徐 亮，陳秀秀，徐 劍，甘惠玲，蔣鴻濤

（海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，海南?？?570100）

如何早期識別腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)（acute rejection，AR），并且在移植腎未發(fā)生損害或輕微損害時給予及時、最佳的治療被認為是提高移植腎存活率的關(guān)鍵［1］。因此，如何在AR 造成移植腎不可逆損傷之前早期發(fā)現(xiàn)AR 是目前面臨的嚴峻問題。有研究表明微小RNA（microRNA，miRNA）參與調(diào)控移植腎AR，其發(fā)生時間不僅先于臨床癥狀，更先于病理改變［2，3］。而急性TCMR 是AR 常見的臨床類型，約占90%［4］。本研究通過二代測序的方法篩選出腎移植術(shù)后發(fā)生急性TCMR 中顯著差異表達的miRNA 并探討其可能的機制，以期尋找外周血中可穩(wěn)定檢測到、與腎移植AR 發(fā)生密切相關(guān)的miRNA 作為早期診斷急性TCMR 的新型生物學(xué)標記物，為腎移植術(shù)后急性TCMR 的早期診斷和治療提供新的更有力的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院腎移植科2019 年8 月1 日～2020 年12月31 日行同種異體腎移植術(shù)的受者8 例，其中男性6 例，女性2 例，年齡29～53 歲，平均年齡41.2 歲，群體反應(yīng)性抗體、淋巴毒試驗均為陰性，術(shù)后均使用他克莫司+麥考酚腸溶片+甲潑尼龍三聯(lián)抗排斥治療。其中實驗組和對照組各4 例。實驗組均行移植腎活檢穿刺證實為TCMR，對照組為同期腎移植術(shù)后恢復(fù)良好、腎功能穩(wěn)定的受者。兩組年齡、性別、BMI 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。實驗組診斷為TCMR 后均使用激素或者兔抗人胸腺免疫球蛋白治療，且治療后血肌酐均恢復(fù)至發(fā)生TCMR 之前的水平，復(fù)查移植腎彩超均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。本研究獲得了醫(yī)院倫理委員會的批準，且參與本研究的受者均簽署了知情同意書。

1.2 方法

抽取研究對象30 mL 肘靜脈血分別裝入3 支內(nèi)含肝素鈉抗凝劑的采血管中，2 000 r/min 離心得到PBMC。用TRIzol 試劑提取標本的總RNA，RNA質(zhì)量控制標準為：（1）260/280 比值≥1.80、260/230比值≥1.8；（2）RNA 總量＞100 ng；（3）RNA 完整度檢測28S/18S＞1.5、RNA Integrity Number（RIN）＞7。筆者將用干冰保存的總RNA 通過冷鏈寄送到上海生工生物，其采用二代測序的方法得到樣本的原始數(shù)據(jù)后用R 語言軟件進行差異性分析。為了得到顯著差異的基因，將篩選條件設(shè)為：P≤0.05且差異倍數(shù)≥2。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

對于無生物學(xué)重復(fù)的樣本，先采用TNM 對read count（讀長數(shù)目）數(shù)據(jù)進行標準化處理，之后用R 語言edgeR 包進行差異分析。對有生物學(xué)重復(fù)的樣本，采用R 語言DESeq2 包進行分析。為了得到顯著差異的基因，將篩選條件設(shè)為：P≤0.05 且差異倍數(shù)≥2。利用R 軟件繪制差異基因MA 圖和差異miRNA 靶基因功能注釋圖。

1.4 GO 富集分析

使用R 語言的clusterProfiler 包和igraph 包分別對實驗組、對照組中的差異miRNA 靶基因進行GO富集分析，最后對富集結(jié)果進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 差異miRNA 的篩選

使用R 語言DESeq2 包對原始數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)實驗組和對照組樣本數(shù)據(jù)中分別有71 個上調(diào)基因和123 個下調(diào)基因并繪制MA 圖（圖1）。其中，橫縱坐標分別為兩組樣本log2（CPM）值。圖中每個點代表一個基因，越接近于原點的點表達量越低，紅點表示上調(diào)基因，綠點表示下調(diào)基因，黑色表示非差異基因，上調(diào)、下調(diào)均是縱軸樣本相對于橫軸樣本。然后，列出實驗組和對照組前14 個顯著差異表達的miRNA，其中表達上調(diào)的miRNA 為5 個（miR-122-5p、 miR-124-3p、 miR-125a-5p、 miR-1273g-5p、hsa-miR-1275）、表達下調(diào)的miRNA 為9個（miR-1-3p、miR-101-3p、miR-106b-3p、miR-1185-5p、miR-1185-1-3p、miR-1250-5p、miR-127-5p、miR-1277-3p、miR-1299）（表1）。

