王 華 唐嘉鍵 申 玲 宋 燕

1廣州領(lǐng)晟醫(yī)療科技有限公司，廣州，510663;2清華大學藥學院，北京，100084

大皰性表皮松解癥(epidermolysis bullosa, EB)是一類由單基因變異所引起的常染色體遺傳性皮膚脆弱性疾病的統(tǒng)稱，在最新EB共識會議[1]中，明確EB共有16個編碼角蛋白中間絲、橋粒、半橋粒等組成細胞骨架以及胞間連接組分的基因突變均會引發(fā)EB，在臨床上和遺傳學上均具有高度異質(zhì)性。目前的發(fā)病率為41.3/106，患病率為22.4/106，在全球范圍內(nèi)約有50萬例患者[2，3]。EB的典型臨床表現(xiàn)為微小創(chuàng)傷后皮膚及黏膜處形成水皰、糜爛和瘢痕形成、皮膚創(chuàng)傷難以愈合等[3]。根據(jù)水皰在皮膚中的形成位置，EB可分成4種主要類型，分別為單純型EB(epidermolysis bullosa simplex，EBS，水皰位于表皮內(nèi))、交界型EB(junctional epidermolysis bullosa，JEB，水皰位于基底膜帶透明板)、營養(yǎng)不良型EB(dystrophic epidermolysis bullosa，DEB，水皰位于基底膜帶致密板下方)以及Kindler型EB(Kindler type epidermolysis bullosa，KEB，水皰位于多個皮膚層)[4]。在所有EB分類中EBS的患者數(shù)目占絕大部分，因此是需要重點關(guān)注的群體。本文將會針對EBS這一分型，對目前的臨床研究方向及其取得的新進展進行論述。

1 EBS簡介

EBS是EB分型當中最普遍的一種，發(fā)病率為17.5/106，患病率為11.5/106[3]，常見的臨床表現(xiàn)為在易受外傷或壓迫的手、足、肘及發(fā)生透亮、緊張的水皰或大皰，愈后無疤痕，黏膜及指甲很少累及。其遺傳學背景比較復(fù)雜，7種基因(KRT5, KRT14，PLEC，KLHL24，DST，EXPH5，CD151)的變異能夠?qū)е翬BS，其中最主要的是編碼角蛋白5及角蛋白14的KRT5、KRT14，以及編碼網(wǎng)蛋白的PLEC。

2 現(xiàn)有治療方法

EBS導(dǎo)致的臨床癥狀多為局部性，比其他分型輕微，但持續(xù)性長，需要謹慎處理。針對EBS尚無有效的療法，目前以防止感染及機械性損傷為主要治療目的，治療手段包括藥物治療和臨床護理。以下就一些常用治療藥物以及普適性高的護理原則進行展開。

2.1 藥物治療 對于EBS的治療是具有挑戰(zhàn)性的，過去推薦治療方法包括系統(tǒng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和(或)其他免疫抑制劑以抑制炎癥，但治療效果不佳，且長期用藥會引起代謝紊亂、骨質(zhì)疏松、高血壓等嚴重不良反應(yīng)[6,7]，鑒于上述不良發(fā)應(yīng)，目前外用強效糖皮質(zhì)激素作為針對EBS抑制炎癥的首選治療方法；使用含布洛芬、小劑量嗎啡的外用敷料能用于鎮(zhèn)痛，但要注意成癮性；對于傷口的繼發(fā)性感染以口服抗菌藥或使用含抗菌藥敷料進行治療[8]。

2.2 臨床護理 臨床護理相較于藥物治療更為重要，具體的標準需要按照患者的狀況而定，影響因素包括EB分型、年齡、病情進展、營養(yǎng)狀況、生活環(huán)境等，但一般而言主要針對患者的水皰、傷口進行處理，以達到緩解癥狀，降低感染風險的目的[9]。

