吳小翠，楊詔鈞，楊智華，李堅昊，程亞偉，謝毅強

（1. 海南省中醫(yī)院內(nèi)分泌科，海南海口 570203；2. 廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州 510006；3. 海南省中醫(yī)院治未病科，海南?？?70203；4.海南醫(yī)學院中醫(yī)學院，海南?？?571199）

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常見且對微血管危害最大的慢性并發(fā)癥，目前患病率約為30%～40%［1］。隨著糖尿病患病人數(shù)迅速增長，DKD 的患病率也呈逐年上升的趨勢。DKD 的病變可累及全腎，是終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）的主要原因［2］，若病情進一步進展至ESRD，其患者5 年生存率將大大降低［3］。早期DKD 主要以白蛋白尿和糖尿病視網(wǎng)膜病變?yōu)橹饕R床特征，病情尚處可控階段，因此通過治療延緩早、中期DKD 意義重大。但DKD 病因復(fù)雜，發(fā)病機制尚未明確，缺乏針對性的治療手段，而中醫(yī)中藥則可為DKD 患者提供解決問題的另一途經(jīng)。

DKD 由中醫(yī)認為的“消渴”發(fā)展而來，臨床表現(xiàn)屬“水腫”、“關(guān)格”、“尿濁”等相關(guān)疾病范疇，亦可稱為“消腎”。早期DKD 證型多表現(xiàn)為燥熱陰虛證或氣陰兩虛證，治療宜用清熱養(yǎng)陰或益氣養(yǎng)陰法，玉液湯則是其中的代表方［4，5］。玉液湯源于張錫純所著的《醫(yī)學衷中參西錄》，具有益氣養(yǎng)陰、生津止渴的作用，既往的研究中已證實其治療糖尿病療效顯著［6，7］?，F(xiàn)代藥理學研究證明其在降低血糖、改善體內(nèi)細胞對胰島素敏感性、改善氧自由基代謝紊亂等方面具有明顯的作用［8，9］，但其作用機制尚未被完全闡明。

自噬（autophagy）是以一種溶酶體為介導(dǎo)的生物過程。該過程可通過降解細胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)和受損細胞器，加速新陳代謝，進而維持細胞穩(wěn)態(tài)［10］。大量研究證實糖尿病腎臟細胞自噬失調(diào)可能導(dǎo)致腎小球固有細胞和腎小管間質(zhì)病變［11，12］，且腎臟細胞自噬活性可受胰島素調(diào)節(jié)［13］。既往研究表明，玉液湯中的黃芪、葛根可調(diào)控病理狀態(tài)下信號通路的失衡，逆轉(zhuǎn)葡萄糖誘導(dǎo)的足細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化，進一步抑制因高糖刺激引起的腎系膜增生，起到減緩腎組織損害的作用［14，15］。因此玉液湯可能通過調(diào)節(jié)腎臟細胞自噬過程，從而延緩DKD 進程。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學、GEO 數(shù)據(jù)挖掘、分子對接等手段對玉液湯治療糖尿病腎病的自噬相關(guān)機制進行探討。

1 資料與方法

1.1 獲取糖尿病腎病與自噬相關(guān)基因

1.1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載 檢索GEO 平臺，限制搜索條件為GEO 數(shù)據(jù)庫中所有子庫的所有類型的糖尿病腎病，樣品類型設(shè)置為轉(zhuǎn)錄組基因表達情況，選擇下載GSE30122 數(shù)據(jù)集。

1.1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整理及ID 轉(zhuǎn)換 利用自制Perl語言腳本moveFiles.pl 和merge.pl 對已下載的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行整理，輸出mRNAmatrix 與normal-Tumor 兩個文件；整理得出數(shù)據(jù)后，利用R 語言中的clusterProfiler 包將有關(guān)基因ID 轉(zhuǎn)換為基因名稱。

1.1.3 提取自噬相關(guān)基因 將“1.1.2”中已轉(zhuǎn)換名稱的基因通過自制Perl 軟件腳本的Autophagyexp.pl 進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，檢索人類自噬數(shù)據(jù)庫（Human autophagy database）提取并輸出自噬相關(guān)基因。

