編譯 劉迪一

十年前，伊曼紐爾?卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和詹妮弗?杜德娜（Jennifer Doudna）于《科學(xué)》雜志撰文介紹了一種全新的基因組編輯技術(shù)。這是CRISPR領(lǐng)域的開山之作：她們將RNA介導(dǎo)的細菌免疫防御系統(tǒng)改造為一種靶向的DNA系統(tǒng)，論證了利用該系統(tǒng)開展可編程RNA引導(dǎo)的基因編輯的潛力。CRISPR那驚世駭俗的潛力在隨后幾年間改變了生命科學(xué)。

詹妮弗?杜德娜（左）和伊曼紐爾?卡彭蒂耶（右）獲得諾貝爾獎

從基因驅(qū)動到基因篩查，從基因診斷到基因治療，CRISPR核酸以及常與其配對的Cas酶變革了科學(xué)家修改DNA和RNA的方式。正如瑞典皇家科學(xué)院秘書長在公告里介紹的，杜德娜和卡彭蒂耶因開發(fā)了一種能“改寫生命密碼”的技術(shù)而獲得2020年諾貝爾化學(xué)獎。然而，通過基因編輯篡改遺傳信息也引出了倫理難題。

只要基因編輯技術(shù)存在，關(guān)于其所有權(quán)的法律爭奪就會一直持續(xù)。杜德娜與卡彭蒂耶的CRISPR團隊坐鎮(zhèn)加州大學(xué)伯克利分校和奧地利維也納大學(xué)，華人學(xué)者張鋒的團隊則屬博德研究所（Broad Institute）麾下。兩派均聲稱自己的隊伍才是首個將CRISPR-Cas9用于復(fù)雜細胞（真核生物）基因編輯的團體。不同國家的專利局就此爭論做出了不同裁決，而美國方面的最新決議是，隸屬麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)的博德研究所保留在真核生物中使用 CRISPR-Cas9 的知識產(chǎn)權(quán)，而卡彭蒂耶、加州大學(xué)和維也納大學(xué)保留使用CRISPR-Cas9進行體外及原核生物編輯的原始專利。

盡管存在爭議，CRISPR技術(shù)的學(xué)術(shù)和商業(yè)探索——從基因治療到作物改良——仍將繼續(xù)。以下是科學(xué)家妙用CRISPR的七大招式。

基因驅(qū)動

基因驅(qū)動是指通過特定手段令某種等位基因有偏向性地遺傳，使得后代繼承該基因的比例更高，從而使得特定突變及其控制的性狀在種群內(nèi)迅速擴散。但人為推動基因驅(qū)動絕非易事。CRISPR出現(xiàn)以前，科學(xué)家們已多次嘗試，但都不得不承認制造轉(zhuǎn)基因品種是樁艱巨任務(wù)。CRISPR技術(shù)加速了基因驅(qū)動的發(fā)展，研究人員借助它成功創(chuàng)建基因驅(qū)動。在2015年，科學(xué)家培育了大量抗瘧疾寄生蟲的蚊子。2019年，研究人員對小鼠做基因改造，令其后代更有可能通過白色皮毛散發(fā)紅光，實現(xiàn)了對哺乳動物的首次基因驅(qū)動。

基因篩查

CRISPR出現(xiàn)以前，RNA干擾（RNA interference，簡稱RNAi）是用于識別疾病相關(guān)突變或評估細胞內(nèi)潛在藥物靶點的主要技術(shù)。RNA干擾是指雙鏈RNA特異性地結(jié)合與之互補的mRNA，導(dǎo)致后者降解，從而特異性地抑制基因表達。RNA干擾需要設(shè)計與mRNA結(jié)合的RNA鏈，以阻止特定基因產(chǎn)生蛋白質(zhì)。而CRISPR可帶來更高效、更具特異性的靶向和抑制，因此CRISPR/Cas9迅速被用于大規(guī)?；蚝Y查。

