陳亮，高海榮，陳碩，王秀云，張聰*，劉億婕*

1. 福建省食品藥品質(zhì)量檢驗研究院（福州 350000）；2. 福建省藥品審核查驗中心（福州 350000）

茶葉中富含茶多酚類化合物和人體必需的多種微量元素，有利于健康，茶飲料受到世界各國人民的喜愛。然而在茶葉種植過程中，會使用農(nóng)藥來除草、除蟲、防病等[1-2]，有些農(nóng)藥甚至?xí)瑯薣3]，因此農(nóng)藥殘留成為茶葉質(zhì)量安全問題之一[4]。2016—2020年，歐盟多次通報茶葉中丁醚脲、唑蟲苯甲酰胺問題[5]，同時我國最新修訂的GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留量》中并未規(guī)定茶葉中甲基硫菌靈、氯噻啉、氯蟲苯甲酰胺農(nóng)藥殘留檢測的標準方法及限量（氯噻啉為臨時限量），因此建立適用于茶葉中丁醚脲、甲基硫菌靈、氯噻啉、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺5種農(nóng)藥殘留量的檢測方法非常有必要。

QuEChERS樣品前處理方法于2003年首次被提出[6]，是一種簡便、可靠的前處理技術(shù)[7-9]，QuEChERS被廣泛應(yīng)用于食用農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)獸藥殘留的檢測[10-11]。MWCNTs是一種新型材料，由多層石墨化片卷曲而成的碳納米管，其具有比表面積大、表面吸附性能好、選擇性能好等優(yōu)點。近年來，也有少量報道將MWCNTs用于農(nóng)藥殘留檢測中[12-13]，為快速高效的檢測茶葉中丁醚脲、甲基硫菌靈、氯噻啉、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺5種農(nóng)藥殘留，試驗基于QuEChERS方法，優(yōu)化N-丙基乙二胺（PSA）、C18、MWCNTs的用量，利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時分析檢測茶葉中這5種農(nóng)藥殘留。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試驗儀器

AB 5500 Qtrap三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB公司）；1290 Infinity安捷倫高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；CR21N落地式高速冷凍離心機（日本日立公司）；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore公司）；XSE204電子分析天平（瑞士梅特勒有限公司）；Turbo Vsp Lv全自動氮吹儀（美國Biotage公司）；HM100刀式研磨機（北京格瑞德曼公司）；MS3型渦旋混合器（德國IKA公司）。

1.1.2 試劑與材料

甲醇、乙腈、丙酮（色譜純，德國默克公司）；醋酸鈉、無水硫酸鎂（分析純，國藥集團化學(xué)有限公司）；MWCNTs（內(nèi)徑3～5 μm，外徑8～15 μm，長度50 μm）、甲酸、醋酸（質(zhì)譜級）（均為上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司）；SelectCoreTMN-丙基乙二胺（PSA）50 μm、SelectCoreTMC1850 μm、陶瓷均質(zhì)子（長2 cm×外徑1 cm）：納譜分析技術(shù)（蘇州）有限公司；丁醚脲、甲基硫菌靈、氯噻啉、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺對照品（100 μg/mL，天津農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心）；Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm，美國Agilent公司）。

茶葉樣品購自當?shù)爻谢蚴袌?，空白基質(zhì)樣品來自購買樣品初篩后確定無丁醚脲、甲基硫菌靈、氯噻啉、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺殘留的樣品。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

取不少于200 g的茶葉樣品，經(jīng)刀式研磨器粉碎后，過0.180 mm（80目）的篩后封裝于塑料瓶中，于0～4 ℃保存，準確稱取2.0 g（精確至0.000 1 g）茶葉粉末于50 mL塑料離心管中，加入10 mL水渦旋混勻后，靜置浸泡30 min。加入10 mL酸化乙腈（含1%醋酸，體積比）并混勻，蓋上蓋子后置于冰箱-18 ℃冷卻30 min，加入6 g無水硫酸鎂、1.5 g醋酸鈉及1顆陶瓷均質(zhì)子，蓋上蓋子，劇烈渦旋振蕩2 min，以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。取5 mL上清液于裝有900 mg無水硫酸鎂、200 mg PSA、200 mg C18及50 mg MWCNTs的15 mL離心管內(nèi)，振蕩渦旋2 min后，以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜，待上機測定。

