張 平 王 靜 王穎超 倪 莉 李明明 黨寧寧

1山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院，濟南，250012；2山東大學(xué)附屬濟南市中心醫(yī)院，濟南，250013；3濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，濱州，256600；4山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟南，250021

黑素瘤源于黑素細胞的惡性轉(zhuǎn)化，是成人中第五種最常見的癌癥，也是惡性程度最高的皮膚癌[1]。黑素瘤的發(fā)病率具有明顯的種族差異性，發(fā)病率在淺膚色人群中最高，黃種人和黑種人中較低[2]。但統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，近年來黑素瘤的發(fā)病率一直以6%～7%的年增長率持續(xù)上升[3]，引起大家的廣泛關(guān)注。目前對于發(fā)現(xiàn)的早期黑素瘤可以通過手術(shù)切除，但晚期的通常無法治愈[4]。對于Ⅲ期和Ⅳ期的黑素瘤患者通常采取手術(shù)切除、放化療和免疫治療等聯(lián)合治療的方式，但最終的治療效果并不理想，預(yù)后差。因此，尋找新的治療藥物是臨床醫(yī)生迫切需要解決的問題。依巴斯汀(Ebastine)是使用最廣泛的第二代組胺H1受體拮抗劑，對組胺及其他類型炎癥介質(zhì)的釋放有一定的抑制作用，主要用于治療變應(yīng)性疾病，包括支氣管痙攣，過敏性鼻炎和皮膚瘙癢癥等[5-7]，特別是與中草藥聯(lián)合后對慢性蕁麻疹進行治療，獲得滿意的效果[8]。有研究表明，依巴斯汀還可以有效抑制多種癌細胞的增殖、遷移等生物學(xué)行為，顯著降低死亡率，有效逆轉(zhuǎn)乳腺癌、非小細胞肺癌等多種腫瘤的多重耐藥[9，10],但在黑素瘤中的作用尚未見相關(guān)報道。自噬是一種高度保守的溶酶體降解途徑，在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下降解自身物質(zhì)和受損細胞器，實現(xiàn)胞內(nèi)物質(zhì)的自我更新和再利用。目前研究發(fā)現(xiàn)，自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[11]。自噬在黑素瘤的發(fā)生中起著雙重作用,在黑素瘤發(fā)生的早期，自噬通過誘導(dǎo)細胞衰老而抑制腫瘤的發(fā)生；在黑素瘤晚期階段，自噬活性增強為腫瘤的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)和有利的生存環(huán)境[12]。本研究旨在通過觀察依巴斯汀對人黑素瘤細胞A375和M14自噬的誘導(dǎo)作用以及對于AKT/mTOR信號通路的影響，為以后探索依巴斯汀的抗癌作用提供更多的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 A375細胞和M14細胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細胞庫)；依巴斯汀(Ebastine)、3-MA(純度>99%，Selleck公司)；DMEM培養(yǎng)基，PBS,青鏈霉素混合液，胰蛋白酶-EDTA消化酶(凱基生物)；轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000、細胞計數(shù)板(賽默飛Invitrogen)；mCherrry-EGFP-LC3B雙熒光質(zhì)粒(淼靈質(zhì)粒平臺)；胎牛血清(Gibco); RIPA裂解液(SparkJade)；CCK-8試劑、GAPDH、P62、Beclin1、AKT、mTOR抗體(PTG公司)；LC3B、p-AKT、p-mTOR抗體(CST公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物配制 依巴斯汀用無水乙醇溶解成10 mM母液-80℃儲存，用DMEM培養(yǎng)液(不含血清和抗生素)配制成所需濃度，50℃水浴鍋中溶解。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將人惡性黑素瘤細胞A375和M14接種于完全DMEM培養(yǎng)基中(10%胎牛血清，100 U/L青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，在37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選擇對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.3 細胞增殖實驗 選取對數(shù)生長期的細胞進行處理，PBS清洗兩遍，用含EDTA的0.25%的胰蛋白酶處理，待細胞消化充分，鏡下觀察，細胞形態(tài)變圓后棄掉胰酶，用2 mL培養(yǎng)液進行重懸，利用細胞計數(shù)儀計數(shù)，取5×104/mL細胞接種于96孔板。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，棄掉原培養(yǎng)基，對照組加入完全DMEM培養(yǎng)基，實驗組分別加入含0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50 μmol/L依巴斯汀的培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 每孔加入10 μL CCK-8溶液。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀測定450 nm處的光密度(OD)，根據(jù)公式細胞活力(%)=(實驗組OD-調(diào)零組OD)/(對照組OD-調(diào)零組OD)×100%，計算依巴斯汀對黑素瘤細胞A375和M14的半數(shù)抑制濃度IC50。同上方法鋪好96孔板后，對照組加入完全DEME培養(yǎng)基，實驗組加入合適濃度的依巴斯汀，分別在0、24、48、72 h測定450 nm處吸光值，繪制生長曲線，觀察依巴斯汀對細胞活力的影響。