單細胞篩查（SINGLE-CELL SCREEN）：一座向?qū)NA庫（每條RNA都針對一個基于CRISPR干擾的獨特基因，并攜帶一獨特條形碼序列）被引入一個細胞群；細胞群的濃度導(dǎo)致平均每個細胞有一向?qū)NA進入。接著將單個細胞分類成小滴，小滴上帶有獨特的條形碼polyT引物，用于提取細胞的mRNA。之后對RNA的測序揭示了引入的基因突變（由向?qū)NA決定）以及由此帶來的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)（由攜帶細胞特異性條形碼的mRNA決定）

例如，將CRISPR篩查與類器官和遺傳條形碼技術(shù)相結(jié)合，幫助研究者在2021年發(fā)現(xiàn)了新的小腦癥的調(diào)控基因。小腦癥是一種罕見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，此癥患兒的大腦在懷孕期間未能正常發(fā)育，或于出生后停止生長，其頭部較正常嬰兒小得多。2016年，其他學(xué)者使用CRISPR篩查來尋找之于癌癥免疫療法研發(fā)不可或缺的基因，或識別非編碼DNA中的增強子。

由于CRISPR可針對特定基因序列進行設(shè)計，學(xué)界正開發(fā)基于CRISPR的病原體平臺，旨在快速經(jīng)濟地檢測包括寨卡病毒、HPV和埃博拉病毒等在內(nèi)的病原體。杜德娜實驗室于2018年首次推出的DETECTR診斷系統(tǒng)通過檢測核酸序列確認病毒身份。DETECTR使用一種別樣的Cas酶——Cas12a。該酶能在結(jié)合目標(biāo)序列后切斷單鏈DNA。最初，他們將 CRISPR/Cas12a靶向人類乳頭瘤病毒序列，其中包括一種報告DNA分子（reporter DNA molecule），會在被切割時發(fā)光，這使得任何陽性樣本都很容易被發(fā)現(xiàn)。麻省理工學(xué)院的張鋒發(fā)明了一種名為SHERLOCK的類似工具，并證明了它通過單點突變區(qū)分不同序列的能力——這意味著SHERLOCK可用于基因分型以及病毒變種和癌性突變的識別。

SHERLOCK和DETECTR目前都已被用于診斷新冠。miSHERLOCK自有一套完整的COVID-19檢測體系，可在 3D打印設(shè)備中從頭至尾地運行檢測過程。至于DETECTR，研究人員將它與LAMP法相結(jié)合，后者全稱為“環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法”（Loop-mediated Isothermal Ampli fi cation），是一種無需PCR即可擴增核酸序列的方法。在陽性測試中，Cas12酶能鎖定其目標(biāo)序列，并對核酸瘋狂切割，還會切斷一種報告分子（陽性測試可檢測出此分子）。另一項基于CRISPR的方法最初被用于檢測鐮狀細胞性貧血，現(xiàn)在也是識別新冠病毒的有利工具。

CRISPR的靶向特異性并不拘泥于核酸。另一個基于CRISPR的“CAMERA”系統(tǒng)可記錄下來自人類和細菌細胞的化學(xué)信號。（CAMERA全名為CRISPR-mediated analog multi-event recording apparatus，可譯作“CRISPR介導(dǎo)的模擬多事件記錄裝置”。）在CAMERA系統(tǒng)中，向?qū)Х肿又划a(chǎn)生于某些特定條件下，例如存在抗生素。一旦有了向?qū)?，CRISPR系統(tǒng)就會剪斷某些DNA質(zhì)粒，而又不切割其他質(zhì)?！邢蛱禺愋詻Q定哪些質(zhì)粒被切割。通過測量這兩類質(zhì)粒的比例，研究人員可確定細胞是否暴露于某種條件下。諸如CAMERA之類的CRISPR工具也被用于生物傳感器，以檢測抗生素、營養(yǎng)素或毒素等化合物。

