陳占玉，黃永亮，王維民，李 沖，王國(guó)秀，李明月

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

熱休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）是由機(jī)體受損、受寒、紫外線(xiàn)暴露、組織修復(fù)等各種應(yīng)激誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白［1］。該蛋白由Ritossa 于1962年在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，直至1974 年經(jīng)Tissieres 證實(shí)并命名。HSPs 按大小可分為五大類(lèi)，分別為HSP110（90-110KDa）、HSP90（83-90KDa）、HSP70（68-78KDa）、HSP60（40-60KDa）以及sHSP（12-34 KDa）［2］。HSPs 廣泛存在于從低等生物到高等動(dòng)物的機(jī)體中，當(dāng)生物有機(jī)體暴露于高溫時(shí)，就會(huì)由熱激發(fā)合成HSPs 來(lái)保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受熱損傷［3］。除高溫環(huán)境以外，其他應(yīng)激源如缺氧、嚴(yán)寒、中毒等惡劣環(huán)境也能誘發(fā)機(jī)體細(xì)胞生成HSPs，從而幫助每個(gè)細(xì)胞維持正常的生理活動(dòng)，阻截影響細(xì)胞健康的蛋白質(zhì)相互作用。也有研究發(fā)現(xiàn)，HSPs對(duì)維持綿羊心臟的正常功能也有重要作用［4］。

HSPA1L（heat shock protein family A member 1 like）是HSP70 蛋白中的一員，HSP70 是HSP 家族中穩(wěn)定性最高含量最多的一類(lèi)蛋白［5］。HSPA1L 與HSPA1A、HSPA1B 都屬于HSP70 家族中的編碼蛋白質(zhì)基因，HSPA1L 基因編碼蛋白有90%的氨基酸序列與HSP70 家族一致。HSP70 作為重要的應(yīng)激蛋白，在保護(hù)細(xì)胞免于凋亡、氧化損傷和基因損傷中起著關(guān)鍵作用［6］。由于HSPA1L 基因是編碼HSP70 的3 個(gè)基因之一，所以HSPA1L 基因?qū)d羊抗應(yīng)激和免疫功能也極為重要。但HSP70 增強(qiáng)耐熱力的作用機(jī)制模糊，如何通過(guò)技術(shù)措施誘導(dǎo)HSP70 基因在局部合理表達(dá)以提高免疫效率仍需進(jìn)一步研究［7］。

目前針對(duì)HSPA1L 基因的研究集中在人類(lèi)醫(yī)學(xué)方面，有研究表明HSPA1L 編碼蛋白與細(xì)胞損傷、腫瘤干細(xì)胞樣特性和精子質(zhì)量等有關(guān)［8］。綿羊雖然有較強(qiáng)的耐受性和抗逆能力，但熱適應(yīng)性較差，溫度過(guò)高會(huì)對(duì)其健康和生長(zhǎng)造成影響，如誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激、降低干物質(zhì)的采食量、損害腸道組織等［9］，目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)綿羊HSPA1L基因的理論研究和生物信息學(xué)分析極少，缺乏實(shí)質(zhì)性的參考信息。我們用生物信息學(xué)方法和程序軟件對(duì)綿羊HSPA1L 基因的開(kāi)放閱讀框、蛋白質(zhì)親/疏水性、基因基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)HSPA1L 基因的初級(jí)和高級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)和亞細(xì)胞定位，旨在對(duì)綿羊的抗熱應(yīng)激和免疫等方面的研究提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列來(lái)源

從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)了綿羊HSPA1L 基因的mRNA 序列（登錄號(hào)：XM_027958817.2），該序列來(lái)自愛(ài)荷華大學(xué)綿羊全基因組鳥(niǎo)槍測(cè)序（WGS）項(xiàng)目及綿羊基因組功能注釋計(jì)劃項(xiàng)目，綿羊品種為蘭布萊綿羊（Rambouillet）。同時(shí)下載了除綿羊以外的其他11 個(gè)物種的HSPA1L 基因編碼蛋白質(zhì)序列（表1）。