1.1.4 自噬基因差異表達分析 利用R 語言中的BiocManager 和limma 包，設(shè)置工作目錄為“1.1.3”所得的自噬相關(guān)基因的表達量，設(shè)置錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）與差異倍數(shù)的對數(shù)（log-FC）的臨界值。設(shè)置完成后，在R 軟件中讀取數(shù)據(jù)，并進行差異分析，得到表達差異的P值、FDR 值和logFC 值。

1.1.5 數(shù)據(jù)可視化 根據(jù)“1.1.4”所得的表達差異情況可繪制所有樣品中自噬相關(guān)基因表達的熱圖，將差異分析所得的數(shù)據(jù)可視化。

1.2 玉液湯治療糖尿病腎病的網(wǎng)絡(luò)藥理學研究

1.2.1 獲取玉液湯基因信息 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫（version2.3，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以玉液湯組成成分作為搜索詞，檢索獲得其化學成分?？紤]到體內(nèi)中藥成分的血藥濃度，在檢索結(jié)果中限定條件為口服生物利用度大于等于30%和類藥性大于等于0.18 進行篩選，獲得對應(yīng)的化學成分信息，并以其作為潛在有效活性成分，同時在平臺中獲得各成分所對應(yīng)的潛在作用靶點。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫查找所有靶點所對應(yīng)的基因名和編號。

1.2.2 獲取與自噬相關(guān)的玉液湯治療糖尿病腎病的靶點 將“1.1.3”中獲得的糖尿病腎病自噬相關(guān)的差異基因與“1.2.1”中獲得的玉液湯潛在作用靶點進行映射，獲得治療靶點。建立有效活性成分與靶點對應(yīng)關(guān)系，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 中，得到“藥物-有效活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)。

1.2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將“1.2.2”中得到的治療靶基因?qū)隨tring 基因互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），將物種選擇為“Homosapiens”，將經(jīng)過篩選得到的靶點在“Multiple proteins”中進行檢索，選擇置信度為0.400，保存蛋白互作信息為TSV 格式文件。將TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件中，并用NetworkAnalyzer 工具進行網(wǎng)絡(luò)分析，獲得Degree 值（連接度），以設(shè)置Degree值為大于其中位數(shù)的2 倍為條件，篩選出核心蛋白繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.4 GO 生物學過程富集分析和KEGG 通路富集分析 利用Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html）進行GO 生物學過程富集分析及KEGG通路富集分析。根據(jù)GO 生物學過程富集分析所得的有關(guān)基因的矯正后的P值繪制GO 條形圖，其中主要使用R 語言中的digest 包和GOplot 包；根據(jù)KEGG 通路富集分析所得的logFC 值繪制KEGG氣泡圖，其中主要使用的R 包與GO 條形圖繪制類似。

1.3 分子對接驗證

在“1.2.1”得到的“藥物-有效活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)中，通過使用CentiScape 計算有效活性成分的Degree 值，篩選出Degree 值最高的活性成分與PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出來的核心靶點進行分子對接。

化合物2D 結(jié)構(gòu)通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲??；靶基因3D 結(jié)構(gòu)通過PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org）獲取。使用Chem3D 對化合物2D 結(jié)構(gòu)進行3D 再處理，Autodock Vina 軟件進行活性口袋分析以及分子對接，利用Pymol 軟件對結(jié)果進行輸出優(yōu)化。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病腎病與自噬相關(guān)基因統(tǒng)計

檢索GEO 數(shù)據(jù)庫中人類物種的糖尿病腎病數(shù)據(jù)，樣品類型設(shè)置為人轉(zhuǎn)錄組基因，下載到轉(zhuǎn)錄組基因數(shù)據(jù)25 523 個。檢索人類自噬數(shù)據(jù)庫（human autophagy database），并與人糖尿病腎病轉(zhuǎn)錄組基因相映射，提取自噬相關(guān)基因病進行根據(jù)基因差異化表達進行差異分析，繪制自噬相關(guān)基因表達量差異分析熱圖（圖1），得到符合條件的糖尿病腎病與自噬相關(guān)基因100 個。

