李貞金

(上海市環(huán)境科學研究院 國家環(huán)境保護新型污染物環(huán)境健康影響評價重點實驗室，上海 200233)

0 引 言

中國是世界上最大的水產(chǎn)養(yǎng)殖國家，年養(yǎng)殖產(chǎn)量達到世界總年產(chǎn)量的70%左右[1]。水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中廣泛使用抗生素治療和預防水產(chǎn)品的細菌性感染，投加的抗生素僅有20%～30%被水產(chǎn)品吸收，大部分以原藥的形式排入環(huán)境[2-3]。養(yǎng)殖塘與地表水體交換較少，更易賦存抗生素，成為抗生素的蓄積池[4-6]。

抗生素進入環(huán)境后會發(fā)生水解、光解、生物降解和吸附作用等一系列反應，共同促成抗生素在養(yǎng)殖環(huán)境中的積累和衰減。相同抗生素在不同水基質中的反應可能會有很大差異，Choo等[7]研究發(fā)現(xiàn)相同環(huán)境條件下，土霉素在海水中的降解半衰期是淡水中的5倍。此外，在各類抗生素之間的反應也有所不同[8-9]。因此，以實際養(yǎng)殖環(huán)境為背景基質研究目標抗生素的特異性反應才能了解養(yǎng)殖塘中抗生素的實際歸趨。

本研究基于先前的研究結果[10]，選取水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用且在養(yǎng)殖水體中檢出率較高4種抗生素(磺胺甲基嘧啶、恩諾沙星、金霉素和甲氧芐啶)作為研究對象，通過在實驗室模擬控制多種影響因素，研究了4種抗生素在養(yǎng)殖水體中的水解、光解、生物降解和綜合因素下的降解特征,并分析了在3種水-沉積物系統(tǒng)(魚塘、蝦塘和蟹塘)中的遷移與分布規(guī)律，旨在為深入了解水-沉積物系統(tǒng)中抗生素歸趨提供數(shù)據(jù)支持，為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)抗生素賦存風險防控提供科學依據(jù)。

1 試驗材料和方法

1.1 供試水樣和沉積物

供試水樣和沉積物采自上海市青浦區(qū)某水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)，選取抗生素背景值低的魚塘、蝦塘和蟹塘進行采樣。水和沉積物的理化性質如表1和表2所示。

表1 水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)水的理化性質Table 1 Physical and chemical properties of water in the aquaculture area

表2 水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)沉積物的理化性質Table 2 Physical and chemical properties of sediments in the aquaculture area

1.2 主要儀器與材料

低溫真空冷凍干燥器(LDG-0.3C，上海昊博有限公司)、全自動氮吹儀(AUTO-EVA，廈門?？苾x器股份有限公司)、全自動固相萃取儀(Fotector Plus，廈門?？苾x器股份有限公司)、微波萃取儀(CEM MARS CLASSIC，美國CEM公司)、高壓滅菌鍋(YXQ-LS-50G，上海精勝科學儀器設備有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(SPX-150，上海坤天儀器設備有限公司)、高效液相色譜串聯(lián)質譜儀(Waters Acquity HPLC@Hclass - Waters Xevo TQ-S micro，美國Waters公司)。

磺胺甲基嘧啶(SM1，純度99.72%)、甲氧芐啶(TMP，純度99.1%)、恩諾沙星(ENR，純度99.9%)、鹽酸金霉素(CTC，純度94.6%)購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，色譜級甲醇、乙腈和甲酸購自德國Merck公司。

標準溶液的配制準確稱取10.00 mg抗生素標準品，用甲醇溶解配制成100 mg·L-1的抗生素標準液，-20 ℃避光冷藏保存。

1.3 檢測方法

用高效液相色譜串聯(lián)質譜儀分析目標抗生素。色譜柱為BEH-C18柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；色譜柱柱溫35 ℃；進樣量1.5 μL；流動相流速0.35 mL·min-1；流動相A是體積濃度為0.5%的甲酸-水溶液；流動相B為乙腈；梯度洗脫程序：0～2.2 min，16% B；2.2～2.5 min，16% B～95% B；2.5～5.5 min，95% B；5.5～6.0 min，95% B～16% B；6.0～10.0 min，16% B。

