何曉燕，許 燦，何曉琳，郭立杰，張海叢，張向娥，葉立紅

(1. 石家莊市第二醫(yī)院，河北 石家莊 050056；2. 石家莊市第五醫(yī)院,河北 石家莊 050200)

藥物性肝損傷在臨床中是引起肝內(nèi)膽汁淤積的最常見原因。2015年《藥物性肝損傷診治指南》[1]將藥物性肝損傷分為膽管細胞損傷型、肝細胞損傷型、血管內(nèi)皮損傷型3種病理類型，其中膽管細胞損傷型主要表現(xiàn)為毛細膽管和(或)肝細胞淤膽，依據(jù)肝細胞壞死程度不同又可分為混合性肝炎(肝細胞壞死重)、淤膽性肝炎(肝細胞壞死輕)、單純性淤膽(無肝細胞壞死)。膽汁酸鹽輸出泵(BSEP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)、多藥耐藥糖蛋白3(MDR3)是肝細胞毛細膽管膜側(cè)上的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，在膽汁經(jīng)肝細胞分泌入毛細膽管過程中發(fā)揮著重要作用[2-3]，但三者在膽汁淤積性藥物性肝損傷各病理亞型中表達情況及與不同病理形態(tài)膽汁淤積之間是否存在相關(guān)性尚不明確。因此，本研究進行了相關(guān)探討，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015—2019年在石家莊市第二醫(yī)院及石家莊市第五醫(yī)院經(jīng)肝穿組織病理診斷為膽汁淤積性藥物性肝損傷的患者112例，患者均有明確用藥史，并排除膽管不全梗阻、原發(fā)性膽汁性膽管炎、原發(fā)性硬化性膽管炎、酒精性肝病、脂肪性肝炎、嗜肝及非嗜肝病毒感染及遺傳性膽汁淤積性肝病等。所有入選患者均簽署知情同意書，研究方案經(jīng)石家莊市第五醫(yī)院倫理委員會審批(SWY2020022)。

1.2研究方法 依據(jù)2015年《藥物性肝損傷診治指南》[1]中的病理分類將患者分為混合性肝炎組 40例、淤膽性肝炎組 40例、單純性淤積組32例。收集3組患者的一般資料(性別、年齡)及用藥種類，對比分析每例組織切片內(nèi)病理形態(tài)特征(毛細膽管膽栓、肝細胞淤膽、肝細胞羽毛樣變性、小膽管損傷、細膽管增生、匯管區(qū)炎癥、肝細胞壞死)及BSEP、MRP2、MDR3陽性表達情況，分析BSEP、MRP2、MDR3積分光密度值與不同病理形態(tài)評分之間的相關(guān)性。

1.2.1肝組織病理觀察及半定量評分方法 取患者肝穿組織，常規(guī)進行HE染色、網(wǎng)織+Masson染色、D-PAS、角蛋白7/角蛋白19免疫組化染色，OLYMPUS BX53顯微鏡下，由2名病理醫(yī)師共同觀察并進行病理分型。根據(jù)相關(guān)指南及文獻[4]， 選取毛細膽管膽栓、肝細胞淤膽、肝細胞羽毛樣變性、小膽管損傷、細膽管增生、肝細胞壞死6項病理形態(tài)作為觀察指標，對每項病理指標根據(jù)病變程度進行半定量評分。

1.2.2肝組織中轉(zhuǎn)運蛋白免疫組化檢測及半定量分析方法 肝穿標本石蠟切片脫蠟至水，pH 7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗5 min×3， pH 6.0枸櫞酸酸鹽緩沖液微波熱修復(fù)，高溫修復(fù)4 min，低溫修復(fù)6 min，自然冷卻，3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶25 min，直接滴加適當比例稀釋的一抗BSEP(ABCB11,鼠單克隆抗體,美國Santa Cruz公司，稀釋比例1∶500)、MRP2(ABCC2，兔單克隆抗體，美國Abcam公司，稀釋比例1∶3 000)、MDR3(ABCB4,兔多克隆抗體,美國Abcam公司，稀釋比例1∶600)，濕盒4 ℃冰箱過夜，取出放置至室溫，PBS漂洗5 min×3次，滴加酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物室溫孵育25 min，PBS漂洗5 min×3；滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(北京中杉金橋試劑公司)；切片梯度脫水、封片。并設(shè)陰陽性對照。 BSEP、MDR3、MRP2免疫組化染色以在肝細胞毛細膽管膜上出現(xiàn)棕黃色為陽性表達，無著色為陰性表達。對所有免疫組化切片進行全切片數(shù)字掃描，并經(jīng)Image-Pro Plus 6.0(IPP)圖像分析軟件進行半定量分析，通過圖像分析軟件設(shè)定統(tǒng)一選色參數(shù)，選取組織切片內(nèi)除壞死區(qū)外全部區(qū)域進行定量分析，計算BSEP、MRP2、MDR3積分光密度值。