1.2.4 mCherry-EGFP-LC3B雙熒光質(zhì)粒檢測人黑素瘤細胞自噬流 在6孔板中先鋪好玻片，將細胞以培養(yǎng)過夜后密度達到60%的標準接種于6孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，用Lipo2000轉(zhuǎn)染mCherry-EGFP-LC3B雙熒光質(zhì)粒(質(zhì)粒∶脂質(zhì)體=1∶2)。轉(zhuǎn)染24 h后，進行加藥處理，設(shè)置對照組：依巴斯汀(0 μmol/L)；依巴斯汀組：4 μmol/L；3-MA組：(5 mmol/L)3-MA;依巴斯汀+3-MA組：依巴斯汀(4 μmol/L)+3-MA(5 mmol/L),培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。PBS清洗3遍后，甲醛固定液固定20 min，再次PBS清洗3次, 5 min/次，用鑷子取出玻片后反扣在滴加了防淬滅劑的載玻片上，封片，使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光斑點數(shù)量。

1.2.5 Western blot檢測自噬相關(guān)及AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白 選取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜。按照1.2.4分為對照組/依巴斯汀組/3-MA組/依巴斯汀+3-MA組進行加藥，處理24 h后提取蛋白。另外，設(shè)置0、2、4 μmol/L的依巴斯汀對黑素瘤細胞進行處理24 h后收取蛋白，用于驗證通路蛋白的表達。PBS清洗3次后，每孔加入300 μL RIPA裂解液(+蛋白酶抑制劑)，冰上裂解5 min，混勻儀20 min，4℃離心機12000 r/min，10 min后吸取上清液，與Loading buffer(4×)按比例混合，100℃變性后通過SDS-PAGE電泳分離。將分離的蛋白質(zhì)在110 V，90 min的轉(zhuǎn)膜條件下轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗膜后在相應(yīng)一抗孵育液中4℃過夜，次日拿出復(fù)溫1 h，TBST清洗3次后，以1∶4000的比例孵育相應(yīng)的二抗，室溫1 h,再次用TBST清洗3次，5 min/次。洗膜后使用化學(xué)發(fā)光液進行顯影，利用 Image J軟件分析各條帶的灰度值，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗數(shù)據(jù)均是重復(fù)3次后統(tǒng)計所得，Western blot采用Image J掃描灰度并統(tǒng)計所得，以(x±s)表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 依巴斯汀在人黑素瘤細胞A375和M14中IC50的測定 CCK-8細胞增殖實驗結(jié)果顯示：依巴斯汀對黑素瘤細胞A375和M14的抑制呈劑量依賴性。隨著依巴斯汀藥物濃度的增加，與對照組相比較，黑素瘤細胞活力明顯降低。在A375和M14細胞中依巴斯汀的IC50根據(jù)公式計算可得分別是3.353 μmol/L和3.785 μmol/L(圖1)。本研究選取2.0 μmol/L和4.0 μmol/L依巴斯汀開展后續(xù)實驗。

圖1 CCK-8法測定依巴斯汀在人黑素瘤細胞中的半數(shù)抑制濃度IC50

2.2 依巴斯汀對人黑素瘤細胞A375和M14活力的影響 CCK-8實驗結(jié)果顯示：與對照組相比，當(dāng)人黑素瘤細胞經(jīng)過2 μM依巴斯汀處理后，其OD值明顯降低，提示依巴斯汀可以顯著降低人黑素瘤細胞的活力(圖2)。

圖2 CCK-8法測定依巴斯汀對人黑素瘤細胞活力的影響(與對照組比較：* P<0.05)

2.3 依巴斯汀對人黑素瘤細胞自噬流的影響 在自噬早期，mCherry-EGFP-LC3B融合蛋白從胞質(zhì)聚集至自噬小體的膜結(jié)構(gòu)上，呈現(xiàn)明亮的黃色斑點，一個黃色斑點代表一個自噬小體；然后，自噬小體和溶酶體發(fā)生融合，PH值降低，綠色熒光蛋白在低PH環(huán)境下發(fā)生淬滅，而紅色的熒光蛋白則可以耐受酸性環(huán)境，不會發(fā)生降解，此時的紅色斑點即可代表自噬溶酶體的數(shù)量。3-MA(3-甲基腺嘌呤)是一種選擇性PI3K抑制劑，作用于Vps34和PI3Kγ，阻斷自噬小體與溶酶體的結(jié)合，抑制自噬溶酶體的形成[13]。mCherry-EGFP-LC3B熒光結(jié)果顯示：與對照組相比，依巴斯汀組黃色熒光斑點和紅色熒光斑點均明顯增多即自噬小體和自噬溶酶體的數(shù)量均顯著增加(P<0.05)，3-MA組和依巴斯汀+3-MA組變化不明顯；與依巴斯汀組相比，3-MA組和依巴斯汀+3-MA組自噬小體和自噬溶酶體數(shù)量明顯減少(P<0.05)(圖3)。

