楊春鈺，李洪欣，相金汛，武井昕，時(shí)勝男

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116081)

0 引 言

面對突如其來的新冠肺炎疫情，全國人民上下一心共同奮戰(zhàn)，國內(nèi)疫情已得到基本控制。在本次抗擊疫情的過程中，預(yù)防性消毒工作被公眾廣泛重視。開展預(yù)防性消毒可以切斷病毒的傳播，含氯消毒劑因其能切斷病源傳播的特性而被廣泛應(yīng)用，尤其是84消毒劑。這些含氯消毒劑不可避免的通過生活污水和工業(yè)廢水流入污水處理廠，導(dǎo)致污水中余氯含量大幅提高。眾所周知，余氯主要包括氯氣、次氯酸、次氯酸鹽離子以及游離的次氯酸單體，具有改變微生物細(xì)胞膜通透性的作用，并能進(jìn)入微生物細(xì)胞質(zhì)中使蛋白質(zhì)變性，破壞微生物的酶系統(tǒng)，從而起到抑制微生物生長或殺死微生物的作用[1]。因此，含氯消毒劑的大量使用對活性污泥處理效能是否產(chǎn)生影響成為研究的熱點(diǎn)問題。

84消毒劑的主要成分為次氯酸鈉。李渭印等以次氯酸鈉為消毒劑，考察其對活性污泥降解性能的影響，當(dāng)次氯酸鈉濃度為0.5 mg/L時(shí)，對活性污泥的活性基本沒有影響，但當(dāng)次氯酸鈉濃度為0.5～3 mg/L時(shí)，則會抑制活性污泥對氨氮的降解[2]。陳琳風(fēng)等探究了高濃度次氯酸鈉對活性污泥系統(tǒng)中微生物的影響，結(jié)果表明當(dāng)次氯酸鈉濃度為15 mg/L時(shí)，能顯著殺滅亞硝酸鹽氧化菌，進(jìn)而抑制硝化和反硝化活性，并且胞外聚合物(EPS)總含量降低了15.48%[3]。以上研究表明，一定濃度的84消毒劑會抑制活性污泥的活性，但關(guān)于其對活性污泥效能的影響，缺乏系統(tǒng)的研究，同時(shí)84消毒劑的濃度閾值未見報(bào)道。

本研究以SBR體系為對象，系統(tǒng)考察了不同濃度的84消毒劑對活性污泥處理含酚廢水效能的影響，確定濃度閾值，并通過毒理學(xué)特性分析及胞外聚合物(EPS)結(jié)構(gòu)與功能分析，揭示了84消毒液的毒性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 污泥來源及進(jìn)水水質(zhì)

反應(yīng)器活性污泥(AS)取自大連市春柳河污水處理廠二沉池。本實(shí)驗(yàn)廢水為人工配制污水，進(jìn)水水質(zhì)為：(NH4)2SO42.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，Na2HPO43.3 g/L，苯酚濃度為600 mg/L，水質(zhì)指標(biāo)COD理論值為1 563 mg/L。84消毒劑有效氯含量為4%～6%。

1.2 反應(yīng)體系的構(gòu)建及運(yùn)行參數(shù)

取6個(gè)干凈的錐形瓶(250 mL)，分別加入100 mL的泥水混合物以構(gòu)建批式搖瓶實(shí)驗(yàn)，混合液懸浮固體濃度(MLSS)為4.5 g/L，污泥沉降比(SV30)為21%，污泥體積指數(shù)(SVI)為46.7 mL/g。根據(jù)投加的84消毒劑(有效氯)濃度將搖瓶分別命名為C1體系(0)、C2體系(1 mg/L)、C3體系(2 mg/L)、C4體系(3 mg/L)、C5體系(4 mg/L)和C6體系(5 mg/L)，將各搖瓶置于30 ℃，150 r/min的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。在反應(yīng)體系運(yùn)行24 h內(nèi)，每隔2 h取樣測定苯酚降解效率，在運(yùn)行到24 h時(shí)測定各體系中相關(guān)酶活性、ATP、ROS、LDH及EPS含量。

1.3 分析方法

1.3.1 苯酚降解率的測定

使用METASH UV-5800紫外-可見分光光度計(jì)(中國，上海)在苯酚特征峰吸收峰269 nm下進(jìn)行測定。

1.3.2 脫氫酶(DHA)活性的測定

采用TTC-脫氫酶活性法進(jìn)行測定[4]。

1.3.3 苯酚羥化酶(PHO)和鄰苯二酚2,3-雙加氧酶(C23O)活性的檢測

C23O和PHO活性測定參照文獻(xiàn)[5]。

1.3.4 ATP含量的檢測

采用ATP含量檢測試劑盒，并按照說明書進(jìn)行ATP含量的檢測。

1.3.5 ROS和LDH的檢測

采用ROS檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。采用LDH檢測試劑盒按照說明書檢測體系內(nèi)LDH的釋放。

