郭 瑞 李亞楠 李怡陽 石晶紅

河套學(xué)院 內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000

乳酸菌的培養(yǎng)基種類繁多，大致可分為以乳清蛋白為基質(zhì)的培養(yǎng)基、以脫脂乳為基質(zhì)的培養(yǎng)基、以MRS為基質(zhì)的培養(yǎng)基。乳清蛋白培養(yǎng)基中的乳清蛋白易發(fā)生熱變性，產(chǎn)生沉淀，且活菌數(shù)低；脫脂乳培養(yǎng)基雖然經(jīng)濟(jì)易得，價格低廉，但是粘度大，菌體不易濃縮分離，MRS培養(yǎng)基價格貴，且應(yīng)用在食品中味道不佳[1]。

隨著我國食品工業(yè)的發(fā)展，乳酸菌發(fā)酵肉制品以其風(fēng)味獨特，營養(yǎng)豐富，易于消化等諸多優(yōu)點備受食品加工企業(yè)和研究人員的關(guān)注。而目前直投式乳酸菌培養(yǎng)基的研究主要集中在發(fā)酵乳制品方面，針對發(fā)酵肉質(zhì)品直投式乳酸菌培養(yǎng)基的相關(guān)研究較少，這嚴(yán)重影響和限制了發(fā)酵肉制品研究技術(shù)的應(yīng)用和推廣。

試驗以河套學(xué)院食品微生物實驗室分離純化出的發(fā)酵肉用植物乳桿菌為種子菌株,將MRS培養(yǎng)基中的氮源替換為廉價的含有大量含氮物質(zhì)的食品原料，探索不同食品級氮源對發(fā)酵肉用乳酸菌生長的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

黃豆芽、黑豆、平菇、黃豆、青島啤酒(麥芽濃度10°P,酒精度≥4.0%)(市售)；

豆腐渣、葵花粕、酒糟，河套學(xué)院農(nóng)學(xué)系農(nóng)產(chǎn)品加工實驗室提供；

魚內(nèi)臟，河套學(xué)院農(nóng)學(xué)系畜產(chǎn)品加工實驗室提供；

植物乳桿菌，河套學(xué)院農(nóng)學(xué)系食品微生物實驗室提供；

NaOH、酚酞、硫酸鎂分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；

無水乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸錳分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；

無水葡萄糖、吐溫80分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；

牛肉膏、酵母浸粉、蛋白胨生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

檸檬酸銨分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

電子天平(TD5002A)，天津天馬衡基儀器有限公司；

電子分析天平(BSA323S)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-30KB)，上海申安醫(yī)療器械廠；

電熱恒溫培養(yǎng)箱(SKP-01)，湖北省黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；

智城超凈工作臺(ZHJH-C1112B)，上海智城分析儀器制造有限公司；

漩渦混合器(XH-D)，海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；

分光光度計723型，上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司；

料理機(jī)(JYL-C19V)，九陽股份有限公司。

1.3 菌種的活化

將植物乳桿菌在液體MRS培養(yǎng)基中活化兩代，37℃培養(yǎng)16.5h。

1.4 原料的處理

分別稱取固體食品原料50g，加入1 000mL蒸餾水于料理機(jī)中打碎，熬煮后過濾，取其濾液備用。

1.5 單一食品級氮源對比實驗

原料分別熬煮30min和1h，過濾，得到濾液。分別移取70mL濾液加入到去除氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉)的MRS液體培養(yǎng)基中，用蒸餾水定容至100mL，調(diào)節(jié)pH值為6.2～6.5，接種植物乳桿菌，接種量為1%，37℃培養(yǎng)13h。以MRS培養(yǎng)基作為空白對照。每1h取樣測定菌液吸光值和滴定酸度。

