張 登，楊春雪，馬 慧，廖祥儒，管政兵*

1.上海煙草集團(tuán)太倉海煙煙草薄片有限公司，江蘇省太倉市東方東路19號 215433 2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇省無錫市蠡湖大道1800號 214122

目前生產(chǎn)再造煙葉的工藝主要包括造紙法、輥壓法和稠漿法，其中造紙法產(chǎn)品不僅可改善煙葉產(chǎn)品結(jié)構(gòu)強(qiáng)度和燃燒性能，降低卷煙煙氣煙堿和焦油量，同時還能降低煙葉單耗從而節(jié)約生產(chǎn)成本，因此應(yīng)用最為廣泛［1-2］。造紙法制再造煙葉首先要對煙梗、片煙末進(jìn)行萃取，使可溶性物質(zhì)和纖維物質(zhì)分離，再將萃取后的煙梗、片煙末打漿處理，抄造成型，然后將可溶性物質(zhì)濃縮加料后噴灑于基片上，最后烘干、分切涂布后的基片制成再造煙葉［3］。研究表明，造紙法再造煙葉生產(chǎn)線上微生物種類繁多，其中一些功能性微生物在再造煙葉生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生酯類、醇類、萜類、酸類、酚類等香味物質(zhì)［4-5］，且部分微生物還能降低有害物前體物質(zhì)的含量［6］，另一些微生物的異常增殖會造成造紙法再造煙葉生產(chǎn)環(huán)節(jié)出現(xiàn)腐敗、霉變等現(xiàn)象［7］。

高通量測序技術(shù)，也稱第二代測序技術(shù)，雖已較廣泛應(yīng)用于煙草微生物多樣性的分析，但應(yīng)用該技術(shù)分析再造煙葉生產(chǎn)過程中微生物多樣性的研究還較少。目前已報道的研究包括舒明等［8］對再造煙葉生產(chǎn)過程中的萃取液、濃縮液、醇化液進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性高通量測序分析，顯示占主導(dǎo)地位的細(xì)菌種群是厚壁菌門，而厚壁菌門中的優(yōu)勢菌屬是乳桿菌屬（Lactobacillus）和賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）；王充等［9］采用高通量測序技術(shù)對再造煙葉濃縮液進(jìn)行了真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，顯示真菌種群中優(yōu)勢菌屬為釀酒酵母屬（Kazachstania）、假絲酵母屬（Candida）和Ogataea，細(xì)菌種群優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）和Aeribacillus。為進(jìn)一步了解再造煙葉生產(chǎn)過程微生物的多樣性及其分布與變化情況，通過高通量測序法對造紙法再造煙葉不同生產(chǎn)階段物料的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行組成和豐度分析，探討細(xì)菌和真菌在生產(chǎn)過程物料中的分布及變化情況，旨在為再造煙葉生產(chǎn)中有益微生物資源的挖掘和有害微生物的管控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

再造煙葉生產(chǎn)線各物料樣品取自上海煙草集團(tuán)太倉海煙煙草薄片有限公司，樣品編號和名稱如圖1所示，分別為：BP_1片煙末，BP_2煙梗，BP_3預(yù)萃后煙梗，BP_4萃取后擠干物料，BP_5一級擠干后萃取液，BP_6離心后萃取液，BP_7濃縮液，BP_8新鮮涂布液，BP_9抄前漿料，BP_10凈化后白水，BP_11白水，BP_12一級漿料（擠干后煙梗和片煙末一級破碎），BP_13二級漿料（擠干后煙梗和片煙末二級破碎），BP_14損紙漿，BP_15沖漿白水（用于稀釋抄前漿的濃白水），BP_16基片，BP_17涂布液（放置2 h的涂布液），BP_18烘箱后再造煙葉，BP_19分切后再造煙葉，BP_20打包再造煙葉，BP_21木漿，BP_22木漿板（用于破碎成木漿），BP_23上毛毯積漿，BP_24再造煙葉成品（2016年），BP_25再造煙葉成品（2015年）。重復(fù)3次取樣，樣品采集后用無菌塑封袋或塑料瓶密封，液體樣品進(jìn)行離心后收集菌體沉淀，冰袋冷藏送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測序分析。

圖1 樣品來源分布流程圖Fig.1 Flow chart of sample sources and their distributions

1.2 基因組DNA的提取

采用基因組DNA提取試劑盒TruSeqTMDNA Sample Prep Kit（美國Illumina公司）制備樣品微生物基因組總DNA，提取結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質(zhì)量，DNA樣品置于-20℃冰箱保存。