1.3.6 EPS相關(guān)測定

蛋白質(zhì)濃度和多糖濃度分別采用考馬斯亮藍(lán)法和蒽酮-濃硫酸法[6]。

1.3.7 3D-EEM表征

熒光光譜儀的掃描條件如下：激發(fā)波長(Ex)范圍為240～480 nm，發(fā)射波長(Em)范圍250～580 nm，夾縫均為10 nm，掃描速度為2 400 nm/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度的84消毒劑對SBR體系中苯酚降解效率的影響

各活性污泥體系中苯酚的降解情況如圖1所示，C3體系的苯酚降解效率在8 h內(nèi)達(dá)到了100.0%，均高于C1體系(96.2%)、C2體系(98.2%)、C4體系(95.4%)、C5體系(92.6%)和C6體系(88.9%)。從圖1中可以看出，在反應(yīng)運(yùn)行8 h內(nèi)，C1、C2和C3的苯酚降解效率隨84消毒劑濃度的增大而增大，C4、C5和C6中的苯酚降解效率隨84消毒劑濃度的增大而降低。該結(jié)果表明低濃度的84消毒劑(小于2 mg/L)對SBR體系中苯酚的降解有促進(jìn)的作用，而高濃度的84消毒劑(大于2 mg/L)則會抑制活性污泥體系中苯酚的降解。有研究表明強(qiáng)氧化劑能夠?qū)⒈椒友趸癁橐妆晃⑸锝到獾奈镔|(zhì)，促進(jìn)微生物對苯酚的降解[7]。

圖1 不同濃度的84消毒劑對SBR體系中苯酚降解率的影響Fig.1 The effects of different concentrations of 84 disinfectanton the degradation rate of phenol in the SBR system

因此，當(dāng)84消毒劑濃度小于2 mg/L時(shí)，會促進(jìn)苯酚廢水的降解，可能歸因于84消毒劑將苯酚氧化為易被微生物降解的物質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)苯酚降解效率的提高。當(dāng)84消毒劑濃度大于2 mg/L時(shí)，可能由于其生物毒性大于其促進(jìn)效果，進(jìn)而抑制苯酚廢水的降解。

2.2 不同濃度的84消毒劑對SBR體系中DHA活性和ATP含量的影響

TCA循環(huán)和氧化磷酸化是生物化學(xué)的基本過程，通過這兩個(gè)過程，微生物可以在有氧的條件下對有機(jī)化合物進(jìn)行代謝分解，所以可以利用DHA活性和ATP含量來表達(dá)微生物的生物降解能力[9-10]。如圖2(a)所示，以C1體系中DHA的活性為100.0%，C2和C3體系中DHA活性隨84消毒劑濃度的增大而增大，而C4、C5和C6體系中DHA活性隨84消毒劑濃度的升高而降低，即C3體系最高(108.0%),其次是C2體系(103.4%)、C4體系(99.0%)和C5體系(95.5%)，C6體系中DHA的活性最低(89.0%)。以上結(jié)果表明，當(dāng)84消毒劑濃度小于2 mg/L時(shí)，84消毒劑對活性污泥DHA活性具有促進(jìn)作用，從而提升活性污泥體系中苯酚的降解效率；當(dāng)84消毒劑濃度大于2 mg/L 時(shí)，84消毒劑對活性污泥體系中DHA的活性起抑制作用，導(dǎo)致活性污泥體系中苯酚的降解效率逐漸降低。

如圖2(b)所示，各體系中ATP含量的變化與DHA活性的變化趨勢一致。以C1體系中的ATP含量為100.0%，C2和C3體系中ATP含量隨84消毒劑濃度的升高而升高，而C4、C5和C6體系中ATP含量隨84消毒劑濃度的升高而降低，即C3體系最高(109.2%)，其次是C2體系(104.3%)、C4體系(96.6%)、C5體系(88.1%)，C6體系中ATP的含量最低(75.6%)。以上結(jié)果表明，當(dāng)84消毒劑濃度小于2 mg/L時(shí)，84消毒劑對活性污泥中ATP的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用，進(jìn)而促進(jìn)苯酚的降解；而當(dāng)84消毒劑濃度大于2 mg/L時(shí)，84消毒劑活性污泥體系中ATP含量逐漸降低，進(jìn)而抑制苯酚的降解。

圖2 不同濃度的84消毒劑對SBR體系中DHA活性和ATP含量的影響Fig.2 The effects of different concentrations of 84 disinfectant on DHA activity and ATP content in the SBR system