如果唾液樣本中含有SARS-CoV-2的RNA，miSHERLOCK設(shè)備會發(fā)出明亮的光

基因治療

基因編輯還為基因治療打開大門?；蛑委熤荚谕ㄟ^精確改變基因組以治療或預(yù)防疾病。2017年，科學(xué)家借助鋅指核酸酶，首次在人類身上實現(xiàn)了基因治療。鋅指核酸酶是一種基因編輯技術(shù)，在CRISPR-Cas出現(xiàn)以前曾風(fēng)光無限，能夠更精確地插入基因，因此稱得上基因治療的一柄良器。CRISPR 在2020年首次用于編輯活人體內(nèi)基因：當(dāng)時美國波特蘭的醫(yī)生將一種基于CRISPR的醫(yī)療包注射至患者視網(wǎng)膜以治療遺傳性失明。其他CRISPR基因療法的試驗，包括針對轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性和β-地中海貧血等疾病的試驗，都正在進行中。

醫(yī)學(xué)應(yīng)用

CRISPR編輯的治療應(yīng)用不必直接針對患者基因組。眼下開展的多項工作嘗試以其他方式兌現(xiàn)CRISPR的醫(yī)用潛力。例如，生物技術(shù)公司Eligo Bioscience正在開發(fā)基于CRISPR的戰(zhàn)痘方法——靶向攜帶尋常性痤瘡相關(guān)基因的痤瘡丙酸桿菌。其他研究者正使用CRISPR來修飾CAR-T細胞。CAR-T細胞全名為“嵌合抗原受體T細胞”，是經(jīng)過基因工程改造的T細胞，可產(chǎn)生用于免疫治療的人造T細胞受體。CAR-T療法是一種癌癥免疫療法，通過對患者的T細胞重新編程，以標(biāo)記癌細胞進行破壞。不過這些于2020年被證明了安全性的CRISPR工程化CAR-T細胞尚未進入臨床。

用CRISPR改造的豬對PPRS病毒有抗性

作物和牲畜改良

自從有了農(nóng)耕，人類就一直努力提升食材品質(zhì)，尤其是在自己養(yǎng)殖的食用動植物方面。起初，這些努力以人工選擇和誘導(dǎo)突變的方式踐行，追逐可遺傳的理想性狀。但現(xiàn)在，基因編輯幫助科學(xué)家們更精確地培育出有著更高產(chǎn)量、更強抗病性、更優(yōu)營養(yǎng)成分以及其他有益特性的生物體。雖然鋅指核酸酶和TALENs（一種可靶向修飾特異DNA序列的酶，全名“轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶”）等技術(shù)可以并且已經(jīng)用于對作物和牲畜進行遺傳改良，但這些技術(shù)比CRISPR更昂貴，精度更低。農(nóng)業(yè)科技領(lǐng)域正在開展的CRISPR相關(guān)創(chuàng)新包括不變色蘑菇、抗病香蕉和小豬，以及高生產(chǎn)率的玉米。

基礎(chǔ)研究

相比其他基因編輯技術(shù)，CRISPR成本低，精度高，用起來方便，這使它成為各個研究領(lǐng)域的首選技術(shù)。例如，CRISPR編輯為科學(xué)家們提供了關(guān)于長頸鹿奇怪體型來源的線索：在2021年的一項研究中，科學(xué)家將長頸鹿相比于其他反芻動物差異最大的基因——FGFRL1基因——插入小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一些細微變化，這些變化似乎表明長頸鹿的FGFRL1增強了機體骨骼和血管，以應(yīng)對其獨特的生活方式。研究人員還利用經(jīng)CRISPR編輯的埃及伊蚊發(fā)現(xiàn)了人類皮脂中的特定化合物，標(biāo)志著人類對昆蟲的吸引力。2022年，科學(xué)家使用CRISPR-d/Cas9系統(tǒng)（CRISPR/Cas9的姊妹系統(tǒng)）成功逆轉(zhuǎn)表觀遺傳標(biāo)記，并減輕了大鼠的焦慮和嗜酒傾向。此成果表明，對表觀基因組的深入解讀有助于治療“酒精使用障礙”。

資料來源 The Scientist