2.2.1 水皰處理 對于水皰，在觀察到其出現(xiàn)的當下就應(yīng)立即清除，因為水皰越大意味著清理后出現(xiàn)的傷口越大，增加感染的風險。清除水皰時應(yīng)用無菌的針頭或潔凈的剪刀從水皰的最底部刺破，用潔凈紗布擠壓使膿液流干，盡量保持水皰頂部完整以保護傷口，否則應(yīng)將傷口周圍的死皮及殘骸完整清理[8]。

2.2.2 傷口處理 主要針對慢性傷口，如難愈合傷口、致痛傷口、流膿傷口、腐敗傷口等。對于上述傷口應(yīng)按照情況選用合適敷料，如含聚氨酯泡沫塑料、醫(yī)療用蜂蜜等的敷料能有助傷口愈合；局部性凝膠狀敷料、蛆治療法能處理腐敗傷口。使用敷料前需徹底清潔雙手以避免傷口感染[10,11]。

3 治療研究進展

3.1 對癥療法 由于EBS發(fā)病機制的多樣性及復(fù)雜性，目前尚未有能夠減緩疾病進程，從根源上治療EBS的有效手段出現(xiàn)。對癥療法能夠減輕患者的癥狀，改善患者生活質(zhì)量，因此是現(xiàn)時臨床需求大、亟待取得進展的研究方向之一[12]。見表1。

表1 EBS臨床治療進展

3.1.1 抗炎及創(chuàng)傷修復(fù)治療

3.1.1.1 Oleogel-S10 Oleogel-S10由Amryt Pharma研發(fā)，是一種促進傷口愈合的凝膠，含有樺樹皮干提取物，其中的主要活性成分為樺木醇[13]。在2016年獲歐盟批準上市，用于治療成人局部深度創(chuàng)傷。通過對其EB治療作用機理的研究，發(fā)現(xiàn)其在用藥的初期階段能從RNA水平上調(diào)控一系列炎癥因子，進而引發(fā)次級抗炎反應(yīng)。中期階段促進傷口處角質(zhì)形成細胞遷移以及細胞骨架結(jié)構(gòu)形成以修復(fù)缺陷。后期階段促進角質(zhì)形成細胞分化，從而促進上皮各結(jié)構(gòu)的再生[13]。Oleogel-S10針對DEB在德國完成一項非盲的II期有效性試驗，結(jié)果表明與僅使用敷料的標準創(chuàng)面護理相比，使用Oleogel-S10聯(lián)合敷料治療創(chuàng)面具有更快愈合的趨勢[14]。目前正在全球多國開展一項隨機、雙盲、安慰劑對照的III期臨床試驗(預(yù)計n=250, NCT03068780)，計劃入組兒童受試者，暫無最新研究結(jié)果。

3.1.1.2 雙醋瑞因/AC-203 雙醋瑞因是炎癥因子白細胞介素-1β(IL-1β)的拮抗劑，作用機制為雙醋瑞因在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性代謝物大黃酸下調(diào)IL-1β信號級聯(lián)，從而減少IL-1β的產(chǎn)生及活性[15]。其作為口服骨關(guān)節(jié)炎藥物早在1985年于意大利上市。后來在對EBS致病機制的研究中發(fā)現(xiàn)KRT14基因的過表達會引起IL-1β及其下游JNK通路的正反饋循環(huán)，引起研究者關(guān)注雙醋瑞因?qū)κ婢廍BS引起炎癥的療效[16]。臺灣TWIB公司研發(fā)的產(chǎn)品AC203為雙醋瑞因的局部軟膏制劑，目前在歐洲，美國和臺灣都已經(jīng)開展了EB相關(guān)的臨床研究來證明AC203的有效性和安全性，旨在說明該產(chǎn)品能夠降低EBS患者的臨床嚴重性和水皰的形成[15,17,18]。

