馬 蓉，陳書強(qiáng)，雷 輝，金 妮，王曉紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安 710038)

低出生體重(low birth weight，LBW)是評(píng)價(jià)妊娠結(jié)局的一個(gè)重要指標(biāo)，LBW兒的患病率和死亡率較正常體重新生兒顯著升高，且其成年后患肥胖、糖尿病、高血壓等慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)也顯著增加[1-2]。輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)是當(dāng)前治療不孕癥的主要手段，越來(lái)越多的證據(jù)表明，通過(guò)ART受孕分娩的新生兒發(fā)生LBW的風(fēng)險(xiǎn)是自然受孕分娩新生兒的3倍[3-6]。與冷凍周期相比，新鮮周期LBW的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[6-7]。作為輔助生殖技術(shù)中的一個(gè)關(guān)鍵步驟，控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)應(yīng)用大劑量促性腺激素促進(jìn)多個(gè)卵子成熟，使母體處于非生理性的高雌激素狀態(tài)。研究表明，孕婦妊娠前三個(gè)月子宮暴露于高雌激素環(huán)境可能增加子代LBW的風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。然而，很少有研究探討高雌激素暴露導(dǎo)致低體重風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制。本研究通過(guò)建立動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)一步探究該因果關(guān)系。為了盡可能平衡混雜因素，我們采用外源性雌二醇(estradiol，E2)補(bǔ)充以建立高E2模型，使得兩組的唯一差異是妊娠早期的E2水平。本研究旨在建立小鼠模型以證實(shí)高雌激素暴露導(dǎo)致子代低體重的作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)8～10周齡、體重28～32g的健康雌性ICR小鼠，及8～10周齡、體重34～40g的雄性小鼠，購(gòu)于北京華阜康生物科技公司。②實(shí)驗(yàn)藥物：戊酸雌二醇(MCE HY-B0672)，使用時(shí)以玉米油(Glpbio GC32712)稀釋至使用濃度100μg·kg-1·d-1。③研究的主要試劑如下：放射免疫法雌激素檢測(cè)試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)，HE染色試劑盒(索萊寶 GII20)，PAS染色試劑盒(索萊寶 G1281)，RIPA中蛋白裂解液(碧云天)，BCA定量試劑盒(Thermo)，Luminex液相懸浮芯片檢測(cè)試劑盒(R&D Systems)。④主要儀器包括：電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、XH-6020全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀(北京華英生物技術(shù)研究所)、組織包埋中心(武漢塞維爾生物科技有限公司)、干烤箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)、懸液微珠芯片平臺(tái)Bio-Plex MAGPIX System(上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物造模

對(duì)購(gòu)入的ICR小鼠進(jìn)行1周適應(yīng)性喂養(yǎng)，選擇性成熟自然發(fā)情的雌鼠與正常雄鼠1：1合籠，次日上午8：00檢查雌鼠，見陰道栓者記為妊娠0.5天。按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對(duì)照組(NC組)和高雌激素組(EV100組)，每組7只。高雌激素組在見栓后第5.5～12.5天每日上午9：00給予口服溶于玉米油的17β-戊酸雌二醇(100μg·kg-1·d-1)，對(duì)照組給予相同體積的玉米油。

1.3觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

①于妊娠12.5天給藥后3小時(shí)，眼球取血收集小鼠外周血(高雌激素組和對(duì)照組小鼠各5只)，室溫靜置后3 000rpm離心10分鐘，3 000rcf離心10分鐘，取血清凍存于-80℃冰箱，通過(guò)放射免疫法測(cè)定小鼠血清雌激素水平，驗(yàn)證造模是否成功。②于妊娠14.5天解剖子宮(高雌激素組和對(duì)照組小鼠各7只)，分離出胎鼠、胎盤，電子天平稱重并記錄。③HE染色觀察胎盤形態(tài)：胎盤固定于4%多聚甲醛，常規(guī)脫水包埋，切片，60℃烤片2小時(shí)，常規(guī)脫蠟，蘇木素染核2分鐘，酸分化液分化后置伊紅染液染色后常規(guī)脫水、透明、封片。④PAS染色觀察胎盤形態(tài)：切片常規(guī)脫蠟，氧化劑室溫5分鐘，Schiff Reagent試劑室溫20分鐘，自來(lái)水沖洗10分鐘，蘇木素染核2分鐘，酸分化液分化后自來(lái)水沖洗10分鐘，常規(guī)脫水、透明、封片。⑤Luminex液相懸浮芯片技術(shù)檢測(cè)胎盤生長(zhǎng)相關(guān)細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)：組織樣本蛋白抽提(RIPA中裂解液)，BCA法蛋白定量(Thermol)，取200微克等質(zhì)量上樣檢測(cè)，經(jīng)過(guò)樣品孵育、孵育檢測(cè)抗體、顯色等步驟，送入已校正的Bio-Plex機(jī)器中讀值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品得到的熒光檢測(cè)值，使用多參數(shù)模式對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬和，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及其方程，濃度單位為pg/mL。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組小鼠雌激素水平的比較