2.3 不同濃度的84消毒劑對SBR體系中PHO和C23O活性的影響

微生物對苯酚的降解途徑需要兩個(gè)關(guān)鍵酶PHO和C23O，因此本研究通過檢測兩者的活性來表達(dá)微生物對苯酚的降解能力[8]。各體系PHO活性的變化情況如圖3(a)所示，以對照組(C1體系)為100%，C2和C3體系中的PHO活性隨84消毒劑濃度的升高而升高，從100.0%提高至111.4%，而C4、C5和C6體系中的PHO活性隨84消毒劑濃度的升高而降低，從111.4%降低至74.4%。

從圖3(b)中可以看出，各體系中C23O活性的變化與PHO活性的變化趨勢一致。C2和C3體系中的C23O活性隨84消毒劑濃度的增大而增大，從100.0%提高至109.1%。而C4、C5和C6體系中的C23O活性隨84消毒劑濃度的升高而降低，從109.1%降低至77.0%。以上結(jié)果說明，低濃度的84消毒劑(小于2 mg/L)對活性污泥PHO和C23O活性有促進(jìn)作用，而對于高濃度的84消毒劑(大于2 mg/L)，其毒性作用會使活性污泥體系中PHO和C23O的活性降低，進(jìn)而對體系中苯酚的降解效率起到抑制作用。

圖3 不同濃度的84消毒劑對SBR體系中PHO和C23O活性的影響Fig.3 The effects of different concentrations of 84 disinfectant on the activities of PHO and C23O in the SBR system

2.4 不同濃度的84消毒劑對SBR體系中ROS產(chǎn)生和LDH釋放的影響

正常情況下，微生物細(xì)胞內(nèi)ROS的含量較低，容易被中和。然而，當(dāng)微生物受到外部刺激時(shí)，便會產(chǎn)生大量的ROS，如果ROS在細(xì)胞中大量累積，會促使微生物細(xì)胞因發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)而使得細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重氧化損傷[11-12]。ROS還可能攻擊細(xì)胞質(zhì)膜上的不飽和磷脂，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化而損傷細(xì)胞膜。除此之外，胞內(nèi)ROS大量積累會損傷單鏈DNA，進(jìn)而影響微生物合成核酸、蛋白質(zhì)等生理生化反應(yīng)的正常運(yùn)行[13]。如圖4(a)所示，以C1體系中的ROS含量為100.0%，在C1、C2和C3體系中ROS含量無明顯變化(均為100.0%)，說明84消毒劑濃度小于2 mg/L時(shí)未引起微生物細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，未對微生物細(xì)胞產(chǎn)生毒害；而C4、C5和C6體系中ROS含量隨84消毒劑濃度的升高而升高(C4：103.6%、C5：119.6%、C6：188.9%)，尤其C6體系中ROS含量急劇升高至188.9%，說明高濃度的84消毒劑(大于2 mg/L)會引起微生物細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，對活性污泥體系中微生物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，進(jìn)而影響活性污泥體系的生理功能及理化性質(zhì)。

圖4 不同濃度的84消毒劑對SBR體系中ROS產(chǎn)生和LDH釋放的影響Fig.4 The effects of different concentrations of 84 disinfectant on ROS production and LDH release in the SBR system

LDH是一種胞內(nèi)酶，既可以用LDH來反映微生物細(xì)胞膜的完整情況，也可以用其表達(dá)微生物細(xì)胞的毒性情況[14]，因此，本研究分別檢測各反應(yīng)體系中LDH的釋放量。如圖4(b)所示，以C1體系中的LDH釋放量為100.0%，C1、C2和C3體系LDH釋放量無明顯變化(均為100.0%)，說明84消毒劑濃度小于2 mg/L時(shí)未對微生物細(xì)胞膜造成破壞，對微生物細(xì)胞幾乎沒有毒性；C4、C5、C6體系中LDH釋放量隨84消毒劑濃度的升高而升高(C4：106.0%、C5：124.0%、C6：181.0%)，尤其C6體系中LDH釋放量急劇升高，達(dá)到181.0%，說明高濃度的84消毒劑(大于2 mg/L)會破壞微生物細(xì)胞膜，導(dǎo)致LDH的釋放，進(jìn)而對活性污泥體系的生理功能及理化性質(zhì)產(chǎn)生影響。