質譜采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+)，三重四級桿質量分析器，掃描方式：多反應監(jiān)測模式(MRM)進行檢測；碰撞氣為高純氬氣；脫溶劑氣溫度為500 ℃，脫溶劑氣流速度為1 000 L·Hr-1，錐孔電壓為30 V，毛細管電壓為3.5 kV，掃描時間為0.1 s。4種抗生素的質譜分析參數(shù)見表3。

表3 4種抗生素的質譜檢測條件Table 3 Detection conditions of mass spectrometry analysis for 4 antibiotics

1.4 實驗方法

1.4.1 水環(huán)境中抗生素的降解

供試水樣：本實驗選用魚塘水作為背景溶液，經(jīng)0.7 μm濾膜過濾，防止水中顆粒物對實驗結果產(chǎn)生影響。4種抗生素在背景溶液中均未檢出。

(1)水解實驗

準確量取200 mL水樣于250 mL玻璃瓶中，高壓滅菌鍋121 °C滅菌40 min，然后置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d，相同方式再滅菌2次。實驗設置2個濃度，均勻地將4種抗生素的混合溶液加入至水樣中，使初始抗生素濃度分別為50 μg·L-1和200 μg·L-1，玻璃瓶用鋁箔紙包裹，瓶口用封口膜密封后擰緊瓶蓋，放置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中。分別在0、1、3、7、14、21、28、42、56 d取樣，取樣量為1 mL，經(jīng)0.22 μm 水相(聚醚砜)針式過濾器至棕色進樣瓶中，立即測定。

(2)光解實驗

準確量取200 mL水樣于250 mL玻璃瓶中，在高壓滅菌鍋內121 °C滅菌40 min，然后置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d，相同方式再滅菌2次。實驗設置2個濃度，均勻地將4種抗生素的混合溶液加入至水樣中，使初始抗生素濃度分別為50 μg·L-1和200 μg·L-1，瓶口用封口膜密封后擰緊瓶蓋，放置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，設置光照強度為3 000 lux。分別在0、1、3、7、14、21、28、42、56 d取樣，取樣量為1 mL，經(jīng)0.22 μm水相過濾器至棕色進樣瓶中，立即測定。對照組置于黑暗條件下，其他實驗程序均相同。

(3)生物降解實驗

準確量取200 mL水樣于250 mL玻璃瓶中，均勻地將4種抗生素的混合溶液加入至水樣中，使初始抗生素濃度分別為50 μg·L-1和200 μg·L-1，玻璃瓶用鋁箔紙包裹，瓶口用透氣封口膜密封后放置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中。分別在0、1、3、7、14、21、28、42、56 d取樣，取樣量為1 mL，經(jīng)0.22 μm 水相過濾器至棕色進樣瓶中，立即測定。對照組實驗與水解實驗程序相同。

(4)水體中的綜合降解實驗

準確量取200 mL水樣于250 mL玻璃瓶中。實驗設置2個濃度，均勻地將4種抗生素的混合溶液加入至水樣中，使初始抗生素濃度分別為50 μg·L-1和200 μg·L-1，瓶口用透氣封口膜密封后放置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，設置光照強度為3 000 Lux。分別在0、1、3、7、14、21、28、42、56 d取樣，取樣量為1 mL，經(jīng)0.22 μm水相過濾器至棕色進樣瓶中，立即測定。