圖3 mCherry-EGFP-LC3B檢測依巴斯汀對人黑素瘤細胞自噬流的影響(與對照組比較：**P<0.01;與依巴斯汀組比較：# P<0.05; ## P<0.01)

2.4 依巴斯汀對人黑素瘤細胞自噬相關(guān)蛋白的影響 相比于對照組，依巴斯汀組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加(P<0.05)，表示LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化增多，Beclin1表達也相應(yīng)升高(P<0.05)，提示細胞的自噬現(xiàn)象增強。與依巴斯汀組相比，在自噬抑制劑3-MA的作用下，黑素瘤細胞自噬溶酶體的融合階段受到阻滯，3-MA組和依巴斯汀+3-MA組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低(P<0.05)，同時Beclin1的表達也相應(yīng)減少(P<0.05)(圖4)。

圖4 Western blot檢測依巴斯汀對人黑素瘤細胞自噬相關(guān)蛋白的影響(與對照組比較：* P<0.05;與依巴斯汀組比較：# P<0.05; ## P<0.01; ### P<0.001)

2.5 依巴斯汀對AKT/mTOR通路蛋白的影響 在不同濃度依巴斯汀的處理下，隨著藥物濃度的升高，與對照組相比，2.0、4.0 μmol/L的依巴斯汀p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR顯著降低(P<0.05)(圖5)。

圖5 Western blot檢測依巴斯汀對人黑素瘤細胞AKT/mTOR信號通路蛋白的影響(與0 μmol/L比較，p-AKT/AKT：* P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; p-mTOR/mTOR：# P<0.05; ## P<0.01; ### P<0.001)

3 討論

臨床上，早期黑素瘤尚可通過手術(shù)切除獲得較好的治療效果，但晚期黑素瘤患者即使通過放化療等手段也難以獲得理想的治療效果。有研究表明，依巴斯汀可以通過靶向EZH2的啟動子抑制其表達，在體內(nèi)和體外有效抑制腫瘤的生長和發(fā)展[14],依巴斯汀還可以通過破壞溶酶體膜的穩(wěn)定性從而誘導(dǎo)肺癌細胞的死亡[10]。

自噬是真核生物中一種高度保守的自我降解的過程，是程序性死亡的一種方式。通過捕獲、降解和回收溶酶體中的細胞內(nèi)蛋白和細胞器，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要作用[15，16]。已有大量研究證明，自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有著十分重要的作用[16，17]。常用的研究自噬的方法包括透射電鏡法、熒光質(zhì)粒示蹤法、組織蛋白酶Cathepsin活力檢測等[18]。本研究采用mCherry-EGFP-LC3B雙熒光質(zhì)粒檢測黑素瘤的自噬流水平,激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示：依巴斯汀顯著增加了自噬小體和自噬溶酶體的累積，使用自噬抑制劑3-MA后，自噬小體和自噬溶酶體的數(shù)量均明顯減少，提示依巴斯汀誘導(dǎo)人黑素瘤細胞A375和M14發(fā)生自噬。LC3B是目前公認的自噬特異性標志物，LC3-I是一種在正常生理條件下表達的可溶性細胞質(zhì)蛋白，當(dāng)細胞啟動自噬時，LC3-I通過泛素樣修飾過程與磷脂酰乙醇胺PE相互作用，轉(zhuǎn)化為LC3-II膜蛋白。目前多用LC3-II/I比值的大小評估發(fā)生自噬的程度[19]。Beclin1是自噬發(fā)生過程中的重要分子，有文獻報道，在黑素瘤細胞自噬過程中，Beclin1在促進自噬小體的形成中起著重要作用[20]。本研究通過Western blot結(jié)果分析可得，依巴斯汀誘導(dǎo)LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化增多，同時上調(diào)Beclin1的表達；加入自噬抑制劑3-MA后，自噬過程受阻，LC3-II/I比值降低，表明依巴斯汀誘導(dǎo)黑素瘤細胞自噬的發(fā)生。

關(guān)于自噬信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路研究較多的是AKT/mTOR[21，22]、P53和ROS[23]等信號通路，有大量資料顯示，AKT/mTOR通路在多種腫瘤的自噬過程中起著關(guān)鍵的作用，在黑素瘤中也有相關(guān)報道[24]。Western blot結(jié)果表明，依巴斯汀使p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR顯著降低，提示依巴斯汀顯著抑制AKT/mTOR信號通路的激活。

已有大量研究表明，依巴斯汀可以通過不同的作用方式對腫瘤細胞產(chǎn)生抑制作用，但在黑素瘤中是否有效尚未見相關(guān)報道。本研究使用不同濃度的依巴斯汀對人黑素瘤細胞進行處理，實驗結(jié)果提示，依巴斯汀可以通過抑制AKT/mTOR通路的活化而誘導(dǎo)人黑素瘤細胞自噬的發(fā)生，降低細胞活力，進而發(fā)揮抑癌的作用。但依巴斯汀如何通過調(diào)控黑素瘤細胞發(fā)生自噬而抑制腫瘤的發(fā)生還有待更進一步的研究。