圖1 GSE30122 中自噬相關(guān)基因表達量差異分析熱圖Fig 1 Heat map for differential analysis of autophagy-related gene expression in GSE30122

2.2 與自噬相關(guān)的玉液湯治療糖尿病腎病的作用靶點

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中，以生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件分別得到玉液湯（山藥、黃芪、知母、葛根、五味子、天花粉、雞內(nèi)金）的活性成分共78 個，以及對應(yīng)的靶點3 678 個。剔除重復(fù)項和無對應(yīng)活性成分的靶點后，得到玉液湯的潛在作用靶點共1 428 個。將獲得的糖尿病腎病與自噬相關(guān)的基因與玉液湯潛在作用靶點進行映射，獲得22 個治療靶點與其對應(yīng)的基因名稱、編號（表1）。

表1 玉液湯治療糖尿病腎病與自噬相關(guān)的基因Tab 1 Autophagy Related Genesin treating diabetic nephropathy with Yuye Decotion

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將與自噬相關(guān)的玉液湯治療糖尿病腎病的靶點輸入String 數(shù)據(jù)庫，限定物種選擇為“Homo sapiens”，置信度為0.400，得到核心靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)。將得到的數(shù)據(jù)以TSV 的格式導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2 中。篩選出Degree 值較大的靶點作為PPI 核心網(wǎng)絡(luò)，得到玉液湯治療糖尿病腎病的核心靶點包括VEGFA、ERBB2、GASP3、MAPK8、MYC、CDKN1A、EGFR、BCL2L1 等，具體見圖2。

圖2 玉液湯治療糖尿病腎病的自噬相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Interaction network of autophagy-related proteins in diabetic nephropathy treated with Yuye Decotion

2.4 GO 生物學過程富集分析結(jié)果

利用Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）對1.2.2 中得到的治療靶點基因進行GO 生物學過程富集分析。使用R 語言中的digest 包和GOplot 包，根據(jù)GO 生物學過程富集分析所得的有關(guān)基因矯正后的P 值繪制GO 條形圖，如圖3；根據(jù)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)玉液湯治療糖尿病腎病與自噬相關(guān)的通路可能包括mTOR 信號通路（mTOR signaling pathway）、磷脂酶D 信號通路（phospholipase D signaling pathway）、胰島素抵抗（Insulin resistance）、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、細胞凋亡（Apoptosis）等。

圖3 基于GO 分析的玉液湯治療糖尿病腎病與自噬相關(guān)的通路條形圖Fig 3 Bar graph of pathways associated with autophagy in the treatment of diabetic nephropathy with Yuye Decotion based on GO analysis

2.5 KEGG 通路富集分析結(jié)果

根據(jù)KEGG 通路富集分析所得的logFC 值繪制KEGG 氣泡圖，如圖4，其中主要使用的R 包與GO 熱圖繪制類似。由圖可得玉液湯治療糖尿病腎病與自噬相關(guān)的通路可能有mTOR 信號通路（mTOR signaling pathway）、PI3K /Akt 信號通路（PI3K /Akt signaling pathway）、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、NF-κB 信號通路（NF-kappa B signaling pathway）、細胞凋亡（Apoptosis）等。

圖4 基于KEGG 分析的玉液湯治療糖尿病腎病的自噬相關(guān)通路氣泡圖Fig 4 Autophagy-related pathway bubble map based on KEGG analysis of Yuye Decotion for diabetic nephropathy

2.6 分子對接驗證結(jié)果

根據(jù)“藥物-有效活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)中運算結(jié)果篩選出玉液湯“山藥、黃芪、知母、葛根、五味子、天花粉”6 味核心藥物中的核心活性成分共4 個，分別是槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、薯蕷皂素（diosgenin）、山柰酚（kaempferol），以及8個核心靶點蛋白（BCL2L1、CASP3、CDKN1A、EGFR、MAPK1、MAPK8、MYC、VEGFA），對核心活性成分與核心靶點蛋白進行分子對接。