2 結(jié) 果

2.1不同病理亞型組年齡及性別構(gòu)成情況 混合性肝炎組40例，男17例(42.5%)，女23例(57.5%)；年齡19～71(47.2±14.8)歲，其中1～20歲4例(男2例、女2例)，21～40歲14例(男8例、女6例)，41～60歲16例(男5例、女11例)，>60歲6例(男2例、女4例)。淤膽性肝炎組40例，男12例(30.0%)，女28例(70.0%)；年齡23～70(45.0±13.6)歲，其中1～20歲2例(男1例、女1例)，21～40歲15例(男7例、女8例)，41～60歲17例(男4例、女13例)，>60歲6例(均為女性)。單純性淤積組32例，男14例(43.8%)，女18例(56.2%)；年齡18～72(49.3±14.1)歲，其中1～20歲3例(男1例、女2例)，21～40歲9例(男5例、女4例)，41～60歲12例(男5例、女7例)，>60歲8例(男3例、女5例)。各病理亞型組患者總體年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，<40歲患者中男女比例比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，≥40歲患者女性均顯著多于男性，并且均以40～60歲女性最為多見。

2.2不同病理亞型組引起損傷的藥物種類 有明確用藥史的112患者中共應(yīng)用了146種藥物，致病藥物中中藥(包括中藥湯劑及中成藥)最多見，共有62例(42.5%)，主要為治療骨關(guān)節(jié)病、椎間盤疾病、骨質(zhì)疏松、風(fēng)濕病、脫發(fā)、膽結(jié)石、皮膚病等藥物；淤膽性肝炎組中中藥應(yīng)用所占比例最高達65.0%(26例)，混合性肝炎組和單純性淤積組所占比例分別為40.0%(16例)和40.6%(13例)；引起膽汁淤積性藥物性肝損傷前兩位的西藥分別為抗生素類15例(10.27%)和解熱鎮(zhèn)痛藥14例(9.59%)，其他藥物包括心血管藥10例(6.85%)、抗過敏藥5例(3.42%)、消化系統(tǒng)用藥8例(5.48%)、激素類5例(3.42%)，保健品4例(2.74%)，化學(xué)接觸8例(5.48%)。

2.3不同病理亞型組病理形態(tài)學(xué)特點 混合性肝炎組表現(xiàn)為中或重度肝細胞炎癥壞死(包括融合性壞死、橋接性壞死及多腺泡壞死)，壞死區(qū)旁見毛細膽管膽栓及肝細胞淤膽(見圖1)，匯管區(qū)炎癥浸潤明顯，伴或不伴小葉間膽管損傷；淤膽性肝炎組表現(xiàn)為輕度肝細胞炎癥壞死(包括點狀及灶狀壞死)，伴中央靜脈周圍毛細膽管膽栓和肝細胞淤膽(見圖2), 匯管區(qū)炎癥較明顯，伴或不伴小膽管小葉間損傷；單純性淤積組表現(xiàn)為中央靜脈周圍單純毛細膽管膽栓形成(見圖3)，無或極輕的肝細胞炎癥壞死，匯管區(qū)炎癥不明顯。

圖1 混合性肝炎組中央靜脈周圍融合性壞死及毛細膽管膽栓及肝細胞淤膽情況(HE，×200)

圖2 淤膽性肝炎組羽毛樣變性肝細胞及毛細膽管膽栓和肝細胞淤膽情況(HE，×200)

圖3 單純性淤積組中央靜脈周圍毛細膽管淤膽情況(HE，×200)

2.4不同病理亞型組病理形態(tài)評分比較 淤膽性肝炎組和單純性淤積組毛細膽管膽栓評分、肝細胞淤膽評分均高于混合性肝炎組，淤膽性肝炎組肝細胞羽毛樣變性評分高于單純性淤積組和混合性肝炎組，混合性肝炎組和淤膽性肝炎組小膽管損傷評分、細膽管增生評分均高于單純性淤積組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

表1 膽汁淤積性藥物性肝損傷不同病理亞型組間各項病理形態(tài)評分比較[Q2(Q1，Q3)，分]