EV100組小鼠血清中雌激素水平顯著高于NC組，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.698，P<0.01)，模型建立成功，見表1。

表1 兩組小鼠雌激素水平的比較

2.2兩組小鼠妊娠14.5天子代體重、胎盤重量和胎盤效率的比較

兩組小鼠的窩仔數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。EV100組小鼠的子代體重明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.932，P<0.05)；EV100組小鼠胎盤重量和胎盤效率(胎兒重量/胎盤重量)均明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別是2.639、2.336，P<0.05)，見表2。

表2 兩組小鼠妊娠14.5天子代體重、胎盤重量、胎盤效率比較

2.3兩組小鼠妊娠14.5天胎盤結(jié)構(gòu)比較

HE染色和PAS染色均顯示，妊娠14.5天EV100組小鼠胎盤迷路區(qū)占胎盤總面積的比例較NC組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別是3.819、4.800，P<0.05)，見表3和圖1。

表3 兩組小鼠妊娠14.5天胎盤結(jié)構(gòu)比較

(A)NC組HE染色；(B)EV100組HE染色；(C)NC組PAS染色；(D)EV100組PAS染色

2.4兩組小鼠妊娠14.5天胎盤相關(guān)細(xì)胞因子的比較

EV100組小鼠的胎盤基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin like growth factor-1，IGF-1)表達(dá)水平明顯比NC組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別是12.270、15.630，P<0.05)，見表4。

表4 兩組小鼠妊娠14.5天胎盤生長(zhǎng)相關(guān)細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的比較

3討論

3.1妊娠早期高雌激素暴露可導(dǎo)致子代出生體重降低

低出生體重被認(rèn)為是評(píng)估新生兒和嬰兒發(fā)病率和死亡率的重要指標(biāo)，研究表明低出生體重兒在以后的生活中發(fā)生胰島素抵抗、糖尿病、高血壓、心血管疾病等慢性疾病和某些癌癥的風(fēng)險(xiǎn)更高[10]。近年來(lái)，輔助生殖技術(shù)的快速發(fā)展給越來(lái)越多不孕癥患者帶來(lái)了福音，但其中控制性超促排卵這一關(guān)鍵步驟會(huì)使妊娠早期母體處于超生理性高雌激素狀態(tài)。既往研究表明，妊娠早期高雌激素環(huán)境與低出生體重的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[3-5]。本研究通過(guò)建立小鼠模型以進(jìn)一步探究妊娠早期高雌激素暴露導(dǎo)致子代低出生體重的發(fā)生機(jī)制。我們采用外源性E2補(bǔ)充來(lái)建立高E2模型，以盡可能平衡混雜因素，使得兩組之間的唯一差異是妊娠早期的雌激素水平。研究結(jié)果顯示，EV100組小鼠血清雌二醇濃度是對(duì)照組的4倍，EV100組小鼠子代體重顯著低于對(duì)照組，證實(shí)了出生體重的下降是由于胎兒暴露于超生理性的高雌激素環(huán)境所致。

3.2妊娠早期高雌激素暴露可導(dǎo)致胎盤重量和效率降低

胎盤在胎兒的生長(zhǎng)和發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，可合成一系列具有代謝和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，在母親和胎兒之間分配營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行氣體交換，清除代謝廢物，幫助調(diào)節(jié)妊娠進(jìn)程[11]。胎盤效率通常定義為出生體重與胎盤重量之比，即每克胎盤產(chǎn)生的胎兒克數(shù)。胎盤效率是衡量胎盤發(fā)育和胎盤功能，特別是衡量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)移到胎兒的替代指標(biāo)。胎盤測(cè)量和妊娠結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)已經(jīng)建立，研究表明較低的胎盤效率將導(dǎo)致新生兒低Apgar評(píng)分和出生后死亡風(fēng)險(xiǎn)增加，成年后疾病發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高等[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，EV100組小鼠的胎盤重量和胎盤效率均顯著低于對(duì)照組，即妊娠早期高雌激素暴露導(dǎo)致胎盤重量和胎盤效率降低。