3.1.1.3 BPM31510 BPM31510由Berg研發(fā)，是一種含輔酶Q10的軟膏，輔酶Q10被指能夠增加結(jié)構(gòu)蛋白如角蛋白13、14、17、網(wǎng)蛋白、膠原等的表達，促進傷口愈合及抗炎，但其機制目前尚未明確[19,20]。BPM31510目前已完成一項采用患者的初期試驗(n=4)，經(jīng)8周治療后初步驗證了患者體內(nèi)炎癥細胞有所減少，膠原束增厚[19]。于2019年在美國完成一項非盲I期試驗(n=11, NCT02793960)，暫無結(jié)果釋出。

3.1.1.4 西羅莫司 西羅莫司是一種免疫抑制劑，2001年在美國、歐洲等地獲批上市，用以治療淋巴管平滑肌瘤病，研究發(fā)現(xiàn)西羅莫司同時能夠調(diào)控特定角蛋白的翻譯，因此被斯坦福大學團隊用于治療EBS的試驗當中。在美國一項隨機、雙盲、安慰劑對照的II期試驗(n=8, NCT02960997)當中用于研究其對EBS患者掌拓角化癥的治療效果，階段性結(jié)果顯示部分患者使用西羅莫司后感覺到瘙癢、疼痛等癥狀的緩解，以及角化層厚度減少，但與對照組數(shù)據(jù)無明顯統(tǒng)計學差異[20]。

3.1.1.5 花椰菜芽萃取物(BSE) BSE當中的活性成分為蘿卜硫素，在Kerns等[21]的動物模型試驗中已證明其能夠促進傷口愈合相關(guān)的角蛋白16、17在表皮基底膜的表達，而對EBS中缺陷的角蛋白14、5的表達不會增加。據(jù)此2016年一項隨機、安慰劑對照的I期臨床試驗開展(n=5，NCT02592954)，結(jié)果顯示KRT16 mRNA水平有至少4倍的增長，而KRT6、KRT5及KRT14 mRNA水平無統(tǒng)計學差異[22]。因此BSE有望在促進EBS患者傷口愈合上取得治療效果。

3.1.2 止癢治療 在EB的臨床表現(xiàn)當中，慢性瘙癢亦會對患者造成巨大困擾。瘙癢程度取決于傷口位置及其嚴重性，而且會受更換敷料、沐浴等日?；顒佑绊懚鴲夯?，對患處搔抓更會使發(fā)炎及皮膚受傷程度加重，造成惡性循環(huán)[23,24]。針對體內(nèi)傳遞疼痛及瘙癢訊號通路上的靶點NK1R，由斯坦福大學團隊開發(fā)的新型NK1R拮抗劑司洛匹坦有著治療慢性瘙癢的潛力。一項在美國開展的隨機、安慰劑對照的II期初步試驗(n=14)中，司洛匹坦片劑的安全性得到驗證，43%患者在11分的瘙癢程度數(shù)字評分量表中較基線減少了3分，高于安慰組的14%，但就平均值而言偏差只有0.64分，不具有顯著統(tǒng)計學差異，而次要終點亦未能達到[24]。后續(xù)試驗(預(yù)計n=40，NCT03836001)目前招募中。

3.1.3 止汗治療 目前對EBS患者的臨床觀察顯示出其病情在夏季時嚴重程度增加，推測主要原因在于發(fā)汗引致傷口惡化[25]。A類肉毒桿菌毒素(BoNT-A)是一種由肉毒桿菌所產(chǎn)生的神經(jīng)毒素，通過抑制多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放能引致局部弛緩性肌肉麻痹，目前已被廣泛用于醫(yī)學美容以及神經(jīng)疾病學領(lǐng)域中。其止汗作用亦被研究所驗證，因此適用于各類皮膚疾病的治療當中。Abitol等[26]在2009年對一例局部性EBS患者的單足使用100U BoNT-A的注射治療，3個月后觀察到治療處水皰形成數(shù)量顯著減少。基于上述結(jié)果2018年一項隨機、雙盲、安慰劑對照的II/III期試驗在法國開展(預(yù)計n=25，NCT03453632)，以驗證BoNT-A在治療EBS患者足底病變的效用。