1.3 PCR擴(kuò)增及高通量測序

擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的引物為515F與907R，用于擴(kuò)增基因的V3-V4區(qū)；擴(kuò)增真菌rRNA基因間隔區(qū)序列（ITS序列）的引物為ITS1F和ITS2R，用于擴(kuò)增ITS1區(qū)。PCR擴(kuò)增使用TransStart?Fastpfu DNA Polymerase試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），所有樣品的PCR擴(kuò)增重復(fù)3次，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）切膠回收PCR產(chǎn)物。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluoTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)［普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司］進(jìn)行檢測定量，之后按照每個樣品的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例混合，最后在Illumina MiSeq測序平臺（美國Illumina公司）對PCR產(chǎn)物序列進(jìn)行雙端測序。基因組DNA提取、文庫構(gòu)建與測序均在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

原始的測序序列由Flash（version 1.2.11）軟件進(jìn)行雙端序列拼接，處理后的序列用QIIME（version 1.9.1）軟件在97%的相似水平下對優(yōu)化序列進(jìn)行OTU劃分。對OTU序列進(jìn)行物種注釋，進(jìn)而生成各分類學(xué)水平微生物豐度表。通過Mothur（version 1.30.2）α多樣性分析單個樣品的微生物物種多樣性，通過β多樣性比較不同樣品間細(xì)菌和真菌的群落組成和結(jié)構(gòu)差異，并分別利用香農(nóng)（Shannon）指數(shù)、Chao指數(shù)、物種豐富度指數(shù)（ACE）、有效數(shù)據(jù)覆蓋率（Goods coverage）指數(shù)和逆辛普森（Inverse Simpson）指數(shù)公式計算微生物多樣性指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 再造煙葉生產(chǎn)過程細(xì)菌群落多樣性分析

2.1.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

提取再造煙葉生產(chǎn)過程中25個不同生產(chǎn)階段物料樣品的微生物基因組DNA，對細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)PCR擴(kuò)增測序后，經(jīng)過濾和雙端拼接，結(jié)果顯示除樣品BP_22木漿板、BP_24再造煙葉成品（2016年）、BP_25再造煙葉成品（2015年）未獲得測序結(jié)果外，其余22個樣品共獲得了1 083 987條有效序列，平均長度為376 bp，得到644個OTU。使用Greengenes細(xì)菌分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對每個OTU代表序列進(jìn)行物種注釋，共注釋得到21個門、43個綱、116個目、209個科、393個屬和543個種水平的細(xì)菌微生物。

2.1.2 α多樣性指數(shù)分析

α多樣性分析結(jié)果如表1所示。在97%相似性水平下，樣品的OTU覆蓋率都大于99.8%，說明測序結(jié)果能夠真實反映再造煙葉生產(chǎn)中物料的細(xì)菌多樣性情況。此外，BP_4萃取后擠干物料的物種豐富度指數(shù)和Chao指數(shù)最高，說明萃取后擠干煙物料的細(xì)菌豐度最高。BP_8新鮮涂布液和BP_23上毛毯積漿的物種豐富度指數(shù)和Chao指數(shù)最低，說明新鮮涂布液和上毛毯積漿的細(xì)菌豐度和均勻性最低。BP_3預(yù)萃后煙梗的香農(nóng)指數(shù)和Inverse Simpson指數(shù)最高，說明預(yù)萃后煙梗的細(xì)菌多樣性程度最高。BP_8新鮮涂布液的香農(nóng)指數(shù)和Inverse Simpson指數(shù)最低，說明新鮮涂布液的細(xì)菌多樣性程度最低。

表1 樣品細(xì)菌多樣性指數(shù)Tab.1 Bacterial diversity indexes of samples

2.1.3 屬水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

再造煙葉生產(chǎn)線各物料在屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析表明，樣品中主要的細(xì)菌屬有乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和韋榮氏球菌屬（Veillonella）。由圖2可知，根據(jù)物料的走向和分布，優(yōu)勢菌屬相對豐度發(fā)生以下較大變化：最初煙梗的優(yōu)勢菌屬為魏斯氏菌屬（Weissella），片煙末的優(yōu)勢菌屬為青枯菌屬（Ralstonia），經(jīng)預(yù)萃和萃取后，乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度明顯升高，其次為芽孢桿菌屬（Bacillus）和韋榮氏球菌屬（Veillonella）。其中，BP_7濃縮液、BP_8新鮮涂布液和BP_17放置2 h的濃縮液樣品中乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度均在90%以上。BP_9抄前漿料經(jīng)長時間存放變成BP_23上毛毯積漿后，乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度從75.98%大幅降低至1.78%，且鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）成為優(yōu)勢菌屬。而在BP_23上毛毯積漿經(jīng)過擠干壓榨成基片后，BP_16基片的菌群結(jié)構(gòu)又呈現(xiàn)與BP_9抄前漿料的細(xì)菌屬結(jié)構(gòu)相似的特點。