表1 12 個(gè)物種的HSPA1L 基因編碼蛋白質(zhì)序列

1.2 研究方法

綿羊HSPA1L 基因開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF）采用NCBI 的ORF Finder 程序分析（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）。采用Bioedit軟件預(yù)測(cè)HSPA1L 基因編碼產(chǎn)物的基本理化性質(zhì)（https：//www.expasy.org/resources/protparam）。蛋白親疏水性采用ProtScale 工具進(jìn)行分析（http：//ca.expasy.org/tools/protscale.html）。蛋白潛在信號(hào)肽預(yù)測(cè)采用SignalP 方法分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)采用PSORT 方法預(yù)測(cè)（https：//psort.hgc.jp/form2.html）?？缒ぢ菪齾^(qū)域的預(yù)測(cè)采用TMHMM Server v.2.0 程序分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）。采用DNAMAN 軟件對(duì)多序列比對(duì)和同源性分析進(jìn)行預(yù)測(cè)。HSPA1L 基因的保守結(jié)構(gòu)域采用網(wǎng)站分析http：//smart.embl-heidelberg.de/。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)采用Jpred 軟件分析，三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)使用SWISS-MODEL 在線(xiàn)工具進(jìn)行分析（https：//www.swissmodel.expasy.org/）。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊HSPA1L 基因開(kāi)放閱讀框分析

開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF）是一段可編碼蛋白質(zhì)中間無(wú)終止序列打斷，從啟動(dòng)子到終止子的堿基序列，通過(guò)識(shí)別ORF 可以快速識(shí)別出基因序列中的編碼區(qū)域［10］。從ORF 分析結(jié)果可以看出（圖1），序列中共識(shí)別的綿羊HSPA1L 基因有20 個(gè)ORF，其中最大長(zhǎng)度的ORF 有1 926 bp，推測(cè)其編碼641 個(gè)氨基酸殘基。

圖1 綿羊HSPA1L 基因序列的ORF 分析

2.2 綿羊HSPA1L 基因蛋白基本理化性質(zhì)分析

蛋白質(zhì)基本性質(zhì)主要包括氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)［11-13］。本文采用Bioedit 軟件預(yù)測(cè)綿羊HSPA1L 基因編碼蛋白質(zhì)的理化特性并分析該基因編碼產(chǎn)物的氨基酸組成，結(jié)果顯示（表2），綿羊HSPA1L 基因可編碼641 個(gè)氨基酸，其中Ala 的比例最高，為9.0%；含量最少的是Trp，為0.3%。負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為89，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為83，分子式為C3094H4985N859O969S20，理論等電點(diǎn)pI 為5.89，不穩(wěn)定指數(shù)為32.56。

表2 綿羊HSPA1L 基因編碼產(chǎn)物的氨基酸組成

2.3 綿羊HSPA1L 基因蛋白質(zhì)親/疏水性分析

蛋白質(zhì)的親疏水性取決于氨基酸序列，一般高度易溶的蛋白質(zhì)袒露在最外側(cè)的都為親水蛋白，最內(nèi)側(cè)的都為疏水蛋白［14］。采用ProtScale 程序分析綿羊HSPA1L 基因編碼蛋白質(zhì)的親/ 疏水性分析，（圖2）表明，綿羊HSPA1L 基因編碼蛋白的疏水性最大值為2.211（第397 位），最小值為-3.056（第250 位），故綿羊HSPA1L 基因編碼的蛋白是親水蛋白。

圖2 綿羊HSPA1L 基因蛋白質(zhì)親/疏水性分析

2.4 編碼蛋白質(zhì)的信號(hào)肽預(yù)測(cè)

信號(hào)肽序列是分布在分泌蛋白基因的編碼序列中的位于起始密碼子之后的一段含有較多疏水氨基酸多肽的序列［15］。綿羊HSPA1L 基因編碼產(chǎn)物的C 值為0.088，Y 值為0.114，S 值為0.515（圖3）。表明綿羊HSPA1L 基因的編碼產(chǎn)物不存在信號(hào)肽。