2.5不同病理亞型組轉(zhuǎn)運蛋白表達情況 正常肝組織中BSEP、MRP2、MDR3在肝細胞毛細膽管膜側(cè)呈微管分支狀陽性表達。各病理亞型組由于肝細胞炎癥壞死造成BSEP、MRP2、MDR3表達缺失，故壞死區(qū)不作為分析觀察區(qū)域。BSEP、MRP2、MDR3在各病理亞型組肝細胞毛細膽管膜側(cè)的表達變化趨勢較一致：羽毛樣變性肝細胞(肝細胞膽鹽淤積形成)較明顯區(qū)域陽性表達均缺失，羽毛樣變性越明顯，陽性表達減少越顯著，在肝細胞淤膽區(qū)及毛細膽管淤膽區(qū)沿擴張的毛細膽管壁亦呈表達缺失或弱陽性表達，而在匯管區(qū)內(nèi)的小膽管及增生細膽管均未見BSEP、MRP2、MDR3陽性表達。見圖4～6。

圖4 混合性肝炎組MDR3在壞死區(qū)旁毛細膽管淤膽及肝細胞淤膽腫脹區(qū)表達減弱或無表達(SP法，×200)

2.6不同病理亞型組間轉(zhuǎn)運蛋白積分光密度值與不同病理形態(tài)評分關(guān)系 混合性肝炎組、淤膽性肝炎組、單純性淤積組毛細膽管膽栓評分均與MDR3積分光密度值呈中等強度負相關(guān)性(r=-0.597，P=0.021；r=-0.670，P=0.019；r=-0.706，P=0.014)，肝細胞淤膽評分均與MRP2積分光密度值呈中等強度負相關(guān)性(r=-0.634，P=0.017；r=-0.786，P=0.013；r=-0.463，P=0.026)，羽毛樣變性評分均與BSEP積分光密度值呈中等強度負相關(guān)性(r=-0.793，P=0.012；r=-0.788，P=0.013；r=-0.544，P=0.026)，小膽管損傷評分、細膽管增生評分與BSEP、MRP2、MDR3積分光密度值均無相關(guān)性。見表2。

表2 膽汁淤積性藥物性肝損傷不同病理亞型組轉(zhuǎn)運蛋白積分光密度值與病理形態(tài)評分關(guān)系

圖5 淤膽性肝炎組BSEP在羽毛樣變性肝細胞膽管膜側(cè)表達缺失，毛細膽管淤膽區(qū)表達減弱或無表達(SP法，×400)

圖6 單純性淤積組MRP2在淤膽的肝細胞毛細膽管膜側(cè)表達減少或無表達(SP法，×400)

3 討 論

肝臟是藥物轉(zhuǎn)換及代謝的重要器官，易成為藥物毒性損傷的靶器官。任何原因引起的肝細胞和膽管細胞膽汁生成、分泌障礙以及膽汁流動障礙均將導(dǎo)致膽汁淤積，故藥物性肝損傷中膽汁淤積型較常見[5]。相關(guān)研究報道，某些經(jīng)膽汁代謝轉(zhuǎn)化的藥物及其代謝產(chǎn)物可通過直接抑制肝細胞毛細膽管膜上的轉(zhuǎn)運蛋白功能或下調(diào)其表達，從而抑制膽汁分泌及膽汁酸運輸，導(dǎo)致膽汁淤積，引發(fā)高膽紅素血癥[6-7]。BSEP、MRP2、MDR3均為ATP結(jié)合盒超家族成員，其中BSEP可通過ATP的水解將膽汁酸鹽逆濃度梯度泵入毛細膽管,如果其發(fā)生基因突變，會影響蛋白功能，不能有效發(fā)揮作用，可使肝細胞內(nèi)膽汁酸蓄積，進而損傷肝細胞[8]。MRP2是ATP依賴的有機陰離子重要轉(zhuǎn)運體，主要負責轉(zhuǎn)運膽紅素、多價有機陰離子等，也是唯一將結(jié)合膽紅素從肝細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運至毛細膽管內(nèi)的轉(zhuǎn)運蛋白[9-10]。Kiguchi等[11]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，當MRP2向胞漿轉(zhuǎn)運及在肝細胞膽管膜定位減少時，將造成肝細胞毛細膽管膜上的膽汁酸鹽分泌障礙，從而引起肝內(nèi)膽汁淤積。MDR3為肝細胞膽管膜側(cè)的卵磷脂轉(zhuǎn)運蛋白，負責磷脂的轉(zhuǎn)運，其可將磷脂由具雙分子層結(jié)構(gòu)的肝細胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)運至細胞膜外，并與膽汁酸鹽等混合形成微粒，防止膽汁酸鹽損傷膽管上皮細胞；MDR3表達減少時會影響磷脂轉(zhuǎn)運，使膽汁中的卵磷脂含量降低，進而使膽汁中的膽汁酸鹽不易形成微膠顆粒，從而降低膽固醇的溶解度[12]，導(dǎo)致毛細膽管破壞損傷，并易于形成膽栓。