圖2 樣品在屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure of samples at genus level

2.1.4 基于Bray-Curtis分析的屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)熱圖

圖3為基于Bray-Curtis分析并通過R語言工具繪制的樣品熱圖。由該圖可知乳桿菌屬（Lactobacillus）與諸多樣品關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)，其次是芽孢桿菌屬（Bacillus）。BP_7濃縮液、BP_8新鮮涂布液和BP_17涂布液（放置2h的涂布液）樣品間差異最小，表明濃縮液和涂布液細(xì)菌物種及豐度最為相似。BP_9抄前漿料、BP_13二級漿料、BP_15沖漿白水、BP_18烘箱后再造煙葉、BP_19分切后再造煙葉和BP_20打包再造煙葉聚集成同一分支，說明這6種物料中細(xì)菌屬結(jié)構(gòu)差異性較小。BP_1片煙末、BP_2煙梗和BP_23上毛毯積漿距離最遠(yuǎn)，表明片煙末、煙梗和上毛毯積漿與其他樣品的細(xì)菌多樣性及豐度差異最大。

圖3 基于Bray-Curtis分析的屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)熱圖Fig.3 Heat map of sample bacterial community structure at genus level based on Bray-Curtis analysis

2.1.5 生產(chǎn)過程各物料細(xì)菌群落主成分分析

物料樣品細(xì)菌群落組間PCA分析結(jié)果如圖4所示。主要成分PC1和PC2分別占64.95%和16.12%，兩種主要成分能夠解釋81.07%的物種差異性，能很好地區(qū)分生產(chǎn)過程中各樣品的細(xì)菌群落。BP_1片煙末、BP_2煙梗和BP_23上毛毯積漿和其他樣品距離最遠(yuǎn)，表明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性最大。而BP_6離心后萃取液、BP_7濃縮液、BP_8新鮮涂布液和BP_17涂布液（放置2 h的涂布液）細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似。BP_18烘箱后再造煙葉、BP_19分切后再造煙葉和BP_20打包再造煙葉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似。PCA分析結(jié)果與2.1.4小節(jié)的熱圖結(jié)果基本一致。

圖4 不同樣品細(xì)菌屬水平群落PCA圖Fig.4 Principal component analysis of bacterial communities of different samples at genera level

2.2 再造煙葉生產(chǎn)過程真菌群落多樣性分析

2.2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

對樣品的真菌基因組ITS1區(qū)測序，經(jīng)過濾和雙端拼接后，除樣品BP_22木漿板未得到測序結(jié)果外，24個樣品共獲得了1 690 404條有效序列，平均長度為219 bp，得到665個OTU。使用UNITE真菌分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對每個OTU的代表序列進(jìn)行物種注釋，共注釋得到26個門、70個綱、157個目、281個科、165個屬和454個種水平的真菌微生物。

2.2.2 α多樣性指數(shù)分析

在97%相似性水平下，由表2可知樣品的OTU覆蓋率都在99.9%以上，說明測序結(jié)果能夠真實反映再造煙葉生產(chǎn)線的真菌多樣性情況。在各樣品中，BP_5一級擠干后萃取液的物種豐富度指數(shù)和Chao指數(shù)最高，說明一級擠干后萃取液的真菌豐度最高。BP_25再造煙葉成品（2015年）的物種豐富度指數(shù)和Chao指數(shù)最低，說明再造煙葉成品（2015年）的真菌豐度和均勻性最低。由表2可知，BP_13二級漿料和BP_18烘箱后再造煙葉的香農(nóng)指數(shù)和Inverse Simpson指數(shù)最高，說明二級漿料和烘箱后再造煙葉的真菌多樣性程度最高。其中BP_2煙梗的香農(nóng)指數(shù)和Inverse Simpson指數(shù)最低，說明煙梗的真菌多樣性程度最低。