圖3 綿羊HSPA1L 基因蛋白潛在信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

2.5 綿羊HSPA1L 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

采用PSORT 方法預(yù)測(cè)綿羊HSPA1L 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位。綿羊HSPA1L 蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)中的可能性是69.6%，在細(xì)胞核內(nèi)的可能性是26.1%，在線(xiàn)粒體中為4.3%（表3）。表明綿羊HSPA1L 基因在細(xì)胞核中發(fā)揮的作用較小，主要是在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物學(xué)作用。

表3 綿羊HSPA1L 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析

2.6 綿羊HSPA1L 基因跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

應(yīng)用TMHMM Server v.2.0 程序分析了綿羊HSPA1L 基因的信號(hào)肽，結(jié)果顯示（圖4），綿羊HSPA1L 基因編碼產(chǎn)物沒(méi)有跨膜區(qū)。

圖4 綿羊HSPA1L 基因跨膜螺旋結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.7 多序列比對(duì)和同源性分析

HSPA1L 基因在很多物種中均有表達(dá)。本文采用DNAMAN 軟件對(duì)水牛、人、普通牛、綿羊、豬、狗、猴、馬、兔子、小鼠、山羊和貓的HSPA1L 蛋白多序列進(jìn)行比對(duì)的結(jié)果顯示（圖5），HSPA1L 基因在以上12 個(gè)物種中都有表達(dá)，且綿羊與普通牛和豬的HSPA1L 氨基酸序列同源性最高，說(shuō)明綿羊與普通牛和豬在進(jìn)化過(guò)程中有較近的親緣關(guān)系。由HSPA1L 編碼產(chǎn)物的同源樹(shù)可以證明，在分析選擇的12 個(gè)物種中，綿羊與普通牛和豬的同源性最高（圖6）。

圖5 12 個(gè)物種的HSPA1L 基因編碼產(chǎn)物的同源樹(shù)

圖6 12 個(gè)物種的HSPA1L 基因編碼序列的同源性分析

2.8 綿羊HSPA1L 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

采用Smart 軟件分析HSPA1L 蛋白保守結(jié)構(gòu)域，綿羊HSPA1L 蛋白包含2 個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別位于370～380 和393～405 位，均為低復(fù)雜性結(jié)構(gòu)域（lowcomplexity domain）（圖7）。

圖7 綿羊HSPA1L 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

2.9 綿羊HSPA1L 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是2 條核苷酸鏈反向平行盤(pán)繞所生成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。采用Jpred 軟件對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)，綿羊HSPA1L 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲（Cc）占58.81%，為綿羊HSPA1L 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分；其次是α-螺旋（Hh），占比28.86%；β-折疊（Ee）占比最少，為12.32%（圖8）。

圖8 綿羊HSPA1L 基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.10 綿羊HSPA1L 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析

蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤(pán)繞折疊所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。使用SWISS-MODEL 在線(xiàn)工具對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示（圖9），HSPA1L 基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)中主要由無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。

圖9 綿羊HSPA1L 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析

3 結(jié)論與討論

本研究分析結(jié)果表明，綿羊HSPA1L 基因最長(zhǎng)ORF 有1 926 個(gè)bp，其編碼產(chǎn)物穩(wěn)定，編碼的蛋白以親水性區(qū)域?yàn)橹?，是一種易溶的弱酸性蛋白質(zhì)，不存在信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物學(xué)作用。與普通牛、和豬的同源性最高，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)地位的都是無(wú)規(guī)則卷曲，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。

