程 偉，陳雪峰，陳興杰，周 端，楊金玉，薛錫佳，潘天全

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021；2.安徽金種子酒業(yè)股份有限公司，安徽阜陽 236023；3.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西西安 710021）

中國白酒以糧谷為主要原料，經(jīng)蒸煮糊化、攤晾加曲、固態(tài)發(fā)酵、蒸餾分類、存儲勾調(diào)等工序制備而成，酒曲作為糖化發(fā)酵劑，對白酒的品質(zhì)具有重要影響。微生物類群是決定大曲品質(zhì)的關(guān)鍵因素，大曲培養(yǎng)過程中富集的環(huán)境微生物是白酒釀造微生物的重要來源。大曲微生物菌群中的真菌在釀酒過程的產(chǎn)酒、產(chǎn)酶和產(chǎn)香等方面均具有重要作用。大曲中的霉菌對酒曲發(fā)酵過程中的糖化力、酯化力等起到重要影響，霉菌的生長利用曲料中的發(fā)酵底物代謝產(chǎn)生某些影響白酒風(fēng)味的呈香物質(zhì)。大曲菌群在白酒發(fā)酵過程中表現(xiàn)出特異性和周期性的演替特征。因此，對大曲真菌菌群的研究有利于闡明白酒發(fā)酵生香的機(jī)理，對明確不同產(chǎn)地的白酒風(fēng)格特點(diǎn)具有重要意義。中國白酒以流域?yàn)榧~帶形成了不同的聚集產(chǎn)區(qū)，長江上游產(chǎn)區(qū)和黃淮流域產(chǎn)區(qū)較為著名。皖北地區(qū)屬于中國白酒黃淮河流域產(chǎn)區(qū)，該產(chǎn)區(qū)以濃香型白酒為主，口感風(fēng)格偏向“綿順柔和”，主要白酒品牌有古井貢酒、金種子酒、文王貢酒等。

傳統(tǒng)的大曲微生物研究主要采用分離培養(yǎng)等方法。高通量測序技術(shù)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高，具有分析全面、靈敏、快速等特點(diǎn)，能夠更加客觀地反映樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的真實(shí)性。近年來，采用高通量測序技術(shù)對酒曲微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了較多研究，張會敏通過PCA-TA 克隆測序方法對古井貢酒高溫大曲和中高溫大曲中的微生物多樣性進(jìn)行研究，確定了兩種大曲中的優(yōu)勢細(xì)菌菌種；施思等采用高通量測序技術(shù)研究大曲在貯藏過程中的微生物多樣性變化，結(jié)果表明，大曲貯存過程中的真菌群落結(jié)構(gòu)不斷變化，畢赤酵母屬、根霉菌屬及橫梗霉屬最終成為大曲中的優(yōu)勢菌群。對大曲微生物群落特征及差異的研究，有利于加深對大曲和白酒發(fā)酵機(jī)理的理解，進(jìn)而提高大曲的質(zhì)量調(diào)控水平。

當(dāng)前，關(guān)于大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的研究逐漸增多，但是針對皖北地區(qū)濃香型大曲真菌群落結(jié)構(gòu)的研究較少，尤其是關(guān)于曲皮和曲心真菌群落結(jié)構(gòu)的分析及其差異物種的比較還鮮有報道。本實(shí)驗(yàn)通過高通量測序分析皖北地區(qū)3 家不同酒企濃香型大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行T-test 以比較組間差異物種，該研究為明確皖北地區(qū)濃香型大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)提供依據(jù)，對大曲的微生物組信息擴(kuò)充具有參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

大曲樣品：均為培養(yǎng)成熟剛?cè)霂熨A存的成品曲，分別取自安徽阜陽（FY）、安徽亳州（BZ）和安徽臨泉（LQ）等皖北地區(qū)3 家典型的濃香型白酒釀造生產(chǎn)企業(yè)。

試劑及耗材：氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（分析純），天津市永大化學(xué)試劑有限公司；飽和酚、十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）-Na2、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）（分析純），北京索萊寶科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（分析純），美國Sigma-Aldrich 公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，美國qiagen公司。