3.2 細胞治療 細胞療法的主要形式為干細胞直接移植，適用于全身性起皰、癥狀較嚴重的EB分型，如JEB及DEB[27]。EBS中僅有嚴重型EBS屬于全身性起皰，因此目前細胞治療的臨床進展主要集中在JEB及DEB上，多個相關(guān)項目進展至II期。以下僅針對EBS相關(guān)研究展開。

3.2.1 間充質(zhì)干細胞(MSC) MSC來源于骨髓、骨骼、脂肪等組織中，其一分化方向為皮層基質(zhì)細胞，能夠表達EB相關(guān)蛋白如膠原、層黏連蛋白、整合蛋白、角蛋白等，因此干細胞移植療法理論上適用于大部分EB分型的治療[28]。2015年一項由明尼蘇達大學癌癥中心負責的單中心II期臨床試驗在美國開展(預(yù)計n=84，NCT02582775)，以研究EB患者接受異體MSC移植后的生存率以及EB相關(guān)蛋白的表達情況。

3.2.2 誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC) iPSC是一種由終末分化的體細胞通過基因編輯技術(shù)導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子所重編程而成的多能干細胞，具有類似胚胎干細胞分化成各類細胞的能力[29]。Bchetnia等[30]的研究當中從一例嚴重型EBS病人的皮膚活組織中分離出成纖維細胞，通過非整合性仙臺病毒將其成功轉(zhuǎn)化為iPSC，無論是基因完整性、胚層分化及支原體污染均處于理想水平。

3.3 基因治療 EB屬于單基因變異的遺傳性皮膚疾病，因此基因治療是目前最有望治愈EB的療法。針對不同目標基因有多種療法正在進行開發(fā)，針對JEB、DEB的研究有多項進展至II期。而對于EBS的目標基因KRT5，KRT14及PLEC，目前在研的療法均處于臨床前研究階段[29,31]。以下就EBS相關(guān)研究進行展開。

3.3.1 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs) TALENs是一種新型基因編輯核酸酶，通過設(shè)計能夠特異性識別及結(jié)合目標DNA序列并導(dǎo)入新的遺傳物質(zhì)[32]。Aushev等[33]將TALEN轉(zhuǎn)染至從健康人以及EBS患者分離的角質(zhì)形成細胞中對KRT5等位基因進行破壞，通過篩選及分析表明TALEN的轉(zhuǎn)染效率及特異性高，能實現(xiàn)無偏差單等位基因破壞，且編輯后患者細胞中沒有變異角蛋白聚集，中間絲穩(wěn)定性提高。

3.3.2 CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9同樣是被廣泛使用以修改基因變異的基因組編輯技術(shù)，通過設(shè)計與目標基因互補的單導(dǎo)RNA(sgRNA)序列從而實現(xiàn)特異性靶向[34]。Kocher等[35]利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向嚴重型EBS患者角質(zhì)形成細胞中KRT14基因，修復(fù)造成嚴重型EBS的變異位點。通過分析確認變異角蛋白聚集消失，且沒有發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)。

3.3.3 剪接體介導(dǎo)RNA反式剪切(SMaRT) SMaRT主要利用細胞內(nèi)源性的剪接體，通過RNA反式剪切分子(RTM)的交付，實現(xiàn)不同pre-mRNA外顯子的拼接[36]。Peking等[37]靶向EBS角質(zhì)形成細胞KRT14 pre-mRNA上的變異位點，利用特異性RTM進行修飾，再加入經(jīng)設(shè)計的反義寡核苷酸ASO7作為剪切調(diào)節(jié)因子，使反式剪切效能提高至30.15%。

3.3.4 短干擾RNA(siRNA) siRNA主要通過特異性識別并結(jié)合至目標基因的RNA轉(zhuǎn)錄上，從而干擾RNA的翻譯[38]。目前siRNA技術(shù)在EB中實踐的主要障礙是缺乏合適的siRNA皮膚遞送系統(tǒng)。Ahern等[39]認為理想的遞送系統(tǒng)為具備親脂性、結(jié)構(gòu)靈活性及穩(wěn)定性的高度分支陽離子聚合物，以保證siRNA治療的安全性及有效性。目前其通過共軛效應(yīng)成功將siRNA封裝到類脂納米顆粒當中，原始數(shù)據(jù)表明其能安全有效地敲除目標基因。