表1 實驗組與對照組miRNA 表達譜比較Tab 1 Comparison of miRNA expression profiles between the experimental and control groups

圖1 差異miRNA 的MA 圖Fig 1 The MA plot of the differential miRNA

2.2 差異miRNA受試者工作特征曲線（ROC曲線）

使用R 語言的pROC 包繪制出差異miRNA ROC 曲線。其中橫縱坐標分別表示敏感性和特異性。由此算出ROC 曲線下面積（AUC）為0.88，表示本研究數(shù)據(jù)預(yù)測準確性較好。見圖2。

2.3 GO 功能富集分析

從實驗組和對照組數(shù)據(jù)得到49 個GO 條目，并通過差異miRNA 靶基因功能富集分析后，得到14個具有顯著差異的GO 條目（P＜0.05）。其中有6個條目參與了細胞組成的功能，具體體現(xiàn)在細胞漿、細胞骨架、突觸、蛋白的細胞外基質(zhì)等方面；有2個條目參與了分子功能，具體體現(xiàn)在蛋白連接和鳥嘌呤核苷酸交換因子方面；有6 個條目參與生物過程，具體體現(xiàn)在DNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)控、正向調(diào)控GTP 酶、多種細胞器的形成、磷酸化等方面。我們繪制出靶基因GO 注釋分類柱狀圖（圖3）和差異miRNA 靶基因功能顯著富集功能-基因互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。

圖3 前10 位GO 功能富集分析Fig 3 Functional enrichment analysis of the top 10 GO positions

圖4 顯著富集功能-基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Significantly enriched function-gene network map

3 討論

自1954 年人類首次成功實施同質(zhì)活體腎移植手術(shù)以來［5］，目前腎移植技術(shù)治療終末期腎病仍然無法替代［6］。雖然得益于不斷進步的腎移植技術(shù)和各類新型免疫抑制劑的應(yīng)用使得腎移植受者的生活質(zhì)量和存活時間不斷提高［7，8］，但是移植腎AR 仍然是影響移植物長期存活的主要危險因素［9］。目前，臨床上診斷AR 主要是通過臨床表現(xiàn)（包括發(fā)熱、血壓升高、尿量減少、移植腎腫大和疼痛）與實驗室檢查（血肌酐升高的幅度）進行。同樣，彩超也是通過一些非特異性改變（移植腎形態(tài)和血流阻力指數(shù)）間接診斷AR。因此，在現(xiàn)階段診斷AR 的金標準仍然是組織活檢，但其準確性受病理醫(yī)師的診斷水平、抽樣誤差等影響［10］。鑒于以上診斷方法均以發(fā)現(xiàn)移植腎的結(jié)構(gòu)和功能損害為依據(jù)，所以迫切需要新的、可靠的、非侵入的生物標記物用于在移植腎結(jié)構(gòu)和功能未發(fā)生改變之前早期診斷AR，從而最大限度降低AR 對移植腎的損害［11］。

近年來，由于miRNA 具有穩(wěn)定性、器官組織特異性、參與移植腎排斥反應(yīng)等特點，逐漸使其成為探索早期診斷AR 的熱點［12-14］。miRNA 是一類由19～23 個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA 小分子。miRNA 是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的，通過與靶mRNA 的3′-UTR 及5′-UTR 區(qū)的堿基互補配對抑制翻譯、降解mRNA，從而降低翻譯效率或阻斷mRNA 參與基因調(diào)控和表達［15］。一方面，大量研究表明大約有60%的人類轉(zhuǎn)錄組受miRNA 調(diào)控；另一方面，隨著最近高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)方法的發(fā)展，極大的促進了miRNA 的相關(guān)研究，包括調(diào)控靶點和相關(guān)功能預(yù)測［16］。Heegaard 等［17］指出miRNA 可以于疾病臨床診斷幾個月前在外周血中被發(fā)現(xiàn)，同時也被證實在腎移植術(shù)后不同病種間存在差異性表達，包括AR［18］。