儀器設(shè)備：超低溫冰箱、TGL-20M 高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Gene-Amp@9700 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCPO 儀，美國ABI公司；MX.S型混勻儀，美國SCILOGEX公司；QuantiFluor型-ST熒光定量系統(tǒng)，美國Promega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取樣方法

取皖北地區(qū)3 家典型濃香型白酒釀造生產(chǎn)企業(yè)的大曲，分別取大曲表層的1～2 cm 作為曲皮樣品（樣品組“-S”，分別命名為FYS、BZS、LQS）、取曲塊中心2～3 cm的區(qū)域作為曲心樣品（樣品組“-I”，分別命名為FYI、BZI、LQI），隨機(jī)設(shè)置3 個平行樣品。將3 個平行樣品在無菌條件下等量混合后粉碎，保存于無菌袋中，置于-80 ℃冰箱以備大曲微生物總DNA的提取。

1.2.2 大曲真菌群落的結(jié)構(gòu)分析

大曲微生物總DNA 的提?。豪肅TAB 法進(jìn)行改良以提取大曲微生物的總DNA，向離心管中加入200 μL無菌雙蒸水沉淀溶解總DNA，置于-20 ℃?zhèn)溆?，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度。

PCR 的擴(kuò)增與定量：以稀釋后的基因組DNA為模板，選擇測序區(qū)域后使用帶Barcode 的特異引物（Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer:New England Biolabs）和高效高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。引物對應(yīng)區(qū)域：ITS1區(qū)引物(ITS5-1737F和ITS2-2043R)。

PCR 產(chǎn)物的純化：使用瓊脂糖凝膠(濃度為2%)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，對檢測合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化。采用酶標(biāo)定量并根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，進(jìn)行電泳檢測PCR 產(chǎn)物，回收目的條帶產(chǎn)物。

構(gòu)建文庫與上機(jī)測試：采用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒構(gòu)建文庫，經(jīng)過Qubit 和Q-PCR 定量，文庫合格后使用NovaSeq6000 進(jìn)行上機(jī)測序。建庫與測序等實(shí)驗(yàn)部分在蘇州帕諾米克生物科技有限公司完成。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與繪圖

高通量測序完成后，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和序列優(yōu)化。根據(jù)序列的相似性，將序列相似性大于及等于97%的分歸為同一OTU，將所有序列與Silva 庫（版本SILVA_138.1）進(jìn)行比對得到序列的分類學(xué)信息。采用R 語言和AI 作圖工具繪制測序數(shù)據(jù)的稀釋曲線和堆積柱狀圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲真菌多樣性分析

2.1.1 序列統(tǒng)計(jì)、有效性與Alpha多樣性分析

本實(shí)驗(yàn)對皖北地區(qū)3 個不同產(chǎn)地濃香型大曲的曲皮與曲心分別提取DNA 進(jìn)行測序，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增序列最大長度為350 bp，分別得到74391～91030 條真菌有效序列，測序長度主要分布在225～269 bp，與設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增長度接近，表明本實(shí)驗(yàn)的測序結(jié)果較合理。對測序結(jié)果在97%相似度的OTU 水平進(jìn)行Chao 指數(shù)計(jì)算，聚類分析共產(chǎn)生1696 個OTU 分類。由表1 可以看出，各樣品Coverage ≥0.999，表明本實(shí)驗(yàn)的測序結(jié)果可以較為真實(shí)地反映各樣品中的真菌多樣性，測序結(jié)果的有效性較高。

通過單個樣品的微生物多樣性分析（Alpha 多樣性），可以反映樣品中微生物群落的豐度和多樣性，包括Shannon 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Chaol 指數(shù)和Simpson 指數(shù)等4 個多樣性指數(shù)。通過構(gòu)建稀釋曲線和Shannon 曲線，可以判斷取樣的合理性和測序量及測序深度的有效性。Shannon 和Simpson 指數(shù)可以反映樣品中微生物的物種多樣性，由表1 可知，不同產(chǎn)區(qū)濃香型大曲曲皮與曲心中的真菌多樣性指數(shù)均存在明顯差異。Shannon指數(shù)常用來評價微生物群落的物種多樣性，對樣品中的微生物群落物種豐富度更為敏感，指數(shù)越大代表樣品中的微生物多樣性越高，由表1 可知，BZS 的Shannon 指數(shù)最大，表明BZS 中的真菌多樣性最高。Chao1 指數(shù)和Simpson 指數(shù)常用來表征微生物群落的物種豐富度，Chao1 指數(shù)還常用來估計(jì)物種總數(shù)，指數(shù)越大代表樣品中的微生物群落物種豐富度越高，由表1 可知，BZS 的Chao1 指數(shù)和Simpson 指數(shù)最高，表明BZS中的真菌群落物種豐富度最高。