在分子對接中，配體和受體二者結(jié)合越穩(wěn)定，兩者自由能越低。結(jié)果顯示槲皮素與MYC、MAPK1、BCL2L1、CASP3、VEGFA 這5 個核心靶點蛋白的自由能均小于-6.0 kcal/mol，與CDKN1A、EGFR 這2 個核心靶點的自由能較高，部分結(jié)果見表2；β-谷甾醇與CASP3 的自由能為-6.0 kcal/mol；薯蕷皂素與CDKN1A、VEGFA 的自由能分別為-5.5 kcal/mol、-8.3 kcal/mol；山柰酚與MAPK8 的自由能為-8.2 kcal/mol。

表2 核心活性成分槲皮素與部分核心靶點蛋白結(jié)合能（kcal/mol）Tab 2 Binding ability of core active ingredient quercetin to some core target proteins（kcal/mol）

將分子對接結(jié)果在Pymol 軟件進行視覺優(yōu)化后，輸出分子對接三維圖，藍色為小分子配體，綠色為大分子受體結(jié)果，部分結(jié)果見圖5、6。

圖5 CASP3 對接山柰酚（自由能-7.3 kcal/mol）Fig 5 CASP3 docking with kaempferol（free energy = -7.3 kcal/mol）

圖6 VEGFA 對接槲皮素（自由能-8.1 kcal/mol）Fig 6 VEGFA docking with quercetin（free energy = -8.1 kcal/mol）

3 結(jié)論

糖尿病腎病是糖尿病發(fā)展過程中最為常見的器官并發(fā)癥，發(fā)病前期隱匿性較強，早期癥狀并不明顯，但隨著病情不斷發(fā)展會導(dǎo)致出現(xiàn)腎功能衰竭。目前臨床對糖尿病腎病尚無根治方法，主要是通過飲食控制、運動管理、血糖血壓控制等穩(wěn)定病情［16］。糖尿病腎病在中醫(yī)學上屬于“尿濁”、“水腫”、“消癉”等疾病范疇。中醫(yī)經(jīng)典《靈樞》中提及：“五臟皆柔弱者，善病消癉。”指出消渴的發(fā)病機制與五臟功能減退、陰血虧虛、精氣不足有關(guān)。因此中醫(yī)認為糖尿病腎病的發(fā)病與勞欲過度、腎精虧損、腎中虛寒等息息相關(guān)，在治療上主張益氣養(yǎng)陰、活血生津、補腎健脾［17］。本研究采用的中藥湯劑選自張錫純所著的《醫(yī)學衷中參西錄》中的玉液湯，方用山藥、黃芪、知母、葛根、天花粉，脾腎雙補，兼用五味子、雞內(nèi)金收斂固澀，標本兼顧。

西醫(yī)方面認為，糖尿病腎病與細胞自噬密切相關(guān)。自噬屬于細胞的一種應(yīng)激反應(yīng)，在糖尿病腎病狀態(tài)下，腎臟中高糖狀態(tài)使常規(guī)的自噬通路受損，自噬通路狀態(tài)的改變可以調(diào)控由胞內(nèi)壓力引起的機體正常的自噬反應(yīng)，從而加劇細胞內(nèi)環(huán)境紊亂的情況，最終導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生［18］。本研究通過構(gòu)建“藥物-有效活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)以及分子對接方法，試圖探討與自噬相關(guān)的玉液湯治療糖尿病腎病的機制。

玉液湯治療糖尿病腎病核心靶點包括VEGFA、ERBB2、CASP3、MAPK8、MYC、CDKN1A、EGFR、BCL2L1 等，均與細胞自噬相關(guān)。在2 型糖尿病中，VEGFA 參與調(diào)控的機械性通路，會導(dǎo)致腎小球多糖-蛋白復(fù)合物丟失，包括高血糖和ROS。研究顯示，這一過程可能與患者VEGF-A165b（一種VEGFA 拮抗劑）的表達丟失有關(guān)［19］。