本研究膽汁淤積性藥物性肝損傷各亞型組患者年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，均集中在40～60歲中老年人。Bolesterli等[13]研究認為遺傳學(xué)線粒體異常增加了肝毒素的敏感性，可能和年齡相關(guān)，使高齡患者藥物性肝損傷的危險度增加，此外與高齡人群更多患有基礎(chǔ)性疾病，藥物應(yīng)用劑量更大、種類更復(fù)雜有關(guān)。各亞型組不同年齡段性別構(gòu)成情況顯示，40歲以下患者男女比例差別不明顯，但40歲以上者均女性明顯多于男性，可能與女性生理條件下肝藥物代謝酶數(shù)量與活性低于男性，導(dǎo)致女性對某些藥物更敏感有關(guān)[14]。在本研究中，中藥及西藥所致膽汁淤積性藥物性肝損傷各約占一半，提示中藥引起的膽汁淤積性藥物性肝損傷不容忽視，要規(guī)范應(yīng)用，注意藥物的炮制及提純；西藥中解熱鎮(zhèn)痛藥及抗生素的應(yīng)用需引起關(guān)注，要定期監(jiān)測肝生化指標。

本研究中發(fā)現(xiàn)，淤膽性肝炎組及混合性肝炎組病理形態(tài)表現(xiàn)為肝細胞不同程度的壞死脫失，淤膽肝細胞明顯腫脹、羽毛樣變性，毛細膽管膽栓形成，匯管區(qū)不同程度炎癥浸潤，有的小膽管變性脫失；單純性淤積組病理形態(tài)特點較簡單，肝實質(zhì)無或輕微肝細胞壞死，僅表現(xiàn)為小葉中央靜脈周圍單純毛細膽管淤膽，匯管區(qū)炎癥不明顯。同時，不同病理形態(tài)下轉(zhuǎn)運蛋白的表達不同，在羽毛樣變性肝細胞(肝細胞膽鹽淤積形成)及腫脹變性較明顯區(qū)域，BESP無陽性表達，且病變越明顯，BSEP 陽性表達越低，二者呈中等強度負相關(guān)，表明負責膽鹽代謝的BSEP功能障礙可引起肝細胞羽毛樣變性；不同病理亞型組中，肝細胞淤膽區(qū)MRP2均在擴張的毛細膽管壁呈弱表達或表達缺失，肝細胞淤膽與MRP2表達呈中等強度負相關(guān)，進一步證實MRP2是負責膽色素代謝的重要轉(zhuǎn)運體，其功能障礙可引起肝細胞淤膽；不同病理亞型組中，毛細膽管淤膽區(qū)MDR3在擴張的毛細膽管壁呈弱表達或表達缺失，毛細膽管淤膽均與MDR3表達呈中等強度負相關(guān)，證實MDR3功能障礙將減少卵磷脂轉(zhuǎn)運，易于形成毛細膽管膽栓。上述結(jié)果提示，由于不同轉(zhuǎn)運蛋白表達的強弱不同，從而引起不同的病理形態(tài)特點，但是每種轉(zhuǎn)運蛋白在各病理亞型組的表達強弱較一致，提示藥物性肝損傷可同時損傷到肝細胞毛細膽管膜上的3種轉(zhuǎn)運蛋白，不像遺傳性膽汁淤積性肝病為單純某一個轉(zhuǎn)運蛋白表達異常。相關(guān)性分析還顯示，小膽管損傷及細膽管增生與BSEP、MRP2、MDR3無相關(guān)性，考慮匯管區(qū)內(nèi)小膽管損傷主要與匯管區(qū)內(nèi)炎癥程度相關(guān)，細膽管增生則與匯管區(qū)內(nèi)炎癥程度及小膽管損傷程度有關(guān)，進而表明由于BSEP、MRP2、MDR3均為負責肝細胞膽汁排泌的轉(zhuǎn)運蛋白，并不影響匯管區(qū)內(nèi)小膽管及細膽管的損傷或增生。

綜上所述，藥物引起的膽汁淤積發(fā)生機制非常復(fù)雜，跨膜轉(zhuǎn)運蛋白BSEP、MRP2、MDR3表達異常是重要因素之一。了解轉(zhuǎn)運蛋白在膽汁淤積性藥物性肝損傷中的表達特點及與病理形態(tài)之間的對應(yīng)關(guān)系，可為解釋膽汁淤積及膽管損傷的形態(tài)特點提供依據(jù)，并有助于明確損傷位點，為臨床合理選擇治療藥物及判斷預(yù)后提供客觀依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。