3.3妊娠早期高雌激素暴露可影響胎盤形態(tài)結(jié)構(gòu)

胎盤是一種主要存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的器官，與母體組織直接接觸，將發(fā)育中的胎兒與母體子宮壁連接在一起，血液中循環(huán)的任何物質(zhì)都必須通過(guò)胎盤才能到達(dá)胎兒。雖然是短暫的，但胎盤與母體子宮有密切的接觸，并在營(yíng)養(yǎng)、氣體和廢物交換中發(fā)揮各種作用[13]。胚胎著床和蛻膜化后，胎盤發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵步驟是胎盤迷路區(qū)的形成。胎盤迷路區(qū)是位于胎盤胎兒一側(cè)的結(jié)構(gòu)，主要由滋養(yǎng)層細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞組成。滋養(yǎng)層細(xì)胞是著床后滋養(yǎng)外胚層的衍生物，而內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)自胚胎尿囊中胚層，這兩個(gè)并列的層為氣體、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、胚胎代謝最終產(chǎn)物和其他分子在胚胎和母體之間的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)提供了界面，因此其正確形成對(duì)胎兒的發(fā)育至關(guān)重要[14-15]。有研究表明，小鼠胎盤迷路區(qū)在母體和胎兒之間交換營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體，該胎盤區(qū)域結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其形成缺陷會(huì)影響物質(zhì)交換，從而影響胎兒的生長(zhǎng)和活力[16]。本研究通過(guò)HE染色及PAS染色對(duì)小鼠胎盤的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明妊娠早期高雌激素暴露導(dǎo)致小鼠胎盤迷路區(qū)面積占胎盤總面積的比例顯著減少。

3.4胎盤相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)降低可能是導(dǎo)致胎盤結(jié)構(gòu)改變及子代低出生體重的重要原因

本研究對(duì)小鼠胎盤功能檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，EV100組小鼠MMP-2、IGF-1的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低，這可能是妊娠早期高雌激素暴露導(dǎo)致小鼠胎盤結(jié)構(gòu)改變及子代低體重的重要原因。MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)締組織蛋白的一類蛋白酶，在正常和病理血管生成中發(fā)揮重要作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2在妊娠各階段均有表達(dá)，可在妊娠的重要階段發(fā)揮作用，包括滋養(yǎng)層侵襲、血管形成、著床和胎盤形成等[18]。MMP-2在人的月經(jīng)周期和動(dòng)物的發(fā)情周期及妊娠過(guò)程中參與子宮內(nèi)膜組織重塑。此外，MMPs還可影響子宮和血管功能以及平滑肌收縮機(jī)制[19]。免疫組化研究顯示，正常妊娠大鼠子宮、胎盤和主動(dòng)脈均有明顯的MMP-2染色，提示MMPs在子宮和血管重塑中發(fā)揮作用，而子宮MMPs表達(dá)的降低可能導(dǎo)致子宮收縮增加和早產(chǎn)[20]。然而，MMPs在組織重塑中的作用、受影響的下游靶點(diǎn)及其作用機(jī)制尚不清楚。

IGF-1在胚胎期和出生后均起著重要的作用，對(duì)正常胎兒和胎盤的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。在妊娠期間，胎盤是IGF-1的主要來(lái)源之一。宮內(nèi)生長(zhǎng)受限(intrauterine growth restriction，IUGR)定義為無(wú)法達(dá)到妊娠期預(yù)期體重,是圍產(chǎn)期發(fā)病率和死亡率較高的第二大常見原因。研究表明，IUGR嬰兒有胎盤功能障礙和低水平的IGF-1表達(dá)。這些數(shù)據(jù)提示，妊娠期IGF-1缺乏可能是胎兒發(fā)育遲緩的主要原因之一[21]。胎盤重量、迷路區(qū)面積、滋養(yǎng)層豐度、厚度和血管密度等都與妊娠后期母體IGF-1濃度直接相關(guān)；IGF-1并不直接參與胎盤的生長(zhǎng)，但可能在調(diào)節(jié)胎盤營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)能力的適應(yīng)中起關(guān)鍵作用，從而改變胎盤效率[22]。

綜上所述，妊娠早期母體暴露于高雌激素環(huán)境可導(dǎo)致小鼠胎盤結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，小鼠子代體重和胎盤重量顯著降低，而胎盤中MMP-2、IGF-1的表達(dá)水平顯著降低可能是其中的重要原因。