1.6 兩種食品級氮源混合實驗

移取篩選出的食品級氮源濾液35mL加入到去除氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉)的MRS液體培養(yǎng)基中，再分別加入啤酒或酒糟濾液35mL，用蒸餾水定容至100mL，調(diào)節(jié)pH值為6.2～6.5，接種植物乳桿菌，接種量為1%，37℃培養(yǎng)13h。以MRS培養(yǎng)基作為空白對照。每1h取樣測定菌液吸光值和滴定酸度。

1.7 三種食品級氮源混合實驗

分別移取篩選出的兩種食品級氮源濾液各35mL替代MRS液體培養(yǎng)基中的氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉)，用魚內(nèi)臟濾液代替蒸餾水定容至100mL，調(diào)節(jié)pH值為6.2～6.5，接種植物乳桿菌，接種量為1%，37℃培養(yǎng)13h。以MRS培養(yǎng)基作為空白對照。每1h取樣測定菌液吸光值和滴定酸度。

1.8 菌液吸光值的測定

用723型分光光度計測定菌懸液600nm處的OD值，比較其生長情況。

1.9 滴定酸度的測定

滴定酸度的測定采用0.1mol/L NaOH進(jìn)行滴定，按照GB12456-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測定》[2]方法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一食品級氮源對發(fā)酵肉用乳酸菌生長的影響

由圖1和圖2分析可得，豆腐渣和黑豆作為氮源的培養(yǎng)基中，隨著熬煮時間的延長，植物乳桿菌的生長情況反而不佳。這是因為豆腐渣和黑豆中雖然蛋白質(zhì)含量豐富，但在熬煮過程中水溶性蛋白質(zhì)發(fā)生熱變形，其含量隨著溫度的升高和提取時間的延長而急劇下降[3]，即熬煮時間越長濾液中提取的含氮化合物越少，越不利于植物乳桿菌的生長。但是其菌液的滴定酸度與菌體的生長情況卻相反，添加熬煮1h濾液作為氮源的培養(yǎng)基滴定酸度均顯著高于熬煮30min濾液作為氮源的培養(yǎng)基的滴定酸度。這是因為本試驗所選用的乳酸菌為發(fā)酵肉用植物乳桿菌，其代謝過程中可產(chǎn)生大量脂肪酶，降解脂肪產(chǎn)生脂肪酸，導(dǎo)致滴定酸度的升高。隨著熬煮時間的延長，豆腐渣和黑豆中的脂肪被提取到濾液中的含量增多，其滴定酸度也明顯更高。魚內(nèi)臟作為氮源的培養(yǎng)基中菌體生長情況不是最好，而滴定酸度卻最高也是這個原因?？ㄆ傻臑V液中也含有大量脂肪，但是其同時含有能抑制脂肪酶活性的綠原酸[4]，所以其滴定酸度并不高。

黃豆芽、魚內(nèi)臟、平菇、葵花粕和酒糟隨著熬煮時間的延長植物乳桿菌的生長情況也更好。其中加入熬煮1h的氮源的培養(yǎng)基中，平菇和豆芽作為氮源的植物乳桿菌生長情況與MRS液體培養(yǎng)基接近。豆芽是由大豆浸泡后發(fā)出的嫩芽，在萌發(fā)過程中，部分蛋白質(zhì)會分解為各種氨基酸，其含量可達(dá)到豆子原含量的7倍，并釋放出更多的磷、鋅、鐵、鈣、鎂等礦物質(zhì)，維生素類物質(zhì)的含量也會大大增加[5]。平菇是人工栽培中產(chǎn)量較高的一種食用菌，蛋白質(zhì)含量高達(dá)23.22%，氨基酸含量為3.447%，還含有大量的維生素和磷、鉀、鈉、銅、鋅等礦物質(zhì)[6，7]。通過長時間熬煮，氨基酸、礦物質(zhì)和維生素等被提取出來添加到培養(yǎng)基中，既提供了植物乳桿菌生長所需的氮源，礦物質(zhì)和維生素[8]也促進(jìn)了植物乳桿菌的生長。