表1 不同大曲樣品真菌Alpha多樣性指數(shù)

2.1.2 OTU分布的Venn分析

亳州（BZ）與阜陽（FY）屬于皖北地區(qū)相鄰的地級市，臨泉縣（LQ）地處阜陽市的南部，隸屬于阜陽市管轄，三地的地理位置相對臨近。對皖北不同產(chǎn)地濃香型大曲曲皮與曲心中獲取的真菌OTU 進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，對不同樣品之間相對共有及獨(dú)有的OTU 數(shù)進(jìn)行疊加，可進(jìn)一步直觀地比較OTU 數(shù)目組成相似性及重疊情況。由1（a）可知，不同曲皮樣品的共有OTU 為99 個，占曲皮總OTU 的10.70%，其中，BZS 的OTU 數(shù)最大為388 個，占曲皮總OTU的41.95%，可知BZS 的真菌多樣性較高。由1（b）可知，不同曲心樣品的共有OTU 為63個，占曲心總OTU 的8.17%，其中，F(xiàn)YI 的OTU 數(shù)最大為264 個，占曲心總OTU 的34.20 %，可知FYI 的真菌多樣性較高。由圖1（c）可知，BZS 的OTU 數(shù)為388 個，明顯高于其他樣品；整體而言曲皮的OTU 數(shù)均高于曲心。

圖1 不同大曲樣品中真菌OTU的差異性對比

通常情況下，如果序列之間的相似性高于97%，就可以把它定義為一個OTU，每個OTU 對應(yīng)一個不同的16S rRNA 序列，即每個OTU 對應(yīng)一個不同的微生物種。通過OTU 分析，可以知道樣品中的微生物多樣性和不同微生物的豐度。圖2 表示不同大曲樣品曲皮與曲心中的核心真菌共有OTU（Venn 圖），重疊部分的數(shù)字表示不同樣品的共有真菌OTU 數(shù)，非重疊部分的數(shù)字表示各樣品特有真菌OTU數(shù)。由圖2可知，不同大曲樣品曲皮和曲心中的共有核心真菌OTU 數(shù)為51 個，占曲皮和曲心核心真菌總OTU 數(shù)的6.74 %；BZS 的核心真菌OTU 數(shù)為185 個，占曲皮和曲心核心真菌總OTU 數(shù)的24.44%，占比在6 個不同樣品中最高，表明BZS的核心真菌菌群的多樣性最高。

圖2 不同大曲樣品曲皮與曲心中核心真菌共有OTU（Venn圖）

2.2 大曲真菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 大曲真菌門的分類

將得到的各類OTU 代表序列與Unite 真菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到每個OTU 在不同分類水平的物種分類信息。如圖3（a）不同樣品真菌門水平的相對豐度柱狀圖所示，BZS、LQS、BZI 和FYI 中子囊菌門（Ascomycota）均為優(yōu)勢菌門，占比分別為82.45 %、90.95 %、94.77 %和95.54 %；FYS 和LQI中的子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）均為優(yōu)勢菌門，F(xiàn)YS 中的子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）占比分別為34.05 %和64.00 %，LQI 中的子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）占比分別為53.31 %和44.48%。由圖3（b）可知，F(xiàn)YI 中的子囊菌門（Ascomycota）為絕對優(yōu)勢菌門，占比為95.54 %。綜上可知，F(xiàn)YS 和LQI 中的優(yōu)勢菌門明顯區(qū)別于其他樣品，原因還有待于深入研究。