1.4.2 水-沉積物系統(tǒng)內抗生素的降解

模擬實驗容器采用20 cm×20 cm×20 cm的玻璃缸。沉積物與水的比例為1∶4(v∶v)，即3.5 cm沉積物層和14 cm水層(5.6 L)。實驗前先將沉積物均質化，除去石塊、植物雜質等。靜置平衡3 d后，將2.8 mL 100 mg·L-1的4種抗生素標準混合溶液滴加至水相中，使水相中抗生素的初始濃度為50 μg·L-1，過程中緩慢攪拌水相使抗生素分布均勻并保證沉積物層不受干擾。玻璃缸放置在陽光充足且通風良好的實驗室里，實驗室溫度設置為25 ℃，水相分別在0、8 h、12 h、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、56 d取樣，取樣量為1 mL，經(jīng)0.22 μm水相針式濾器至棕色進樣瓶中，立即測定。沉積物物相分別在0、3、7、14、21、28、42、56、80、90 d取2 g表層沉積物，經(jīng)前處理過程后進樣檢測，前處理方法參考李貞金等[10]的方法。

上述實驗均設置3組平行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)為3組平行實驗的算術平均值，實驗結果由OriginPro 9.0 進行擬合和作圖。

降解實驗的數(shù)據(jù)采用一級反應動力學方程進行擬合，公式如式(1)所示：

Ct=C0e-kt

(1)

式(1)中：C0是抗生素的初始濃度，μg·L-1(或μg·kg-1)；Ct是t時間時抗生素的濃度，μg·L-1(或μg·kg-1)；e是自然底數(shù)；t是時間，d；k是一級降解速率常數(shù)。

半衰期(DT50)可以通過如式(2)計算：

DT50=ln2/k

(2)

沉積物對抗生素的吸附能力可以用吸附系數(shù)(Kd)表示：

(3)

式(3)中：Cs是沉積物中抗生素的平衡濃度,μg·L-1；Caq是水中抗生素的平衡濃度,μg·kg-1。

2 結果與分析

2.1 水環(huán)境中抗生素的降解

(1)水解

圖1 4種抗生素在養(yǎng)殖塘水中的水解過程Fig.1 Hydrolysis process of 4 antibiotics in the aquaculture water

一級反應動力學方程可以較好地擬合水解反應，初始濃度為50 μg·L-1時，SM1、ENR和CTC的水解半衰期分別為152.6、115.9、59.2 d。

(2)光解

經(jīng)過56 d光解實驗后，SM1、ENR和CTC都表現(xiàn)出了明顯的光解現(xiàn)象(圖2)。初始濃度為50 μg·L-1的CTC在21 d時就已經(jīng)完全降解、SM1在56 d時完全降解、ENR光解率為63.6%、TMP幾乎不發(fā)生光解。從圖2中可以看出，SM1、ENR和CTC的光解規(guī)律相同，都是初始降解速率較快，隨著時間的延長降解速率逐漸降低。

圖2 4種抗生素在養(yǎng)殖塘水中的光解過程Fig.2 Photolysis process of 4 antibiotics in the aquaculture water

一級反應動力學方程能較好地擬合光解反應，初始濃度為50 μg·L-1時，SM1、ENR和CTC的光解半衰期分別為17.4、33.0、3.5 d。對比不同文獻中報道的光解速率或降解半衰期可以發(fā)現(xiàn)，與本研究結果有較大差異。胡學香等[11]研究發(fā)現(xiàn)，模擬太陽光照下，四環(huán)素類抗生素的半衰期范圍在26～136 min之間，低于本實驗結果。Knapp等[12]的研究結果顯示，在全日照和半日照條件下，ENR的降解半衰期分別為0.8 d和3.7 d，低于本實驗結果。聞長虹等[13]指出在不同條件下，磺胺甲惡唑的光解半衰期最小為2.1 h，低于本實驗結果。綜上所述，本實驗光解半衰期較其他研究結果偏高，這可能是不同的光照強度、水的基質組成和不同的初始濃度設置等原因引起的。

(3)生物降解

經(jīng)過56 d的培養(yǎng)，初始濃度為50 μg·L-1時SM1、ENR、CTC和TMP的生物降解率依次為60.0%、10.7%、100.0%和15.8%。初始濃度為200 μg·L-1時，4種抗生素的生物降解率依次為47.7%、31.1%、100.0%和7.7%。提高初始濃度后，SM1和TMP的生物降解受到抑制，而ENR的生物降解率明顯提高(圖3)。