Anglicheau 等［19］通過分析了腎移植術(shù)后出現(xiàn)急性排斥的表達譜，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的miR-142-5p、miR-155和miR-223 與CD3 和CD20 mRNA 密切相關(guān)，這表明這些miRNA 可能引起免疫細胞在移植物中浸潤。通過對移植腎活檢，發(fā)現(xiàn)miR-10b 在急性排斥的活檢組織中下調(diào)，并且通過靶向調(diào)控BCL2L11 抑制細胞活性和加速細胞凋亡［20］。有研究發(fā)現(xiàn)移植腎中高表達的miR-650 與急性排斥相關(guān)，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-650 是通過靶向調(diào)控BCL11B 使caspase-8 高表達，從而抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡并通過增加INF-γ 的釋放，抑制IL-13 的釋放，從而增加巨噬細胞的趨化性［21］。有學(xué)者使用多變量logistic 回歸分析認為從全血細胞中檢測出的5 個miRNAs（miR-15b、miR-16、miR103a、miR106a 和miR-107）可以準確區(qū)分TCMR（BanffⅡ-Ⅲ）的受者和其他類型損傷的受者［22］。然而，這個團隊在后續(xù)研究同樣的miRNA 在PBMC 中卻未能得到相同的結(jié)果［23］，這表明某些樣本的生物標志物鑒定結(jié)果不能簡單的擴展至全部總體，因此需要更多的研究來解釋不同樣本間miRNA 表達差異的相關(guān)機制。對于TCMR 受體，miR-99a 和miR-100 的表達上調(diào)了［24］。之前的一項研究卻發(fā)現(xiàn)TCMR 活檢組織中miR-99a 的表達降低了［19］。筆者推測，miR-99a 在組織和血清中的表達差異可能是由于外周血中與排斥反應(yīng)相關(guān)的免疫細胞數(shù)量少于移植物。有研究發(fā)現(xiàn)，在TCMR 期間，尿液中miR-210 的水平顯著降低，而miR-210 水平的降低與移植1 年后同種異體移植功能的下降相關(guān)，認為miR-210 為TCMR 的有效生物標志物，在隨后的研究中也證實了TCMR 患者尿液中miRNA-210 的表達降低，但與miRNA-210 相比，高表達的miRNA-155-5p 對TCMR 具有更好的診斷價值（敏感性為85%，特異性為86%，AUC=0.875；P=0.046）［25］。國內(nèi)相關(guān)研究是運用高通量miRNA 基因芯片檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)了AR 受者血漿中miR-142-5p、miR-144-5p、miR-130a-3p 呈 現(xiàn) 高表達［26］。

相較于以往基因芯片只能檢測特定的miRNA，本研究通過使用二代測序的方法除了靈敏度高、通量高等優(yōu)勢外，還可以實現(xiàn)全基因組測序。這將能得到更為完整的miRNA 表達譜。本課題組將所獲得的原始數(shù)據(jù)進行生信分析，發(fā)現(xiàn)獲得的差異miRNA 主要影響著DNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)控、正向調(diào)控GTP 酶、鳥嘌呤核苷酸交換因子、蛋白的細胞外基質(zhì)、蛋白連接等相關(guān)功能。有研究表明miRNA-1250-5p 是位于宿主基因細胞凋亡關(guān)聯(lián)酪氨酸激酶（AATK）第二個內(nèi)含子中miRNA，AATK 位于17q25.3［27］。Zhang 等［28］發(fā)現(xiàn)在miRNA-1250-5p 宿主基因AATK 的啟動子區(qū)存在CpG 島，miRNA-1250-5p 的低表達是通過宿主基因AATK 啟動子區(qū)的甲基化實現(xiàn)的。近年來較多研究提示DNA 甲基化參與了AR 的發(fā)生、發(fā)展［29］。同樣的，miRNA-1250-5p 在TCMR 的發(fā)生、發(fā)展中是否有DNA 甲基化參與其中值得進一步研究。

本研究使用二代測序的方法證實了腎移植術(shù)后TCMR 患者外周血PBMC miRNA 表達譜存在差異，且共檢測出14 個顯著差異表達的miRNA，其中5 個miRNA 表達上調(diào)（P＜0.05）、9 個miRNA 表達下調(diào)（P＜0.05）。這提示這些差異表達的miRNA很可能參與了TCMR 的發(fā)生、發(fā)展。并進一步預(yù)測miRNA-1250-5p 是通過DNA 甲基化調(diào)控表達，進而參與TCMR 的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過對AR 更進一步的分類篩選腎移植術(shù)后TCMR 的分子標記物為TCMR 的發(fā)生發(fā)展、診斷和治療提供了理論依據(jù)。

作者貢獻度說明：

研究設(shè)計為第一作者和通訊作者，第一作者撰寫論文，通訊作者審稿，所有作者均參與標本和數(shù)據(jù)收集，文中作者貢獻度等同，不涉及相關(guān)利益沖突。