梁宇平，宋衛(wèi)東，孫杰，韓振，盧昕媛，萬健

上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院急診與重癥醫(yī)學(xué)科，上海 201299

支氣管哮喘是呼吸系統(tǒng)疾病中常見的慢性氣道疾病之一，臨床上以不同程度的呼氣氣流受限為特征，表現(xiàn)為喘息、氣促、胸悶和/或咳嗽等，全球發(fā)病率在1%～18%不等［1］；我國近年大型調(diào)查顯示我國20歲及以上人群的哮喘患病率為4.2%［2］。自2006年哮喘全球防治創(chuàng)議（global initiative for asthma，GINA）哮喘的總體控制概念及規(guī)范化的診治及管理推廣至今，我國支氣管哮喘患者的控制率總體有明顯的提高，但相較發(fā)達國家仍然較低［3］，目前仍是重要的公共衛(wèi)生問題。支氣管哮喘可以發(fā)生在各個年齡階段，近年來因老年哮喘患病率上升幅度最大而收到關(guān)注，且較年輕人癥狀嚴重而且持續(xù)［4］。因老年人病理機制的特殊性，認為炎癥特點方面傾向于中性粒細胞性哮喘并發(fā)生氣道重塑［5］，這種與老年支氣管哮喘的非過敏機制需要進一步探討。本研究通過建立老年小鼠支氣管哮喘模型，從氧化應(yīng)激及炎性衰老方面對老年小鼠支氣管哮喘進行了機制探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

青年雌性SPF 級C57BL/6 健康小鼠24 只，6～8周齡，體質(zhì)量15～20 g；老年雌性SPF 級C57BL/6 健康小鼠24 只，10～12月齡，體質(zhì)量20～30 g。所有小鼠飼養(yǎng)于恒溫（25 ℃）環(huán)境，標準無卵蛋白飼料，自由取水，12 h 晝夜。

1.2 主要試劑與儀器

卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美國Sigma-Aldrich公司），RNA 保存液（上海邁其生物），超純RNA 提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA 第一鏈合成試劑盒（北京康為世紀公司），小鼠SOD、MPO、IL-1β、IL-6 和TNFα ELISA 試劑盒（上海森雄科技實業(yè)有限公司）。超聲霧化器（上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號402AI），低溫離心機（BECKMAN 公司），光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，日本OLYMPUS 公司），全自動酶標儀（芬蘭Multiskan MS），熒光定量PCR 儀（美國BI 7500 型）。

1.3 實驗分組及老齡小鼠支氣管哮喘模型的建立

24 只老齡小鼠隨機分為老年哮喘模型組（A 組）和老年正常對照組（B 組），每組12 只；24 只青年小鼠隨機分為青年哮喘模型組（C 組）和青年正常對照組（D 組），每組12 只；各組小鼠分籠飼養(yǎng)。A、C 組采用卵清蛋白（OVA）致敏并激發(fā)C57BL/6J 小鼠，對B、D 組采用生理鹽水代替OVA。A、C 組小鼠在第0、7、14 天腹腔內(nèi)注射50 μg OVA 和100 μg 氫氧化鋁凝膠混懸液，此為抗原致敏階段。B、D 組采用生理鹽水替代OVA 進行腹腔內(nèi)注射。在第14～21 d，給小鼠霧化吸入2% OVA 鹽溶液，30 min/d，此為激發(fā)階段。

1.4 標本采集及制備

收集小鼠外周血及支氣管肺泡灌洗液（broncheoalveolar lavage fluid，BALF），以3 000 r/min 離心15 min，取上清液置于－80 ℃冰箱保存；小鼠肺組織置RNA 保存液中；切取小鼠1/2 左肺，用4%甲醛固定24 h 后制備石蠟切片，再予蘇木精-伊紅染色。

1.5 Real Time PCR 方法檢測小鼠肺組織中SOD、MPO、IL-1β、IL-6 和TNF-α 基因的表達

按標準步驟提取標本總RNA 并檢測濃度，然后對RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄后實時定量PCR：95 ℃變性1 min 后進入PCR 擴增循環(huán)。擴增條件：95 ℃，30 sec；65 ℃，60 sec；72 ℃，30 sec；35 個循環(huán)。作為對照，每個cDNA 樣本同時進行β-actin 擴增；采用實時定量PCR分析程序分析擴增相對定量結(jié)果。各基因序列見表1。