2.2 兩種食品級氮源混合對發(fā)酵肉用乳酸菌生長的影響

每升啤酒約含有3.5g蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物一肽和氨基酸[9]；白酒酒糟是以高粱、玉米、豌豆、小麥等谷物為原料經(jīng)過蒸煮、發(fā)酵、蒸餾出酒后產(chǎn)生的固體廢棄物，含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)及大量的氨基酸[10]，據(jù)統(tǒng)計每100g白酒酒糟中含有維生素C 37.5mg[11]，可促進(jìn)植物乳桿菌的生長[8]。所以選用啤酒原液和經(jīng)熬煮1h所得的白酒酒糟濾液與篩選出的熬煮1h獲得的豆芽和平菇的濾液1∶1混合后，替代MRS中的氮源培養(yǎng)植物乳桿菌。

由圖3和圖4分析可得，啤酒豆芽混合作為氮源的培養(yǎng)基中植物乳桿菌的生長情況最接近MRS但并未超過或者達(dá)到MRS的增菌能力，其他三種組合作為氮源的培養(yǎng)基中植物乳桿菌的生長情況并不理想?？赡苁怯捎诙寡俊⑵焦?、啤酒和酒糟皆為植物性氮源，所提供的氮源種類比較單一，不能完全替代MRS培養(yǎng)基中牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉的作用。

2.3 三種食品級氮源混合對發(fā)酵肉用乳酸菌生長的影響

淡水魚內(nèi)臟的干物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量在23%以上，其必需氨基酸除含硫氨基酸含量偏低外，其他必需氨基酸均接近或超過全蛋蛋白[12]，是一種極佳的動物性氮源，將其與植物性氮源按比例混合，替代MRS培養(yǎng)基中的氮源，可以彌補(bǔ)單純使用植物性氮源的不足。

由圖5和圖6分析可得，三種食品級氮源混合所配制的培養(yǎng)基中植物乳桿菌的長速度快，均優(yōu)于MRS對照，且分別于接種后2h內(nèi)即進(jìn)入對數(shù)生長期，比MRS培養(yǎng)基中植物乳桿菌的對數(shù)生長期提前3h，并于9h左右進(jìn)入對數(shù)生長末期。其中酒糟豆芽魚內(nèi)臟三種氮源混合結(jié)果最佳，啤酒豆芽魚內(nèi)臟次之。實驗證明，種類多樣的食品級氮源在提供氮源的基礎(chǔ)上又增加了碳源以及生長因子等的含量，更有助于發(fā)酵肉用植物乳桿菌的生長。

3 結(jié)論

通過對實驗結(jié)果分析表明，用食品中的氮源替換原MRS液體培養(yǎng)基中的氮源切實可行，將動物性氮源與植物性氮源混合效果優(yōu)于單純使用植物性氮源。其中白酒酒糟豆芽魚內(nèi)臟的組合最有利于發(fā)酵肉用乳酸菌的生長，且生長性能優(yōu)于MRS培養(yǎng)基。其工藝條件為分別稱取豆芽，魚內(nèi)臟和白酒酒糟50g，分別加入1 000mL蒸餾水于料理機(jī)中打碎，熬煮1h后過濾，取豆芽和白酒酒糟濾液各35mL替代MRS液體培養(yǎng)基中的氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉)，用魚內(nèi)臟濾液代替蒸餾水定容至100mL，調(diào)節(jié)pH值為6.2～6.5。

酒糟和魚內(nèi)臟均為食品加工過程中產(chǎn)生的廢棄物，若以其作為直投式發(fā)酵肉用乳酸菌培養(yǎng)基的氮源，既可以獲得高質(zhì)量的乳酸菌，又可以減少資源浪費，降低生產(chǎn)成本，有利于發(fā)酵肉制品研究技術(shù)的應(yīng)用和推廣。