劉英華，王玉霞，盧海英，曾 娟，劉亞寧，高曉麗，王 靜

（華北石油管理局總醫(yī)院a.心內(nèi)科；b.功能科；c.檢驗科，河北任丘 062552）

急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）是指冠狀動脈不穩(wěn)定斑塊破裂并形成血栓，進而導致心肌急性缺血的臨床綜合征，是造成心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）患者死亡的重要原因[1]。心率變異性（heart rate variability，HRV）是反映調(diào)節(jié)心臟自主神經(jīng)功能的重要指標，研究發(fā)現(xiàn)，ACS 可導致患者心臟自主神經(jīng)功能紊亂，心血管事件發(fā)生率升高，預后變差[2]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是近些年的研究熱點，研究發(fā)現(xiàn)其與高血壓、冠心病及心臟衰竭有關(guān)[3-4]。LncRNA X 染色體失活特異轉(zhuǎn)錄物（LncRNA X inactivate-specific transcript，LncRNA XIST）是一種長17 kb 的LncRNA，其通過靶向相應(yīng)的微小RNA（microRNA，miRNA）來調(diào)節(jié)各種疾病的病理過程，包括心肌梗死[5]、動脈粥樣硬化[6]和癌癥[7]。miRNA 是一種高度保守的非編碼RNA，包含22 個左右的核苷酸，通過抑制mRNA 的翻譯或促進mRNA 的降解而作為基因表達的負調(diào)節(jié)因子[8]。微小RNA（miR）-330-3p 在非小細胞肺癌[9]、乳腺癌[10]中作為癌基因發(fā)揮作用，并與ACS 患者斑塊破裂有關(guān)[11]。有研究顯示，LncRNA XIST 與miR-330-3p 具有靶向關(guān)系，LncRNA XIST 通過與miR-330-3p 的相互結(jié)合促進星形膠質(zhì)源性蛋白（S100B）的表達，最終阻止小鼠心肌肥大[12]。因此，本研究通過檢測ACS 患者血清LncRNA XIST 和miR-330-3p 水平，分析其與心臟自主神經(jīng)功能的關(guān)系，以期為臨床防治ACS 患者發(fā)生心臟自主神經(jīng)功能障礙提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2020年2月～2021年6月在華北石油管理局總醫(yī)院診斷為ACS 的患者156例，包括不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina，UA）80 例（UA 組），其中男性45 例，女性35 例，年齡55 ～86（61.56±11.55）歲，平均收縮壓146.72±11.51mmHg，平均舒張壓95.43±10.13mmHg，平均體質(zhì)量指數(shù)（BMI）23.35±3.46kg/m2，平均總膽固醇（TC）4.58±0.78mmol/L，平均低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）2.86±0.83mmol/L，平均高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）2.76±0.44mmol/L；吸煙史9 例，飲酒史10 例，高血壓9 例，糖尿病10 例。急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）76 例（AMI 組），其中男性44 例，女性32 例，年齡52 ～83（60.53±11.39）歲，平均收縮壓145.35±11.46mmHg，平均舒張壓95.24±10.15mmHg，平均BMI 22.87±3.32kg/m2，平均TC 4.38±0.79 mmol/L，平均LDL-C 2.71±0.86 mmol/L，平均HDL-C 2.86±0.49 mmol/L；吸煙史10 例，飲酒史11 例，高血壓12 例，糖尿病13 例。另選取同期體檢健康者100 例作為對照組，男性55 例，女性45 例，年齡50 ～82（60.31±10.62）歲，平均收縮壓146.48±11.26 mmHg，平均舒張壓93.75±9.21 mmHg，平均BMI 23.42±3.15 kg/m2，平均TC 4.62±0.75mmol/L，平均LDL-C 2.68±0.85 mmol/L，平均HDL-C 2.74±0.48 mmol/L；吸煙史10 例，飲酒史12 例，高血壓10 例，糖尿病12 例。三組受試者上述資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過，受試者均簽署知情同意書。

納入標準：①所有ACS 患者均經(jīng)冠狀動脈造影證實，符合ACS 診斷標準[13]；②納入對象年齡＞50 歲；③既往無心律失常發(fā)病史；④有完整的臨床資料。排除標準：①并發(fā)肝、腎功能不全或衰竭者；②有系統(tǒng)性免疫缺陷癥的患者；③精神病患者；④其他原因引起的心絞痛或心肌病。

