研究MTR 對上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）相關(guān)基因的調(diào)控作用以及對滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8 細(xì)胞遷移侵襲能力的影響。以期從葉酸代謝的角度探究妊娠期高血壓疾病的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 HTR8 人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞株購于美國ATCC 細(xì)胞庫。2018年1月～2020年12月在成都市龍泉驛區(qū)婦幼保健院分娩的30 例妊娠期高血壓疾病、28 例子癇前期和20 例重度子癇前期患者及25 例正常產(chǎn)婦作為研究對象。各組病例比較年齡及身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），具有可比性，見表1。納入標(biāo)準(zhǔn)為：單胎妊娠，剖宮產(chǎn)終止分娩。妊娠期高血壓標(biāo)準(zhǔn)為妊娠20 周以后出現(xiàn)收縮壓≥140 mmHg 和/或舒張壓≥90 mmHg；子癇前期標(biāo)準(zhǔn)為妊娠期高血壓患者出現(xiàn)蛋白尿(尿蛋白 ≥0.3 g/24 h或隨機(jī)尿蛋白≥+)；重度子癇前期標(biāo)準(zhǔn)為子癇前期患者出現(xiàn)收縮壓≥160 mmHg 和/或舒張壓≥110 mmHg。排除標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性高血壓、既往心肝腎及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、胎膜早破、早產(chǎn)、感染。本研究已取得倫理委員會批準(zhǔn)同意及患者知情同意。

表1 各組病例基線資料比較（± s）

表1 各組病例基線資料比較（± s）

項(xiàng)目對照組（n=30）妊娠期高血壓（n=28）子癇前期（n=20）重度子癇前期（n=25）FP年齡（歲）28.50±1.5329.12±0.7930.50±2.329.80±1.643.471＞0.05 BMI（kg/m2）21.8±1.422.1±0.920.5±1.222.3±0.85.310＞0.05

1.2 儀器與試劑 DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)液，胎牛血清（FBS），0.25g/dl 胰蛋白酶（100ml PBS, 0.25g胰酶），100 U/ml 濃度青霉素＋鏈霉素，lipofactemine2000，TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）；基質(zhì)膠（康寧公司）；引物合成項(xiàng)目（上海生工生物工程股份有限公司）；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime Script RT Reagent Kit），real-time PCR 試劑盒（SYBR Premix Ex Taq II）（日本Takara 公司）；MTR siRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；MTR，ZEB1，E-Cadherin 和GAPDH 一抗（Abcam 公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集及細(xì)胞培養(yǎng)：采集研究對象分娩5min 內(nèi)母體面胎盤組織（避開血塊、梗死及鈣化），PBS 洗凈后保存于液氮中。HTR8 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞株培養(yǎng)于含10g/dl FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)液中，并添加100 U/ml 濃度青霉素＋鏈霉素。

1.3.2 siRNA 轉(zhuǎn)染：本研究所涉及MTR-siRNA 由吉瑪基因設(shè)計(jì)、合成、驗(yàn)證。使用Lipofactemine3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，詳細(xì)步驟參考產(chǎn)品說明書，48h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，包括抽提RNA，real-time PCR，Transwell 實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 細(xì)胞和組織中RNA 抽提及qRT-PCR： 使用TRIzol 法提取細(xì)胞RNA 并檢測濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)一步進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR 程序使用產(chǎn)品說明書推薦程序。本實(shí)驗(yàn)涉及引物序列如下：GAPDH（人），F(xiàn)-5’-TGTGGGCATCAATGGATTTG G-3’，R-5’- ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3’；MTR（人），F(xiàn)-5’- AGCGGGAGAAGCTAAACGAA G-3’，R-5’- CGGTAGGCCAAGTGTTCAAGG-3’；E-Cadherin（人），F(xiàn)-5’- CGAGAGCTACACGTTCA CGG -3’，R-5’-GGGTGTCGAGGGAAAAATA GG-3’；ZEB1（人），F(xiàn)-5’- GATGATGAATGCGAGT CAGATGC -3’，R-5’- ACAGCAGTGTCTTGTT GTTGT-3’。以GAPDH表達(dá)量作為內(nèi)參，并使用2-ΔΔCt值計(jì)算靶基因的相對表達(dá)量。