表1 小鼠SOD、MPO、IL-1β、IL-6、TNF-α 及β-actin 的引物序列

1.6 小鼠BALF 上清及外周血清中SOD、MPO、IL-1β、IL-6 和TNF-α 的檢測ELISA 方法檢測

按照ELISA 試劑盒說明書操作步驟進行，用酶標儀測定后計算各組SOD、MPO、IL-1β、IL-6 和TNF-α水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗與方差齊性檢驗后，正態(tài)分布且方差齊性的計量資料，2組間比較行獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較用配對樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組小鼠組織病理學(xué)改變比較

比較4 組小鼠肺蘇木精-伊紅染色的病理切片，相較2 組對照組可見到2 組哮喘模型組相似病理改變：氣道上皮破壞、管壁黏膜下及管壁周圍炎性細胞浸潤、氣道壁增厚、氣道平滑肌增生和痙攣見圖1。

圖1 小鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察（HE×200）

2.2 4 組肺組織SOD、MPO、IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達比較

相對于2 組對照組，2 組哮喘模型組SODmRNA表達量減少，而MPO、IL-1β、IL-6 和TNF-αmRNA 的表達量均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；老年哮喘模型組SODmRNA 的表達量低于青年哮喘模型組，IL-6 和TNF-αmRNA 的表達量高于青年哮喘模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），而MPO和IL-1βmRNA 的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；2 組對照組之間比較各指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 4 組小鼠肺組織SOD、MPO、IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達比較（±s）

表2 4 組小鼠肺組織SOD、MPO、IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達比較（±s）

注：A 與B、C 與D 比較，△P＜0.05、▲P＜0.01；A 與C 比較，＃P＜0.05、*P＜0.01。

組別 SOD MPO IL-1β IL-6 TNF-α A （n＝12） 0.78 ±0.37▲＃ 0.97 ±0.36▲ 0.87 ±0.35△ 2.27 ±0.67▲* 2.29 ±0.95▲＃B （n＝12） 2.39 ±0.97 0.51 ±0.22 0.48 ±0.14 0.67 ±0.20 0.92 ±0.38 C （n＝12） 0.65 ±0.24▲ 0.93 ＋0.34▲ 0.81 ±0.39△ 1.34 ±0.46▲ 1.54 ±0.52△D （n＝12） 1.54 ±0.56 0.44 ＋0.14 0.31 ±0.10 0.56 ±0.29 0.70 ±0.48

2.3 4 組小鼠BALF 上清及外周血清中SOD、MPO、IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平比較

相對于2 組對照組，2 組哮喘模型組BALF 上清及外周血清中SOD 水平降低，而MPO、IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；老年哮喘模型組BALF 上清及外周血清中SOD 水平低于青年哮喘模型，IL-6 和TNF-α 水平高于青年哮喘模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而MPO、IL-1β 的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；2 組對照組之間比較各指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 4 組BALF 上清及外周血清中SOD、MPO、IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的比較（±s，pg/mL）

表3 4 組BALF 上清及外周血清中SOD、MPO、IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的比較（±s，pg/mL）

注：A 與B、C 與D 比較，△P＜0.05、▲P＜0.01；A 與C 比較，＃P＜0.05、*P＜0.01。

SOD MPO IL-1β IL-6 TNF-α組別BALF 外周血 BALF 外周血 BALF 外周血 BALF 外周血 BALF 外周血A （n＝12） 7.70 ±1.88▲＃21.99 ±1.56▲＃B （n＝12） 16.20 ±3.37 8.70 ±2.30▲＃21.82 ±1.78▲42.89 ±3.02▲38.06 ±5.39▲36.04 ±6.44▲38.88 ±7.58▲＃47.20 ±6.40▲*42.01 ±2.67▲＃15.74 ±2.66 C （n＝12） 6.82 ±0.88▲16.65 ±3.40 17.37 ±2.03 26.29 ±5.70 26.91 ±4.84 12.75 ±4.02 25.06 ±3.18 27.08 ±5.59 29.40 ±3.90 17.34 ±1.28▲D （n＝12） 12.82 ±2.24 7.64 ±2.15▲20.40 ±2.79▲39.19 ±8.15▲36.91 ±3.60▲29.20 ±7.97▲31.71 ±5.33△34.41 ±4.88△36.01 ±6.03▲12.32 ±1.64 15.14 ±2.90 24.59 ±4.46 25.25 ±1.74 13.54 ±3.90 23.13 ±3.36 27.84 ±1.74 25.37 ±5.49 12.47 ±2.32