2.5 不同濃度的84消毒劑對SBR體系中EPS含量的影響

EPS是一種有機(jī)高分子聚合物，其主要成分為蛋白質(zhì)(PN)和多糖(PS)。當(dāng)外界有毒有害物質(zhì)刺激微生物細(xì)胞時(shí)，微生物分泌的EPS會包裹在細(xì)胞外起保護(hù)作用[15]。因此，本研究分別檢測不同濃度84消毒劑投加后EPS的含量。各體系的EPS中PN和PS含量如圖5所示，C3體系中的PN和PS含量最低(PN：99.9 mg/L，PS：187.9 mg/L)，其次是C2體系(PN：112.4 mg/L，PS：196.6 mg/L)、C3體系(PN：113.9 mg/L，PS：199.1 mg/L)、C4體系(PN：114.3 mg/L，PS：203.5 mg/L)、C5體系(PN：127.8 mg/L，PS：209.8 mg/L)和C6體系(PN：160.6 mg/L，PS：274.8 mg/L)。綜上所述，當(dāng)84消毒劑濃度小于2 mg/L時(shí)，EPS中PN和PS含量隨84消毒劑濃度的升高而降低，有研究表明EPS中PN和PS的合成與ATP有關(guān)[16]。因此，推測EPS含量下降的原因可能是低濃度84消毒劑(小于2 mg/L)增加了活性污泥的代謝活性，促使蛋白質(zhì)和多糖被活性污泥利用，進(jìn)而降低EPS含量[17]；而當(dāng)84消毒劑濃度大于2 mg/L 時(shí)，EPS中PN和PS含量隨著84消毒劑濃度的升高而增多，說明高濃度的84消毒液(大于2 mg/L)會對活性污泥中的微生物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，從而刺激微生物釋放更多的EPS來保護(hù)自身細(xì)胞，以減輕84消毒劑的毒害作用。

圖5 不同濃度的84消毒劑對SBR體系中EPS中蛋白質(zhì)和多糖含量的影響Fig.5 The effects of different concentrations of 84 disinfectant on the contents of PN and PS in EPS in the SBR system

2.6 不同濃度的84消毒劑對SBR體系中EPS結(jié)構(gòu)的影響

本研究利用3D-EEM光譜法進(jìn)一步分析了不同濃度的84消毒劑對EPS中有機(jī)成分的影響。如圖6所示，各SBR體系中EPS均有兩個(gè)顯著特征熒光峰A(Ex/Em=295/350 nm)和B(Ex/Em=350/450 nm)，熒光峰A代表溶解性微生物代謝蛋白物質(zhì)，熒光峰B代表腐殖酸類物質(zhì)。在低濃度84消毒劑(小于2 mg/L)條件下，熒光峰A和B的熒光強(qiáng)度與84消毒劑濃度成反比例關(guān)系；相反，在高濃度84消毒劑(大于2 mg/L)條件下，熒光峰A和B的熒光強(qiáng)度與84消毒劑濃度成正比例關(guān)系。結(jié)果表明，低濃度84消毒劑(小于2 mg/L)會使類蛋白物質(zhì)和腐殖酸類物質(zhì)的含量降低，然而高濃度84消毒劑(大于2 mg/L)則起到相反的效果。該結(jié)果與上述2.5中所述的EPS中PN和PS含量分析結(jié)果一致。

圖6 各反應(yīng)體系中EPS的三維熒光光譜圖Fig.6 Three-dimensional fluorescence spectra of EPS in each reaction system

3 結(jié) 論

(1)苯酚降解效率表明：當(dāng)84消毒劑的濃度小于2 mg/L時(shí)，84消毒劑可促進(jìn)SBR體系中的苯酚降解，其主要?dú)w因于低濃度的84消毒劑會促進(jìn)DHA、苯酚降解酶活性及ATP的產(chǎn)生；當(dāng)84消毒劑的濃度大于2 mg/L時(shí)，則抑制了苯酚的降解。綜上，說明84消毒劑的最佳濃度閾值為2 mg/L。

(2)ROS和LDH含量檢測表明：當(dāng)84消毒劑的濃度小于2 mg/L時(shí)未對微生物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，而高濃度的84消毒劑(大于2 mg/L)會對微生物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，大量的LDH釋放到活性污泥體系中，進(jìn)而影響SBR體系的生理功能及理化性質(zhì)。

(3)EPS的含量分析表明：當(dāng)84消毒劑的濃度小于2 mg/L時(shí)，EPS中PN和PS含量隨84消毒液濃度升高而降低；當(dāng)84消毒劑的濃度大于2 mg/L 時(shí)，EPS中PN和PS含量逐漸升高。3D-EEM分析表明：84消毒劑的濃度小于2 mg/L時(shí)，體系中類蛋白質(zhì)和腐殖酸類物質(zhì)的含量降低，而高濃度的84消毒劑(大于2 mg/L)則起到相反的作用。上述結(jié)果進(jìn)一步說明2 mg/L為84消毒劑的最佳濃度閾值。