圖3 4種抗生素在養(yǎng)殖塘水中的生物降解過程Fig.3 Biodegradation process of 4 antibiotics in the aquaculture water

4種抗生素的生物降解規(guī)律相似，均表現(xiàn)為初期和后期的降解受到抑制。Yang等[14]的研究顯示，磺胺類在最初的12 h內生物降解被抑制，由于易于生物降解的物質優(yōu)先被利用。這與本研究的結果一致，4種抗生素在前三天基本沒有生物降解。Yuan等[15]研究表明，有些抗生素的降解產(chǎn)物會保留抗生素本身的毒性，甚至表現(xiàn)出更大毒性，這可能是后期SM1、ENR和CTC降解速率下降的原因。

4種抗生素的生物降解反應均可以用一級反應動力學方程能較好地擬合，SM1、ENR、CTC和TMP的生物降解半衰期分別為31.3、328.5、5.3、259.6 d。Lin等[16]報道了蝦塘水中磺胺類的降解半衰期大于300 d，高于本實驗結果。Xu等[17]的研究顯示磺胺甲惡唑在水中生物降解半衰期為14.2～16.9 d，低于本實驗結果。抗生素的生物降解行為取決于許多因素，如溫度、pH、含氧量、微生物的群落組成和物質的可利用性等[18]。

(4)水體中的綜合降解

實際水環(huán)境中抗生素的衰減是水解、光解和生物降解等因素共同作用的結果，它的衰減速率可能不僅僅是各個反應速率的代數(shù)和。本實驗通過模擬抗生素在魚塘水中的實際降解過程，同時考慮多個反應同時發(fā)生時抗生素的濃度變化，探究它們的降解行為。

2種濃度下(50 μg·L-1和200 μg·L-1)4種抗生素的綜合降解情況如圖4所示。

圖4 4種抗生素在養(yǎng)殖塘水中的綜合降解過程Fig.4 Comprehensive degradation process of 4 antibiotics in the aquaculture water

經(jīng)過56 d的降解，初始濃度為50 μg·L-1時SM1、ENR、CTC和TMP的降解率分別為100%(42 d)、94.7%、100%(7 d)和18.1%。比較4種抗生素的降解速率，CTC在養(yǎng)殖塘水體中最易降解，其次是SM1和ENR，TMP在水環(huán)境中的持久性最強。

4種抗生素的降解過程均可以使用一級反應動力學方程擬合，得到一級降解速率常數(shù)和半衰期(DT50)如表4所示。SM1、ENR、CTC和TMP在初始濃度為50 μg·L-1時的綜合降解速率常數(shù)為0.070 1、0.043 8、0.431 07、0.003 14 d-1，降解半衰期為9.8、15.8、1.6、220.7 d。4種抗生素的綜合降解速率比任何一個單一反應的降解速率都要快。

表4 4種抗生素在養(yǎng)殖塘水中的綜合降解一級反應動力學常數(shù)及半衰期Table 4 The first-order reaction kinetic constants and half-lives of the comprehensive degradation of 4 antibiotics in the aquaculture water

2.2 水-沉積物系統(tǒng)內的降解

抗生素進入養(yǎng)殖水體后，會通過吸附遷移至沉積物中。通過引入沉積物因素，模擬水產(chǎn)養(yǎng)殖塘的水-沉積物系統(tǒng)，探究了SM1、ENR、CTC和TMP在3種不同的水-沉積物系統(tǒng)中的遷移、分布和衰減規(guī)律，可以反映實際養(yǎng)殖塘中抗生素的命運。