由圖3（a）可知，BZS中的優(yōu)勢菌門為子囊菌門（Ascomycota，82.45 %）、毛霉亞門（Mucoromycota，5.46 %）和子菌門（Basidiomycota，1.39 %），BZI 中的優(yōu)勢菌門為子囊菌門（Ascomycota，94.77 %）和毛霉亞門（Mucoromycota，7.22 %），以上優(yōu)勢菌門的占比均在1.00 %以上。張會敏等利用ITS rDNA 克隆文庫法分析古井貢酒大曲（亳州地區(qū)的濃香型大曲）中真核微生物的群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，古井貢酒濃香型大曲中的真菌組成可歸為子囊菌門（Ascomycota）、毛霉亞門（Mucoromycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）等3 個優(yōu)勢菌門，該研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。

由圖3（a）可知，在不同的曲皮樣品中，F(xiàn)YS 中的子囊菌門（Ascomycota）占比為34.05 %，明顯低于其他2 個曲皮樣品；FYS 中的毛霉菌門（Mucoromycota）占比為64.00 %，明顯高于其他2 個曲皮樣品。在不同的曲心樣品中，LQI 中的子囊菌門（Ascomycota）占比為63.3%，明顯低于其他2個曲心樣品；LQI 中的毛霉菌門（Mucoromycota）占比為44.48%，明顯高于其他2 個曲心樣品。綜上可知，F(xiàn)YS 和LQI 中的優(yōu)勢菌門區(qū)別于其他樣品，皖北不同產(chǎn)地大曲的曲皮與曲心樣品中真菌群落豐度存在一定的差異，這可能會導(dǎo)致不同大曲理化指標(biāo)的差異，主要原因可能在于制曲溫度的差異。

圖3 不同大曲樣品中真菌門水平的相對豐度柱狀圖

2.2.2 大曲真菌屬的分類

如圖4（a）不同樣品組真菌屬水平的相對豐度柱狀圖所示，曲皮樣品組中總體豐度較高的菌屬有布氏白粉菌屬（BZS，，57.13 %）、根霉屬（FYS，，62.77 %）和子囊菌屬（LQS，，54.18%），曲心樣品組中總體豐度較高的菌屬有踝節(jié)菌屬（BZI，，44.12%）、嗜熱子囊屬（FYI，，44.89 %）和布氏白粉菌屬（LQI，，36.99 %）。綜上可知，皖北地區(qū)不同酒企大曲樣品的曲皮和曲心中的優(yōu)勢菌屬均不相同。

圖4 不同大曲樣品中真菌屬水平的相對豐度柱狀圖

制曲培養(yǎng)過程中，曲心的溫度普遍高于曲皮的溫度；不同培曲溫度對大曲微生物群落結(jié)構(gòu)、酶活及揮發(fā)性化合物等均產(chǎn)生重要影響；因此，可能導(dǎo)致曲心的嗜熱菌屬結(jié)構(gòu)及其豐度高于曲皮，也可能導(dǎo)致曲皮中的根霉或曲霉等適宜溫度相對不高的菌屬結(jié)構(gòu)及其豐度高于曲心。由圖4（a）可知，嗜熱子囊屬（）在BZI、FYI 和LQI 等曲心樣品中的占比分別為3.47%、44.89%和2.88%；嗜熱子囊屬（）在LQS 中的占比為22.55 %，明顯高于其他2 個曲皮樣品（FYS、0.14 %；BZS、0.57 %）。根霉屬（）在BZS、FYS 和LQS 等曲皮樣品中的占比分別為2.01 %、62.77 %和7.01 %；然而，根霉屬（）在LQI中的占比為35.93 %，明顯高于其他2 個曲心樣品（FYI、1.23 %；BZI、2.95 %），根霉屬（）可以分泌多種水解酶，有利于促進(jìn)原料淀粉的分解利用。同屬于皖北地區(qū)，地理位置接近，氣候差異不明顯，不同曲心與曲皮樣品中嗜熱子囊屬（）和根霉屬（）的差異，可能是由于不同酒企制曲工藝的差異所導(dǎo)致，尤其是培曲溫度及頂溫的差異。