1.3.4 Western blotting：使用RIPA 提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。使用PVDF 膜濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5g/dl 脫脂奶粉封閉1 h 后加入一抗4℃孵育過夜。次日，TBST 洗膜后加入相應(yīng)種屬的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h 后使用ECL 發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)量。

1.3.5 細(xì)胞遷移及侵襲試驗(yàn)：將1∶5 稀釋的基質(zhì)膠鋪于Transwell 的上層小室中，成膜后進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)（遷移實(shí)驗(yàn)無需使用基質(zhì)膠）。上層小室中加入約5×104個(gè)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，下層小室加入含20% FBS 的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h 后取出Transwell小室，經(jīng)PBS 清洗，4%多聚甲醛固定后使用結(jié)晶紫染色，棉簽拭去上層未遷移細(xì)胞后顯微鏡觀察拍攝，統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞遷移、侵襲的情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，制圖、數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較均采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTR 和EMT 相關(guān)基因在胎盤組織中的表達(dá)見表2，圖1。與對照組相比，隨著妊娠期高血壓疾病分期的進(jìn)展，胎盤組織中MTR mRNA 的表達(dá)量逐漸增加，子癇前期與重度子癇前期患者胎盤組織中E-Cadherin 的表達(dá)增加，妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中ZEB1 的表達(dá)量下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。隨著疾病分期進(jìn)展，MTR及E-Cadherin 的蛋白表達(dá)量明顯增加，而ZEB1 的蛋白表達(dá)量明顯降低。

表2 胎盤組織中MTR 基因，EMT 相關(guān)基因的相對表達(dá)量（± s）

表2 胎盤組織中MTR 基因，EMT 相關(guān)基因的相對表達(dá)量（± s）

注：妊娠期高血壓 vs 對照組tZEB1=-4.920，P ＜0.05；子癇前期 vs 對照組tMTR=10.143，tE-Cadherin=8.327, tZEB1=-5.372, 均P ＜0.05；重度子癇前期 vs 子癇前期、妊娠期高血壓組相比，tMTR=20.160, tE-Cadherin=9.437，tZEB1=-9.352，均P ＜0.05；子癇前期vs 妊娠期高血壓tMTR=7.564，tZEB1=-4.214, 均P ＜0.05；重度子癇前期vs 妊娠期高血壓tMTR=10.253, tE-Cadherin=6.297，tZEB1= -7.986，均P ＜0.05；重度子癇前期 vs 子癇前期組tMTR=18.984，tE-Cadherin=10.841，tZEB1=-13.938，均P ＜0.05。

項(xiàng)目對照組（n=30）妊娠期高血壓（n=28） 子癇前期（n=20）重度子癇前期（n=25）FP MTR1.00±0.331.18±0.341.72±0.172.58±0.1367.1＜0.000 1 E-Cadherin1.00±0.301.08±0.221.14±0.35 1.53±0.4113.28＜0.000 1 ZEB1 1.00±0.220.77±0.120.48±0.100.13±0.0665.41＜0.000 1

圖1 胎盤組織中MTR，E-Cadherin 和ZEB1 的蛋白表達(dá)變化

2.2 敲低MTR 表達(dá)對HTR8 細(xì)胞EMT 基因表達(dá)的影響 見表3。siRNA 可以顯著抑制HTR8 中MTR 基因mRNA 的表達(dá)，敲低MTR 基因后可顯著抑制上皮相關(guān)標(biāo)志物E-Cadherin 基因mRNA的表達(dá), 可以顯著促進(jìn)間充質(zhì)相關(guān)標(biāo)志物ZEB1基因mRNA 的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 敲減MTR 表達(dá)對HTR8 細(xì)胞的遷移及侵襲的影響 見圖2 及表4。敲減HTR8 細(xì)胞中MTR 基因可顯著促進(jìn)遷移能力，侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲減MTR 基因可促進(jìn)HTR8 細(xì)胞的侵襲能力，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表3 MTR 對E-Cadherin，ZEB1 表達(dá)的調(diào)控作用（x± s）