1.2 儀器與試劑 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀（型號7700 型，美國Applied biosygtems 公司）；動態(tài)心電圖檢測儀（型號TLC4000，秦皇島康泰醫(yī)學公司）；Trizol 試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量PCR 試劑盒（批號RP1579-11，RP1105-50T，RL6079-09，上海吉至生化科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：ACS 患者在入院后次日、對照組體檢時，清晨空腹經(jīng)肘靜脈抽取外周血5 ml，靜置30 min，室溫3 000 r/min，離心15 min，離心半徑15cm，吸取上清液分別裝入EP 管中，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 qRT-PCR 法檢測血清中LncRNA XIST 和miR-330-3p 水平：按照Trizol 法提取血清樣本中總RNA，分光光度計測總RNA 純度及濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照熒光定量PCR 試劑盒說明書進行qRT-PCR 反應(yīng)，LncRNA XIST（內(nèi)參GAPDH），miR-330-3p（內(nèi)參U6）引物序列見表1。引物由上海吉至生化科技有限公司合成。反應(yīng)條件為：95℃10 min；40 個PCR 循環(huán)（95 ℃ 10s，60 ℃ 60s，72℃15 s）。采用2-ΔΔCt方法計算血清中LncRNA XIST 和miR-330-3p 相對表達量。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.3 24 h 動態(tài)心電圖檢測：受試者均接受holter檢測，并進行HRV 時域分析，檢測參數(shù)包括24 h內(nèi)正常R-R 間期標準差（SDNN）、每5 min R-R間期平均值的標準差（SDANN）、每5 min R-R 間期標準差的平均值（SDNN index）、相鄰R-R 間期之差的均方根（RMSSD）及相鄰R-R 間期相差＞50 ms 心搏數(shù)占總心搏數(shù)的百分比（PNN50）。1.4 統(tǒng)計學分析 采用統(tǒng)計學軟件SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)分析，計量資料經(jīng)檢驗均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差（±s）描述，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料以[n（%）]描述，行卡方檢驗；采用Pearson 法分析ACS 患者血清LncRNA XIST，miR-330-3p 水平與HRV 時域指標的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清LncRNA XIST 和miR-330-3p 水平比較 見表2。與對照組比較，UA 組和AMI 組血清LncRNA XIST 水平升高（t=10.084，21.299，均P＜0.05），miR-330-3p 水平降低（t=12.787，30.011，均P＜0.05）；與UA 組比較，AMI 組血清LncRNA XIST 水平升高（t=10.792，P＜0.05），miR-330-3p 水平降低（t=16.538，P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。

表2 受試者血清LncRNA XIST 和miR-330-3p 水平比較（±s）

表2 受試者血清LncRNA XIST 和miR-330-3p 水平比較（±s）

項目對照組（n=100）UA 組（n=80）AMI 組（n=76）FP LncRNA XIST1.09±0.221.37±0.261.69±0.31113.5870.000 miR-330-3p1.03±0.180.82±0.150.53±0.12225.2010.000

2.2 HRV 時域指標水平比較 見表3。與對照組比較，UA 組和AMI 組SDANN，SDNN，SDNN index，RMSSD，PNN50 水平均降低（t=8.520，16.571；9.525，14.381；11.585，20.497；10.426，17.254；11.261，23.119，均P＜0.05）；與UA 組比 較，AMI 組SDANN，SDNN，SDNN index，RMSSD，PNN50 水平均降低（t=7.764，4.743，8.625，6.628，11.418，均P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。2.3 ACS 患者血清LncRNA XIST，miR-330-3p 水平與HRV 時域指標的相關(guān)性 見表4。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ACS 患者血清LncRNA XIST，miR-330-3p 水平與SDANN，SDNN 無相關(guān)性（均P＞0.05）；LncRNA XIST 與SDNN index，RMSSD，PNN50 呈負相關(guān)（均P＜0.05）；miR-330-3p 與SDNN index，RMSSD，PNN50 呈正相關(guān)（均P＜0.05）。

表3 受試者HRV 時域指標水平比較（±s）

表3 受試者HRV 時域指標水平比較（±s）

項目對照組（n=100）UA 組（n=80）AMI 組（n=76）FP SDANN（ms）133.43±21.01115.96±19.5798.96±16.5769.1380.000 SDNN（ms）136.41±31.53113.84±15.26101.84±11.2254.9230.000 SDNN index（ms）64.68±10.6454.68±6.7246.73±5.14107.1340.000 RMSSD（ms）36.48±8.6227.48±5.6221.37±3.64118.9280.000 PNN50（%）10.72±3.217.58±2.834.18±1.13134.0140.000

表4 ACS 患者血清LncRNA XIST，miR-330-3p水平與HRV 時域指標的相關(guān)性

3 討論

急性冠脈綜合征（ACS）屬于臨床常見嚴重型慢性靜脈功能不全（chronic venous disorder，CVD），也是最危險、最致命的冠心病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，在歐洲，CVD 每年造成超過400 萬人死亡，接近所有死亡的45%，其中冠心病占20%[14]。2015年，中國大陸地區(qū)冠心病死亡率約為110/10 萬，且逐年上升[15]。此外，ACS 還導致心臟自主神經(jīng)功能紊亂，表現(xiàn)為心臟交感神經(jīng)興奮增強，迷走神經(jīng)活動減少，造成交感神經(jīng)機制占優(yōu)勢和心電不穩(wěn)定，此類疾病往往導致心臟交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)不可逆的損傷。因此，探究ACS 患者心臟自主神經(jīng)功能及其影響因素，可能有助于防治ACS 患者心臟自主神經(jīng)功能失調(diào)。