如圖4（b）FY 樣品真菌屬水平的相對豐度柱狀圖所示，F(xiàn)YS 的優(yōu)勢菌屬為根霉屬（，62.77 %），F(xiàn)YI 的優(yōu)勢均屬為嗜熱子囊屬（，44.89%）。結(jié)合圖4（a）可知，酵母菌屬（）在BZS 和LQI 中的占比分別為2.01 %和1.83 %，在其他3 個樣品中的占比均低于1.00 %；酵母菌屬（）在FYS 中的占比達(dá)到17.10 %，明顯高于其他樣品，這可能是由于制曲工藝的差異所造成的，尤其是添加酵母制品或其他微生物制品用于強(qiáng)化制曲。

2.3 大曲真菌門水平的組間差異

利用Alpha 多樣性指數(shù)組間的差異分析，能夠判別出不同組別間的整體群落結(jié)構(gòu)是否有顯著性的不同，這種不同究竟是由哪些差異物種導(dǎo)致的，就需要組間差異物種分析。為了找出組間具有顯著差異的物種，可以通過T-test、Metastat 和LEfSe等方法尋找標(biāo)記性質(zhì)的物種，即biomarker 從不同層級的物種豐度出發(fā)，通過常規(guī)的T-test 可以得到差異物種。為尋找真菌門（Phylum）分類水平下不同分組間的差異物種，進(jìn)行曲皮與曲心樣品組間的T-test檢驗(yàn)，找出差異顯著（p值＜0.05）的物種。

如圖5 所示的大曲樣品組中真菌門水平的組間T-test 可知，曲皮和曲心樣品組間豐度差異顯著的物種為子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）；子囊菌門（Ascomycota）在曲皮和曲心樣品組的豐度分別為52.52%和87.41%；毛霉菌門（Mucoromycota）在曲皮和曲心樣品組的豐度分別為41.60%和9.21%。由圖5（b）所示的組間差異置信度展示可知，曲心樣品組差異物種的p值為0.028（p 值＜0.05），曲心樣品組均值差的95 %置信區(qū)間下限為-0.65，區(qū)間上限為-0.05；曲皮樣品組差異物種的p 值為0.048（p 值＜0.05），曲皮樣品組均值差的95%置信區(qū)間下限為0.01，區(qū)間上限為0.64。綜上可知，基于門水平的組間T-test 具有可信度，大曲樣品組間的差異物種為子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）。

圖5 不同大曲樣品組真菌門水平的組間T-test

圖5 說明：a 圖中每個條形分別表示在分組間豐度差異顯著的物種在每個組中的均值；b 圖中每個圈的最左端點(diǎn)表示均值差的95 %置信區(qū)間下限，圓圈的最右端點(diǎn)表示均值差95 %置信區(qū)間上限，圓圈的圓心代表的是均值的差，圓圈顏色所代表的組為均值高的組，展示結(jié)果的最右端是對應(yīng)差異物種的組間顯著性檢驗(yàn)p值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過高通量測序比較了皖北地區(qū)3 家典型酒企濃香型大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)，得到的結(jié)論主要有：（1）不同曲樣的曲皮共有真菌OTU 為43個，曲心共有真菌OTU 為47 個，曲皮與曲心共有真菌OTU為51個；（2）曲皮樣品組中豐度較高的有布氏白粉菌屬（BZS，，57.13 %）、根霉屬（FYS，，62.77 %）和子囊菌屬（LQS，，54.18%），曲心樣品組中豐度較高的有踝節(jié)菌屬（BZI，，44.12 %）、嗜熱子囊屬（FYI，，44.89 %）和布氏白粉菌屬（LQI，，36.99 %）；（3）基于門水平的組間T-test 表明，曲皮和曲心分組間的差異物種為子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）。

大曲微生物多樣性研究對探究不同制曲工藝的微生物差異、解析相關(guān)功能菌株具有重要意義；功能菌株的篩選、純化及強(qiáng)化應(yīng)用，對提高白酒品質(zhì)、原料利用率和特征風(fēng)味成分含量等具有重要影響，有利于為微生物菌群的強(qiáng)化應(yīng)用提供思路。綜上可知，皖北地區(qū)3 家典型酒企濃香型大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)各具特點(diǎn)，差異性可能是由于不同區(qū)域環(huán)境微生物、制曲工藝等造成。該研究為明確皖北地區(qū)濃香型大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)提供依據(jù)，對大曲微生物組的信息擴(kuò)充具有一定參考價值。