圖2 敲減MTR 對于滋養(yǎng)細(xì)胞遷移及侵襲的影響（標(biāo)尺=200μm）

表4 MTR 對HTR8 遷移及侵襲的調(diào)控作用（x± s 個(gè)/HP）

3 討論

許多研究均提示葉酸代謝關(guān)鍵基因MTR 與妊娠期高血壓疾病具有一定的關(guān)聯(lián)性，葉酸代謝異?？赡軈⑴c該疾病的發(fā)生[10]。SEREMAKMROZIKIEWICZ 等[10]人檢測子癇前期患者胎盤組織中葉酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況，包括亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）、甲硫氨酸合成酶、甲硫氨酸合成酶還原酶（methionine synthase reductase，MTRR）及胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine gamma-lyase，CSE），發(fā)現(xiàn)子癇前期患者胎盤組織中MTR 的表達(dá)顯著增加，MTRR 的表達(dá)顯著降低，MTHFR 沒有明顯變化，提示差異基因MTR 可能參與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生。SHIN 等[11]人進(jìn)一步研究相關(guān)基因于胎盤的定位，發(fā)現(xiàn)正常胎盤組織表達(dá)MTR 及MTHFR，MTR 主要表達(dá)于滋養(yǎng)層細(xì)胞，而MTHFR 主要表達(dá)于基膜的細(xì)胞團(tuán)簇中，在滋養(yǎng)層細(xì)胞中并無特異性表達(dá)。這些結(jié)果均提示MTR的特異性異常表達(dá)有可能參與滋養(yǎng)層細(xì)胞功能缺失，影響滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移及侵襲能力，導(dǎo)致胎盤淺著床。但SHIN 等[11]人發(fā)現(xiàn)MTR 的蛋白表達(dá)在對照組與妊娠期高血壓組（定義為孕20 周后收縮壓≥140mmHg 和/或舒張壓≥90mmHg）患者胎盤組織中的表達(dá)沒有顯著差異。鑒于妊娠期高血壓疾病是一組疾病，本研究分別統(tǒng)計(jì)了對照組、妊娠期高血壓組、子癇前期、重度子癇前期患者胎盤中的基因表達(dá)差異。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，MTR 及E-Cadherin mRNA 在對照組與妊娠期高血壓組間無顯著差異，但隨疾病進(jìn)展表達(dá)上升，重度子癇前期組胎盤中mRNA 及蛋白的表達(dá)量明顯上調(diào)，提示MTR 參與的葉酸代謝異?？赡軈⑴c妊娠期高血壓疾病發(fā)展過程中發(fā)揮一定的作用。另外，研究報(bào)道[12]葉酸代謝基因相關(guān)基因多態(tài)性與高血壓易感性相關(guān)，MTR 2756A＞G 具有作為高血壓相關(guān)生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值。MTR 2756A ＞G 還與高同型半胱氨酸血癥具有一定的相關(guān)性，可能參與高血壓的發(fā)生機(jī)制[13]。但是在妊娠期高血壓患者中，目前尚未找到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的MTR 基因多態(tài)性位點(diǎn)，比如MTR 2756A ＞G[14]，進(jìn)一步詳細(xì)的分層可能有助于發(fā)現(xiàn)更具有差異性的MTR 多態(tài)性位點(diǎn)。