(1)水中抗生素的衰減

初始濃度為50 μg·L-1的SM1、ENR、CTC和TMP在3種模擬養(yǎng)殖塘水體中的衰減行為如圖5所示。經(jīng)過56 d的降解，4種抗生素均在0～7 d內快速衰減，SM1、ENR、CTC和TMP在實驗前7 d的衰減量分別為30.4%～35.3%、83.6%～92.0%、94.2%～96.7%和48.3%～56.7%，明顯高于單獨在水環(huán)境中前7 d的衰減量，特別是TMP(水環(huán)境中幾乎不降解)。通常，抗生素擴散到沉積物層是十分迅速的，它們在水相中的衰減主要是沉積物的吸附和化學轉化(尤其是光解)之間的競爭過程，因此，在自然環(huán)境中很難區(qū)分吸附和降解[19]。

不同的養(yǎng)殖塘中ENR和CTC的衰減行為相似，0～7 d迅速衰減，之后衰減速率變緩(曲線斜率變小)，而SM1和TMP的衰減行為差異較大，不同養(yǎng)殖塘中2種抗生素的差異分別發(fā)生在21 d后和7 d后，推測可能與生物降解有關，不同水體中微生物群落組成不同，導致同一物質的降解性能出現(xiàn)差異。

擬合一級反應動力學方程得到4種抗生素的一級降解速率常數(shù)和半衰期(DT50)，如表5所示。比較4種抗生素在水相中的半衰期：SM1>TMP>ENR>CTC，ENR、CTC和TMP的半衰期低于僅在水環(huán)境中的半衰期，而SM1的半衰期高于僅在水環(huán)境中的半衰期。由于本實驗運行于光照強度較弱的冬季，加上水中懸浮顆粒物對光的屏蔽作用，可能使室內模擬實驗的光解速率大大降低。

表5 4種抗生素在不同品種養(yǎng)殖塘水中的一級反應動力學常數(shù)及半衰期Table 5 The first-order reaction kinetic constants and half-lives of 4 antibiotics in the water of different ponds

(2)沉積物中抗生素的吸附

以沉積物中抗生素的最高濃度作為平衡濃度，計算4種抗生素的吸附系數(shù)(Kd)如表6所示。SM1、ENR、CTC和TMP的Kd值范圍分別為1.52～3.14、26.65～40.44、4.79～12.06、1.16～3.86 L·kg-1，抗生素與沉積物的親和力排序如下：ENR>CTC>SM1和TMP，這與實際環(huán)境中抗生素的擬分配系數(shù)排序相似，SM1和TMP主要吸附機制為疏水分配，ENR和CTC的主要吸附機制為離子交換和離子架橋，后者的作用力更強，因此更易吸附在沉積物中[20-21]。4種抗生素的分配系數(shù)均低于實際環(huán)境計算結果的2～4個數(shù)量級，由于模擬實驗計算的是剛處于平衡狀態(tài)時抗生素的分配系數(shù)，而實際水環(huán)境中抗生素經(jīng)過一定時間的光解和生物降解，并且沉積物可長期對抗生素進行積累，從而導致其更高的分配系數(shù)。

不同養(yǎng)殖塘中抗生素的吸附系數(shù)也有明顯不同，除TMP外，3種抗生素在魚塘中的吸附系數(shù)最高，其次是蝦塘，蟹塘最低。這可能是因為不同的沉積物具有不同的理化性質，Hari等[22]發(fā)現(xiàn)諾氟沙星在土壤和污泥上的吸附系數(shù)是淡水沉積物的40～600倍。有機物含量和陽離子交換量是影響抗生素吸附的最主要因素[23]。Sassmann等[24]通過實驗證明了四環(huán)素的吸附主要取決于沉積物中陽離子交換量，陽離子交換量越高，Kd值越大。然而，本實驗中抗生素的吸附系數(shù)并沒有表現(xiàn)出與這兩因素明顯的相關性，說明沉積物基質復雜，抗生素的吸附受各種因素共同作用的影響[25]。

(3)沉積物中抗生素的降解

沉積物中4種抗生素在90 d里的濃度變化如圖6所示。沉積物中4種抗生素的濃度均表現(xiàn)出先迅速增加(吸附作用)，后降低至平穩(wěn)的趨勢(主要是生物降解)。有研究表明，沉積物的光解只發(fā)生在沉積物表面1 mm深度，因此沉積物中抗生素的衰減僅考慮生物降解因素。