3 討論

流行病學(xué)資料顯示，支氣管哮喘并未隨著經(jīng)濟的發(fā)展發(fā)病率下降，截止到2025年全球支氣管哮喘患者將增加1 億以上［1，6］。我國目前有3 000 多萬的哮喘患者，雖然規(guī)范化的診治及管理使不少病人受益，但每年死亡人數(shù)仍有20 萬人［7］。支氣管哮喘嚴重影響患者的勞動力及生活質(zhì)量，給患者帶來痛苦，更會對家庭及社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。哮喘患病率亦隨年齡增長而不斷增加，2012 至2015年中國成人肺部健康研究資料顯示，我國60～69 歲及年齡≥70 歲老年人群患病率分別為6.0%及7.4%，是20 歲以上總?cè)巳旱?.5～2.0 倍［8］，且病情往往較年輕人重［4］。自從吸入糖皮質(zhì)激素作為哮喘的一線治療方法被誘導(dǎo)以來，嚴重的難治性哮喘已經(jīng)減少。盡管如此，仍有一部分嚴重哮喘患者，其中就包括老年哮喘［5］。老年哮喘病因復(fù)雜，目前認為吸煙、感染、過敏性因素、藥物等均可誘發(fā)老年哮喘［9］；老年哮喘與一般支氣管哮喘的發(fā)病機制基本相同，其實質(zhì)也是慢性氣道炎癥性疾病［7］。但更多的研究認為，參與老年哮喘的氣道炎癥以中性粒細胞炎癥占主導(dǎo)地位［5，10］，推測有非過敏機制的參與，易導(dǎo)致氣道上皮細胞損傷和頻繁的慢性黏液高分泌，并影響哮喘治療如糖皮質(zhì)激素的敏感性，治療控制更差且易發(fā)展為重癥哮喘［10-11］。在支氣管哮喘的發(fā)病機制中，Th2 相對亢進的Th1/Th2 細胞失衡學(xué)說仍占主導(dǎo)地位［12］，患者表現(xiàn)為嗜酸粒細胞性炎癥的過敏性哮喘；但以中性粒細胞炎癥占主導(dǎo)地位不同于嗜酸粒細胞性哮喘的老年支氣管哮喘發(fā)病機制目前尚不清楚。

本研究通過建立老年小鼠支氣管哮喘模型，并設(shè)老年正常對照組、青年哮喘模型組和青年正常對照組作為對照，基于氧化應(yīng)激和炎性衰老進行了機制探討。目前研究證明，氧化應(yīng)激失衡與中性粒細胞哮喘病理進程息息相關(guān)［13］，過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）會降低糖皮質(zhì)激素在中性粒細胞哮喘中的療效，同時還能刺激組胺的釋放，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的損傷和脫落、破壞β-腎上腺素能受體的功能，導(dǎo)致氣道受損重塑、呼吸阻力增加、肺功能低下。MPO 是一種過氧化物，是機體重要的過氧化代謝產(chǎn)物之一，可反映細胞受氧化損傷的程度；而SOD 是一種重要的抗氧化酶，對于清除自由基具有重要作用，防止細胞損傷，促使機體氧化與抗氧化平衡，可作為氧化應(yīng)激指標［14］。衰老與老年疾病密切相關(guān)，認為與免疫系統(tǒng)的失調(diào)有關(guān)，導(dǎo)致機體出現(xiàn)普遍的促炎癥狀態(tài)，這一過程被稱為炎癥衰老［15］，與炎癥衰老相關(guān)的促炎癥細胞因子介質(zhì)包括IL-1β、IL-6、TNF-α 和PGE2 等［16］。氧化應(yīng)激和炎性衰老互為因果，在免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，無論老年哮喘組還是青年哮喘組，較對照組在肺組織、外周血及BALF 中MPO 增高而SOD 降低，且老年哮喘組SOD 更低于青年哮喘組；炎性衰老促炎因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 在哮喘組肺組織、外周血及BALF 中均高于對照組，且老年哮喘組IL-6 和TNF-α 更高于青年哮喘組，提示氧化-抗氧化能力失衡在老年哮喘中更為明顯，炎性衰老和氧化應(yīng)激共同存在于老年哮喘中，在老年哮喘的病理機制中發(fā)揮作用。本研究為老年哮喘發(fā)病機制及干預(yù)治療提供新的思路，不足在于機制研究不夠深入，有待于更深層次的研究。