本研究在GO 生物學過程富集分析和KEGG 通路富集分析中發(fā)現(xiàn)，玉液湯治療糖尿病腎病與細胞自噬相關(guān)的通路有mTOR 信號通路、PI3K/Akt 信號通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗、NF-κB 信號通路、細胞凋亡等。PI3K 是PI3K-Akt 通路激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，可作為一種細胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶調(diào)節(jié)其下游分子的活性。研究表明，PI3K-Akt 通路激活可以改變足細胞標志蛋白的表達，進而改變標志蛋白的結(jié)構(gòu)，影響足突結(jié)構(gòu)的完整，使得功能失調(diào)。PI3K-Akt 通路可與p38-MAPK 通路共同介導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡，改善腎小管功能［20］。mTOR 激酶的活化是關(guān)閉細胞自噬的一個主要抑制性信號，可抑制自噬體的形成。細胞因子可通過Akt 或ERK1/2 向mTORC1 傳遞信號，便會活化結(jié)節(jié)性硬化癥-2（TSC2），減少mTORC1 的抑制信號，進而引發(fā)自噬。mTORC2 能夠激活A(yù)kt，對細胞生存起正向調(diào)節(jié)作用。被活化了TSC2 的mTORC1 還可以激活下游轉(zhuǎn)錄因子TFEB，引發(fā)進一步的自噬作用，同時，被mTORC1 活化的下游基因缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）生成，進而新生血管形成［19］。NF-κB 是一個轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，作為細胞內(nèi)多個通路的中心環(huán)節(jié)，它的活化能調(diào)節(jié)各種化學趨化因子、細胞黏附分子的轉(zhuǎn)錄與表達；NF-κB 的活化，可激活TNF-α 和白細胞介素-1β 的轉(zhuǎn)錄，這些細胞趨化因子不僅會反向調(diào)節(jié)NFκB 使其進一步激活，也能在血液中誘導(dǎo)產(chǎn)生新的趨化因子聚集在炎癥反應(yīng)發(fā)生部位，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的進一步擴散并進一步誘發(fā)糖尿病腎病，是糖尿病腎病形成的重要因素［21］。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）是一種由巨噬細胞對細菌感染或其他免疫源反應(yīng)自然產(chǎn)生的細胞因子，根據(jù)其來源和結(jié)構(gòu)不同分為兩種類型，即TNF-α 和TNF-β，可促進細胞增殖和分化，是重要的炎癥因子，并參與某些自身免疫病的病理損傷。其中TNF-α 的含量隨著糖尿病腎病的病情發(fā)展表達水平升高，因此可以用來判斷糖尿病腎損傷的程度［22］。

本研究根據(jù)“藥物-有效活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)中運算結(jié)果篩選出玉液湯組方藥物中的4 個核心活性成分，分別是槲皮素、β-谷甾醇、薯蕷皂素和山柰酚。有研究表明槲皮素能夠減輕高糖分對于人腎小球內(nèi)皮細胞的傷害，可能通過PI3K/AKT 通路的激活促進細胞對抗凋亡及拮抗氧化應(yīng)激作用來實現(xiàn)［23］。山柰酚可通過抑制細胞增殖對高糖培養(yǎng)的大鼠腎系膜細胞起到保護作用［24］。薯蕷皂素可以抑制血清肌酐的累積，減少尿蛋白的生成，從而改善腎功能；亦可通過降低MPO 活性進一步抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的磷酸化［25］。分子對接結(jié)果顯示，玉液湯組方藥物中的核心活性成分和與自噬相關(guān)的大多數(shù)治療核心靶點具有較好的相互作用與結(jié)合活性。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合分子對接的方法，分析了玉液湯治療糖尿病腎病過程中與自噬相關(guān)的核心靶點功能和可能的信號通路，證實玉液湯通過多成分、多靶點、多通路作用治療糖尿病腎病，為后續(xù)針對玉液湯治療糖尿病腎病自噬相關(guān)方面的作用機制研究提供了依據(jù)。但本研究未能對所得到的靶點及通路開展相關(guān)實驗進行驗證，此將成為下一步研究的重點。

作者貢獻度說明：

吳小翠、楊詔鈞：網(wǎng)絡(luò)藥理學部分的分析與撰寫，以及中醫(yī)理論探討部分的撰寫；李堅昊：討論中相關(guān)綜述內(nèi)容的撰寫；楊智華：本文英文摘要的撰寫；程亞偉：本文引言部分有關(guān)DKD 流行病學的資料查找及撰寫；謝毅強：項目負責人，對本篇論文的指導(dǎo)與審校。