有研究表明，熱休克蛋白1L（HSPA1L）是一種免疫性和保守性較強(qiáng)的蛋白［16］。通過(guò)生物信息學(xué)分析可知，綿羊HSPA1L 基因序列中最大長(zhǎng)度的ORF 有1 926 個(gè)bp，可編碼641 個(gè)氨基酸殘基，呈弱酸性，較穩(wěn)定，屬于親水蛋白且不存在信號(hào)肽。哺乳動(dòng)物在熱應(yīng)激條件下，熱休克細(xì)胞中的許多核蛋白會(huì)變的不可溶并成為基質(zhì)的一部分，而在應(yīng)激過(guò)程中合成的HSP70蛋白可向細(xì)胞核遷移，加速細(xì)胞核熱休克的應(yīng)激恢復(fù)［17］。本研究表明，HSPA1L 基因編碼蛋白穩(wěn)定性較強(qiáng)，二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)地位的都是無(wú)規(guī)則卷曲，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜。較強(qiáng)的穩(wěn)定性和在結(jié)構(gòu)上較高的保守性，是其在熱應(yīng)激條件下保持結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的分子基礎(chǔ)。本研究還證實(shí)，HSPA1L 編碼蛋白屬于親水蛋白。有研究表明熱應(yīng)激條件下HSP70 蛋白以親水的方式結(jié)合到基質(zhì)上在細(xì)胞核集中，以修復(fù)基質(zhì)上變性的核蛋白［18］。

HSPA1L 基因主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，基因編碼產(chǎn)物沒(méi)有跨膜區(qū)。有研究表明，正常生理狀態(tài)下HSPs 主要存在于細(xì)胞質(zhì)中［19］，這與本研究一致。雖然細(xì)胞核對(duì)熱更加敏感，但本文研究顯示，綿羊HSPA1L 蛋白分布于細(xì)胞核的可能性?xún)H為26.1%，而在細(xì)胞質(zhì)中可能性高達(dá)69.6%，原因在于HSP70 中的HSPA9 蛋白是一個(gè)主要的線(xiàn)粒體伴侶蛋白，可通過(guò)線(xiàn)粒體的雙層膜將細(xì)胞核中的HSPA1L 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，從而使細(xì)胞質(zhì)中HSPA1L 基因表達(dá)更加明顯［20］。由于熱休克蛋白基因具有高度應(yīng)激性和高表達(dá)性，在應(yīng)激源刺激下HSPA1L 基因有可能在細(xì)胞質(zhì)中快速表達(dá)合成。應(yīng)激條件下，HSP70 蛋白會(huì)迅速?gòu)募?xì)胞質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞核和核仁，而應(yīng)激恢復(fù)期，又迅速?gòu)钠渌M織返回細(xì)胞質(zhì)［17］。

在不同物種間綿羊與普通牛和豬的HSPA1L基因同源性最高為100%，這說(shuō)明在進(jìn)化過(guò)程中它們?cè)谠摶蛏暇哂休^近的親緣關(guān)系。但綿羊與山羊HSPA1L 基因同源性相對(duì)較低。綿羊與山羊的物種親緣關(guān)系較近，但生活環(huán)境和適應(yīng)性有較大差異，山羊的熱適應(yīng)性更強(qiáng)。這有可能是環(huán)境差異導(dǎo)致的自然選擇過(guò)程中HSPA1L 基因在進(jìn)化中出現(xiàn)了變異，但具體的進(jìn)化機(jī)制，以及差異位點(diǎn)對(duì)該基因在抗熱應(yīng)激中發(fā)揮的作用和機(jī)理的影響仍需研究。

HSPA1L 基因作為編碼HSP70 蛋白的基因，有可能對(duì)綿羊在熱耐力形成過(guò)程中維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用，并對(duì)綿羊在各種環(huán)境應(yīng)激條件下的適應(yīng)性具有重要影響［10］。以HSPA1L基因作為綿羊抗應(yīng)激能力的分子標(biāo)記選育開(kāi)展分子標(biāo)記輔助選育，有可能加快綿羊育種進(jìn)程，改善綿羊的適應(yīng)性，減少生產(chǎn)中降低應(yīng)激，提高效益，節(jié)約成本，從而推動(dòng)養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。然而，HSPA1L 基因編碼蛋白的生物學(xué)功能、表達(dá)調(diào)控以及HSPA1L 基因多態(tài)性與綿羊健康與生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。