表2 樣品真菌多樣性指數(shù)Tab.2 Fungal diversity indexes of samples

2.2.3 屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)分析

由圖5可知，樣品中主要的真菌屬有假絲酵母屬（Candida）、曲霉屬（Aspergillus）、桑帕約氏酵母（Sampaiozyma）和絲孢酵母屬（Trichosporon）。在再造煙葉生產(chǎn)過程中，優(yōu)勢菌屬相對豐度發(fā)生如下變化：煙梗經(jīng)預(yù)萃后假絲酵母屬（Candida）相對豐度從64.88%降低至36.28%，曲霉屬（Aspergillus）成為優(yōu)勢菌屬。白水和各級漿料中的優(yōu)勢菌屬為假絲酵母屬（Candida）。濃縮液調(diào)配成涂布液后，桑帕約氏酵母（Sampaiozyma）取代假絲酵母屬（Candida）成為優(yōu)勢菌屬。經(jīng)過不斷的烘干和水分的降低，再造煙葉在打包后，耐干霉菌屬（Xeromyces）占比從1.89%增加到30.08%，成為打包再造煙葉的優(yōu)勢菌屬。對于成品再造煙葉，隨著存放時間的延長，新鮮再造煙葉、再造煙葉成品（2016年）和再造煙葉成品（2015年）的真菌菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，德巴利酵母屬（Debaryomyces）相對豐度逐漸增加。

圖5 樣品在屬水平上的真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.5 Sample fungal community structure at genus level

2.2.4 基于Bray-Curtis分析的屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)熱圖

由圖6可知，假絲酵母屬（Candida）與諸多樣品關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)，其次是曲霉屬（Aspergillus）。BP_9抄前漿料與BP_13二級漿料樣品間差異性最小，即抄前漿料和二級漿料的真菌物種多樣性最為相似。BP_7濃縮液、BP_8新鮮涂布液、BP_17涂布液（放置2 h的涂布液）和BP_20打包再造煙葉聚集成同一分支，說明該4種物料中真菌物種多樣性差異性較小。由于再造煙葉成品（2016年）存在大量其他真菌屬以及再造煙葉成品（2015年）中德巴利酵母屬（Debaryomyces）有較高豐度，使得兩者與其他樣品的真菌物種多樣性差異最大。

圖6 基于Bray-Curtis的屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)熱圖Fig.6 Heat map of sample fungal community structure at genus level based on Bray-Curtis analysis

3 討論

利用高通量測序技術(shù)對再造煙葉生產(chǎn)中25個物料樣品進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)和真菌ITS序列分析，其中木漿板未得到細(xì)菌和真菌測序結(jié)果，推測原因是木漿原料為漂白針葉木漿（化學(xué)漿），其加工過程加入了較多的漂白劑，且木漿板本身營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，微生物很難存活，導(dǎo)致木漿板細(xì)菌和真菌數(shù)量極少，故沒有獲得測序結(jié)果。另外，2015年再造煙葉樣品和2016年再造煙葉樣品未獲得細(xì)菌測序結(jié)果，推測原因為再造煙葉成品存放環(huán)境密閉干燥、水活度低，不適宜大多數(shù)微生物的存活。

除片煙末、上毛毯積漿和再造煙葉成品，總體上，其他物料樣品在細(xì)菌屬水平上的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和韋榮氏球菌屬（Veillonella），在真菌屬水平上優(yōu)勢菌屬為假絲酵母屬（Candida）、曲霉屬（Aspergillus）、桑帕約氏酵母（Sampaiozyma）和絲孢酵母屬（Trichosporon），這與前人報道［8-9］的再造煙葉生產(chǎn)中物料的優(yōu)勢菌屬大體一致；部分不一致的結(jié)果如釀酒酵母屬（Kazachstania）在本研究中為非優(yōu)勢菌屬，可能原因是由不同生產(chǎn)線和生產(chǎn)原料來源導(dǎo)致的微生物差異。所有物料樣品中，片煙末中特有一個細(xì)菌優(yōu)勢屬——青枯菌屬（Ralstonia），這與汪漢成等［10］報道的利用高通量測序健康煙草植株細(xì)菌多樣性獲得的結(jié)果相符，其研究結(jié)果顯示青枯菌屬（Ralstonia）為優(yōu)勢細(xì)菌屬，相對豐度為40.61%。上毛毯積漿的優(yōu)勢細(xì)菌屬為鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium），該菌屬也為趙豐等［11］在造紙過程中發(fā)現(xiàn)的可培養(yǎng)的優(yōu)勢細(xì)菌屬之一。