取峰值至實驗結束期間的數(shù)據(jù)，擬合一級反應動力學方程得到4種抗生素的一級降解速率常數(shù)和半衰期，如表6所示。SM1、ENR、CTC和TMP在沉積物中降解半衰期的范圍分別為8.2～20.5、6.1～75.5、29.1～60.5、26.7～42.5 d。不同種類抗生素在沉積物中的半衰期存在差異，CTC和TMP在3種養(yǎng)殖塘中均表現(xiàn)了出較高的持久性，SM1的平均半衰期較低，ENR的半衰期在不同的沉積物中差異較大。Yang等[26]研究得到土壤中磺胺類的半衰期為12～18 d，與本實驗的研究結果相近，說明SM1的生物利用度高。Liu等[27]研究顯示，在有氧和無氧的土壤中TMP的半衰期分別為4 d和11 d，低于本實驗結果。Pan等[28]研究表明四環(huán)素在有氧和無氧的土壤中降解半衰期為57.8 d和86.6 d，Gottschal等[29]在農(nóng)田土壤中觀察到氟喹諾酮類抗生素的半衰期超過了217 d。CTC和ENR的降解半衰期長且生物降解率隨著時間增加而降低，可能由于抗生素通過二次吸附反應遷移至微孔和納米孔中，這些孔對于微生物和酶來說太小，使其暫時不被生物降解或形成了生物不可利用的螯合物，從而延長了它們在沉積物中的殘留時間[30]。因此，四環(huán)素類和氟喹諾酮類抗生素在沉積物中的殘留應引起人們的重視。ENR在魚塘中的降解半衰期(6.1 d)明顯低于蝦塘(75.5 d)和蟹塘(58.1 d)，這可能是存在其他反應促進了ENR的衰減。據(jù)報道沉積物中普遍存在的氧化鐵能夠氧化氟喹諾酮類抗生素，因此氧化物豐富的沉積物有利于ENR的衰減。水和沉積物中抗生素的半衰期差異明顯，沉積物中抗生素的持久性普遍高于水相，這是由于水和沉積物中抗生素的反應類型和分配過程不同引起的。

表6 4種抗生素在不同品種養(yǎng)殖塘沉積物中的一級反應動力學常數(shù)、半衰期和分配系數(shù)Table 6 First-order reaction kinetic constants,half-life and partition coefficient of 4 antibiotics in the sediments of different ponds

圖6 4種抗生素在不同品種養(yǎng)殖塘沉積物中濃度變化情況Fig.6 Concentration changes of 4 antibiotics in the sediments of different ponds

3 結 論

養(yǎng)殖水體中，水解對目標抗生素的降解貢獻率很小，光解和生物降解為SM1、ENR和CTC在養(yǎng)殖水體中的主要降解途徑，TMP幾乎不降解；4種抗生素的綜合降解速率比任何一個單一反應的降解速率都要快。3種不同養(yǎng)殖類型的水—沉積物系統(tǒng)中，水相4種抗生素均在0～7 d內快速衰減，明顯高于單獨在水環(huán)境中的衰減量，特別是TMP，主要受到吸附作用的影響；平衡時，4種抗生素的吸附系數(shù)排序為ENR>CTC>SM1和TMP，不同養(yǎng)殖塘中抗生素的吸附系數(shù)存在明顯差異；沉積物中抗生素的持久性普遍高于水相，CTC和TMP在3種養(yǎng)殖塘中均表現(xiàn)出較高的持久性，ENR在不同沉積物中的半衰期差異很大，沉積物的理化性質可能對抗生素的降解產(chǎn)生顯著影響。養(yǎng)殖塘中沉積物是抗生素的主要歸宿，抗生素的長期賦存可能誘導抗性基因的產(chǎn)生，應當引起人們的重視。