4 小結(jié)

對于EB患者，臨床需求上優(yōu)先度最高的是能夠緩解臨床癥狀的對癥療法，Oleogel-s10為已上市藥物，作為外用制劑治療創(chuàng)傷及燒傷的安全性及有效性已被驗證。針對EBS患者的臨床試驗中未更改劑型，且目前進展最快，在已完成的臨床試驗當中對EBS患者未造成嚴重不良反應(yīng)，達到主要終點，因此有望在短期內(nèi)推出市場。AC-203的活性成分雙醋瑞因作為上市藥物其口服抗炎效用及安全性已得到確證，但AC-203的有效性在目前試驗中暫未得到展現(xiàn)，可能原因在于給藥系統(tǒng)及藥物作用部位的不同導(dǎo)致藥物釋放率、代謝活性等性質(zhì)發(fā)生改變，對劑型或給藥劑量進行優(yōu)化有望令有效性更為明確。BPM31510、西羅莫司及BSE主要機理均為增加非變異角蛋白的表達，但針對EBS的試驗?zāi)壳叭蕴幱谂R床初期階段，結(jié)果中未能顯示出顯著改善患者癥狀的效果，且非變異角蛋白的增加與傷口愈合間的關(guān)系在臨床中亦尚未得到體現(xiàn)，目前對三者均抱持觀望態(tài)度。司洛匹坦主要針對EBS患者的瘙癢癥狀，在已完成試驗中未有顯著有效性的體現(xiàn)，但針對瘙癢的治療現(xiàn)時在研藥物較少，因此司洛匹坦或其他同靶點藥物的研發(fā)具有市場價值。BoNT-A目前試驗樣本量少，但在皮膚疾病治療中的適應(yīng)癥廣，具有治療EB的潛力。

與對癥治療藥物相比，EBS患者進行細胞治療的迫切性及必要性不高，EBS細胞治療的臨床試驗僅有少部分已完成，且無相關(guān)結(jié)果釋出。從其中一項被中止的試驗中公開的數(shù)據(jù)(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/results/NCT00478244?term=cell&cond=Epidermolysis+Bullosa&draw=2&rank=4)顯示異體MSC的移植有機會產(chǎn)生抗宿主排斥反應(yīng)，且試驗過程中有多例涉及病原體感染的嚴重不良反應(yīng)。鑒于未明確的效用及治療風險，目前細胞治療的前景尚未明朗，需要對目前療法的適用性和安全性再作審視和優(yōu)化，并期待更多試驗結(jié)果的釋出。

基因療法從理論上能夠根治EBS，但其對于EBS的療效目前只在細胞水平上得到驗證，短期內(nèi)能夠走向臨床乃至得到實際應(yīng)用的機會不大。此外，基因治療目前仍是一種新興的高端療法，治療費用高昂，如SMaRT, siRNA等RNA編輯療法更需要長期治療，對于大多數(shù)EBS患者而言難以負擔，實際的需求亦不大。但對于嚴重型EBS、JEB以及DEB患者而言，這仍是一項有價值的療法，為此，仍需要在基因治療的研發(fā)上作更多的投入。綜上所述，針對EBS的治療目前在多個領(lǐng)域上均已取得顯著性進展，臨床護理的不斷完善能夠大為改善患者的生活質(zhì)量，而患者迫切需要的對癥治療藥物在研品種多，進展快，有望于數(shù)年內(nèi)進入市場。但根治性的或針對嚴重性EBS的治療方案目前大部分仍然處于臨床前研究階段，以及一些問題如安全性、基因-表型聯(lián)系、藥物作用機制等尚需更多研究探索，因此在EBS治療的未來發(fā)展上探索更多有效的治療方案是一個重要的方向。