從萃取到制涂布液過程中，水溶性糖含量明顯升高且滲透壓變大，而乳桿菌屬（Lactobacillus）具有兼性厭氧、耐酸糖和生長溫度范圍廣的特性，因此該過程中細(xì)菌乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度逐漸增加，而真菌假絲酵母屬（Candida）相對豐度總體逐漸降低。在抄造過程中，損紙漿和木漿攜帶的韋榮氏球菌屬（Veillonella）具有厭氧特性，因而只在制漿后的液體物料中為優(yōu)勢屬；白水經(jīng)離心凈化后，乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、韋榮氏球菌屬（Veillonella）相對豐度均有一定程度降低；漿料經(jīng)過逐步的烘干工藝變成干物料后，不耐熱微生物如乳桿菌屬（Lactobacillus）、韋榮氏球菌屬（Veillonella）、絲孢酵母屬（Trichosporon）以及鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）相對豐度降低；再造煙葉成品分切打包過程中，細(xì)菌屬和真菌屬種類、總數(shù)量和相對豐度基本保持不變。再造煙葉成品在長時間放置儲存后，由于再造煙葉本身水分含量較低以及存放環(huán)境干燥密閉，抑制了大部分微生物的生長，但兼性厭氧的德巴利酵母屬（Debaryomyces）可能由于適應(yīng)性較強(qiáng)［12］而相對豐度逐漸增加，成為再造煙葉成品樣品的主要優(yōu)勢真菌屬。由此可見，在再造煙葉的生產(chǎn)過程中，微生物種類多樣性整體呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，原因是過程物料多為固液混合物，并且營養(yǎng)物質(zhì)相對均勻和豐富，同時過程環(huán)境濕熱，有利于各類微生物的生長和繁殖，而原料和成品為固態(tài)，含水率低，存放環(huán)境相對密閉干燥，不利于微生物的生長和繁殖。

優(yōu)勢細(xì)菌屬乳桿菌屬（Lactobacillus）的大量繁殖會消耗再造煙葉中的糖類等有機(jī)質(zhì)產(chǎn)生大量乳酸，導(dǎo)致涂布液和白水腐敗變酸，從而影響再造煙葉品質(zhì)。該菌屬制約著涂布液的儲存周期和白水的循環(huán)使用次數(shù)，導(dǎo)致生產(chǎn)過程需要定期對生產(chǎn)系統(tǒng)進(jìn)行停機(jī)清洗［13］，因此采用合適的方法降低/抑制再造煙葉生產(chǎn)線乳桿菌屬（Lactobacillus）的生長繁殖對于提升生產(chǎn)中的連續(xù)性和穩(wěn)定性非常有必要。優(yōu)勢真菌屬曲霉屬（Aspergillus）在再造煙葉儲藏過程中易引起霉變［14］；同時該屬中也存在一些有利于煙草香氣提升的菌種，高文霞等［15］從煙葉中分離篩選出的一株曲霉菌Aspergillus sp.SZ14可明顯增加煙葉中有機(jī)酸和石油醚的含量從而提升煙草品質(zhì)，所以對于曲霉屬（Aspergillus）微生物可進(jìn)行針對性管控。

芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌在生產(chǎn)過程各物料樣品中均有分布，該菌屬微生物不僅具有耐高溫的特點，很多菌種還具有很強(qiáng)的酶分泌能力，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）等能分泌蛋白酶、淀粉酶、果膠酶到胞外，進(jìn)而通過降解萃取液與濃縮液中的蛋白質(zhì)、淀粉、果膠等生物大分子物質(zhì)而促進(jìn)產(chǎn)香，因而該菌屬可作為有益的微生物資源進(jìn)行挖掘利用［16-17］。

4 結(jié)論

利用高通量測序技術(shù)對再造煙葉生產(chǎn)過程中各物料樣品微生物群落多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果共檢測出393個細(xì)菌屬和165個真菌屬，各物料在加工過程中細(xì)菌屬的豐度和種類變化相對較小，而真菌屬的變化相對較大?？傮w上，物料樣品在細(xì)菌屬水平上的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和韋榮氏球菌屬（Veillonella），真菌屬水平上優(yōu)勢菌屬為假絲酵母屬（Candida）、曲霉屬（Aspergillus）、桑帕約氏酵母（Sampaiozyma）和絲孢酵母屬（Trichosporon），且在再造煙葉的生產(chǎn)過程中，微生物種類多樣性整體呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。