在胎盤形成過程中，滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換是重要的環(huán)節(jié)之一。該過程中滋養(yǎng)細(xì)胞失去上皮表型，獲得遷移侵襲能力更強(qiáng)的間充質(zhì)表型，促進(jìn)子宮螺旋動脈的重塑，增加胎盤灌注，利于胚胎發(fā)育[15]。研究發(fā)現(xiàn)子癇前期胎盤組織中EMT 相關(guān)基因表達(dá)異常，上皮標(biāo)志物E-Cadherin 上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物ZEB1 下調(diào)，且阿斯匹林可通過miR-200/ZEB1 軸調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞功能[16-17]，提示滋養(yǎng)細(xì)胞EMT 過程的變化可能參與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生與進(jìn)展，同時(shí)也是潛在的防治靶點(diǎn)之一。本研究結(jié)果與之相符，發(fā)現(xiàn)隨著妊娠期高血壓疾病的進(jìn)展，胎盤組織中上皮標(biāo)志物E-Cadherin 的mRNA 及蛋白表達(dá)上調(diào)，胎盤組織中間充質(zhì)標(biāo)志物ZEB1 的mRNA 及蛋白表達(dá)下調(diào)，提示胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力減弱。通過轉(zhuǎn)染MTR-siRNA 發(fā)現(xiàn)，MTR 具有負(fù)向調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞EMT，遷移侵襲的能力，進(jìn)一步提示MTR 通過調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞EMT 過程參與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生，導(dǎo)致胎盤淺著床的發(fā)生。

MTR 是葉酸代謝的關(guān)鍵基因之一，同時(shí)參與甲硫氨酸以及S-腺苷甲硫氨酸的生成。我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)，孕期補(bǔ)充葉酸并不能降低發(fā)生子癇前期的危險(xiǎn)性，但是該研究可能受到樣本量等因素的影響[18]，增加樣本量或更為詳細(xì)地分層分析可能會得出更有差異的結(jié)果。目前尚無關(guān)于MTR 基因直接調(diào)控EMT 以及細(xì)胞侵襲、遷移能力的研究，本研究發(fā)現(xiàn)通過siRNA 敲低MTR 表達(dá)后可以促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移及侵襲能力，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MTR 可以調(diào)控EMT 相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)。MTR 調(diào)控細(xì)胞EMT過程及運(yùn)動能力的機(jī)制可能與葉酸代謝中間產(chǎn)物相關(guān)。MTR 的表達(dá)及活性增強(qiáng)將促進(jìn)甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的含量，參與疾病的發(fā)生。眾多研究發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸及SAM 具有抑制細(xì)胞遷移侵襲的能力。SAM 可通過miRNA-34c 和miRNA-449a 抑制三陰乳腺癌細(xì)胞的增殖及遷移能力[8]。在肝癌模型中，額外補(bǔ)充甲硫氨酸同樣可以發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞遷移侵襲的作用[7]。這些結(jié)果均提示葉酸代謝異常在細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中具有重要的作用，同時(shí)也是重要的治療靶點(diǎn)，后續(xù)的研究將進(jìn)一步挖掘葉酸代謝過程中相關(guān)代謝產(chǎn)物對于子癇前期發(fā)病的影響以及與妊娠期高血壓疾病的臨床相關(guān)性。另外高同型半胱氨酸血癥是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，研究發(fā)現(xiàn)葉酸代謝相關(guān)基因的甲基化程度與高同型半胱氨酸血癥具有一定的相關(guān)性，我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)MTHFR 位點(diǎn)TT 基因型與高同型半胱氨酸血癥具有相關(guān)性[19]，但尚未有MTR 位點(diǎn)SNP 與高同型半胱氨酸血癥、妊娠期高血壓疾病的相關(guān)性研究。而且隨著年齡增長MTR 基因啟動子區(qū)域的甲基化程度增加[20]。今后將會從多方面研究妊娠期高血壓疾病中葉酸代謝基因表達(dá)異常的分子機(jī)制（如甲基化異常，SNP），篩選與疾病進(jìn)展、預(yù)后相關(guān)的代謝物，改善該病的母嬰結(jié)局。