長鏈非編碼RNA(LncRNA)在CVD 的病理生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。LncRNA 被定義為是超過200 個核苷酸的轉(zhuǎn)錄物，功能分析表明，LncRNA 可以在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達，或直接調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性。LncRNA XIST基因位于人染色體Xq13.2，與X染色體失活有關(guān)[16]。XIAO 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下小鼠心肌細胞中XIST 表達上調(diào)；沉默XIST 表達可提高細胞活力，抑制細胞凋亡，并通過降低凋亡相關(guān)蛋白水平抑制心肌梗死，提示XIST 參與了心肌梗死的發(fā)生，其水平的調(diào)節(jié)可作為心肌梗死治療的新策略或潛在靶點。ZHANG 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA XIST 通過調(diào)控多種miRNA 參與AMI 的進程中，如在AMI大鼠模型心臟組織中發(fā)現(xiàn)，LncRNA XIST 基因敲除可通過下調(diào)miR-449 水平抑制AMI 模型大鼠心肌細胞凋亡。缺氧損傷后大鼠心肌細胞中LncRNA XIST 過度表達，XIST 的沉默減輕了細胞損傷；XIST 的上調(diào)通過競爭性結(jié)合微小RNA（miR）-150-5p 促進B 細胞淋巴瘤2 相關(guān)X 蛋白的表達，可能作為AMI 治療的重要靶點[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMI 組血清LncRNA XIST 水平最高，其次為UA 組，對照組血清LncRNA XIST 水平最低，提示LncRNA XIST 升高可能參與ACS 發(fā)生。原因可能與LncRNA XIST 參與血管生成、斑塊形成及血管平滑肌細胞的凋亡等調(diào)節(jié)過程有關(guān)。

與LncRNAs 不同，miRNAs 是一個進化上保守的內(nèi)源性家族，可通過不完全互補性與mRNA 的3’非翻譯區(qū)結(jié)合，在血小板聚集、心臟損傷及內(nèi)皮細胞活化等多種病理過程中發(fā)揮重要作用[8]。研究顯示，低氧無血清培養(yǎng)的心肌細胞內(nèi)高表達的miR-330-3p 能抑制心肌細胞凋亡率，是抗心肌細胞凋亡的關(guān)鍵因子[20]。有研究通過高通量測序技術(shù)，篩查出miR-330-3p 在缺氧性人AC16 心肌細胞中表達上調(diào)，可能為在急性缺氧條件下靶向心肌細胞的新的診斷或治療策略上提供重要參考[21]。miR-330-3p在動脈粥樣硬化病變形成過程中起著關(guān)鍵性作用，LI 等[11]研究報道，血漿miR-330-3p 表達變化與斑塊破裂有一定關(guān)系，可作為區(qū)分ST 段抬高型心肌梗死患者斑塊表型的生物標志物。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組、UA 組和AMI 組血清miR-330-3p 水平依次降低，與LI 等[11]研究結(jié)果具有相似性，提示miR-330-3p降低可能與ACS發(fā)生及病情進展有關(guān)。相關(guān)研究顯示，LncRNA XIST 與miR-330-3p 具有靶向關(guān)系[12]，所以二者可能共同參與了ACS 的致病過程，但具體作用機制尚不明確，下一步需補充相關(guān)實驗繼續(xù)探討。

心率變異性(HRV)是公認的評價心臟自主神經(jīng)功能的非創(chuàng)傷性方法。SCOVELLE 等[22]在ACS 診斷后的12 個月時觀察HRV，發(fā)現(xiàn)HRV 有性別差異，女性HRV 較低，其心臟自主神經(jīng)功能也相對較差。高青豹等[23]研究顯示，ACS 患者HRV 各項指標均降低，與病情嚴重程度有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組、UA 組、AMI 組SDANN，SDNN，SDNN index，RMSSD，PNN50 水平依次降低，與高青豹等[23]的研究結(jié)果一致。此外，本研究經(jīng)Pearson分析發(fā)現(xiàn)，ACS 患者血清LncRNA XIST 與SDNN index，RMSSD，PNN50 呈負相關(guān)；miR-330-3p 與SDNN index，RMSSD，PNN50 呈正相關(guān)。提示LncRNA XIST，miR-330-3p 可能與ACS 患者心臟自主神經(jīng)功能有關(guān)，猜測可能是LncRNA XIST 水平升高后，抑制miR-330-3p 的表達，進而促進心肌細胞的凋亡，導致UA 或AMI 的發(fā)生。

綜上所述，ACS 患者血清LncRNA XIST 水平升高，miR-330-3p 水平降低，與心臟自主神經(jīng)功能有關(guān)，可能作為防治ACS 的重要靶點。本研究未分析ACS 患者炎癥因子與LncRNA XIST，miR-330-3p 的關(guān)系，可能對于ACS 的心臟自主神經(jīng)功能障礙的發(fā)生揭示不夠全面，有待后續(xù)深入研究。