1.2.2 標準溶液的配制

用乙腈將丁醚脲、甲基硫菌靈、氯噻啉、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺標準物質(zhì)配制成1 μg/mL 5種農(nóng)藥混合標準溶液，于-18 ℃避光保存；根據(jù)試驗要求，按照1.2.1的樣品前處理步驟處理空白茶葉樣品制得空白樣品基質(zhì)，用空白基質(zhì)溶液配制質(zhì)量溶度為0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 ng/mL的5種農(nóng)藥的混合標準工作溶液。

1.2.3 液相色譜-質(zhì)譜條件

液相條件：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）。進樣體積2 μL，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃。流動相A為0.1%甲酸水；流動相B為乙腈。液相梯度洗脫：0～1 min，70% A；1～5 min，70%～10% A；5～8 min，10% A；8～9 min，10～70% A；9～11 min，70% A。

質(zhì)譜條件：離子源采用電噴霧電離正模式（positive electrospray ionizationm，ESI+），離子源溫度450 ℃；氣簾氣壓20 psi；輔助氣壓50 psi；霧化氣壓50 psi；電噴霧電壓4 500 V；碰撞室入口電壓9 V；碰撞室出口電壓15 V。掃描方式采用多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

將5種農(nóng)藥標準物質(zhì)配制成50 ng/mL混合標準溶液，在正離子模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，確定5種農(nóng)藥的母離子、定性離子、定量離子、去簇電壓、碰撞電壓。5種農(nóng)藥質(zhì)譜條件參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見表1。用空白基質(zhì)配制50 ng/mL 5種農(nóng)藥的色譜圖見圖1。

表1 5種化合物質(zhì)譜參數(shù)

圖1 空白基質(zhì)配制50 ng/mL 5種化合物的色譜圖

2.2 提取溶劑的選擇

茶葉樣品的基質(zhì)復(fù)雜，色素含量較多，使用適當?shù)奶崛∪軇?，有利于除去樣品中的雜質(zhì)，提高檢驗結(jié)果的準確性。甲醇、乙腈、酸化乙腈、乙酸乙酯、丙酮是農(nóng)藥殘留提取過程中常用有機試劑。試驗比較甲醇、乙腈、酸化乙腈（含1%醋酸，V/V）、乙酸乙酯、丙酮作為提取溶劑時對5種農(nóng)藥殘留的提取效率。試驗發(fā)現(xiàn)，使用丙酮、酸化乙腈、乙腈作為提取溶劑時，5種農(nóng)藥殘留的回收率均較好，但是丙酮提取時樣品的顏色較深，不利于后續(xù)的凈化，乙腈對大部分農(nóng)藥均有較高的溶解性，乙腈作為提取劑提取的雜質(zhì)較少[14]，在乙腈中加入一定量乙酸，維持溶液pH，可減少待測藥物的降解[15]，因此選用酸化乙腈（含1%醋酸，V/V）作為提取溶劑。

2.3 流動相的選擇

比較甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時對各物質(zhì)的響應(yīng)的影響。試驗發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸水作為流動相按照一定比例梯度洗脫的效果最佳，加入微量的酸更有利于各物質(zhì)的離子化，峰形較好，響應(yīng)較高，因此流動相選用乙腈-0.1%甲酸水。

2.4 凈化劑的選擇

茶葉中富含咖啡因、茶多酚、有機酸、色素等物質(zhì)，為有效的除去雜質(zhì)，以提高檢測的準確性，凈化過程是一個關(guān)鍵的步驟。試驗方法采用PSA、C18及MWCNTs作為吸附劑，PSA能有效除去基質(zhì)中的茶多酚、有機酸等機型雜質(zhì)[16]，C18能有效除去基質(zhì)中的色素、維生素等非極性物質(zhì)[17]，MWCNTs能有效去除色素和平面結(jié)構(gòu)等干擾物質(zhì)[18]。試驗以空白樣品中加入50 μg/kg 5種農(nóng)藥混標，制備6個平行樣，按照1.2.1的方法制備樣品，上機測定回收率，采用正交試驗L9(34)確定PSA、C18及MWCNTs的最佳使用量。由正交試驗結(jié)果可以看出，各組試驗的回收率在60.8%～89.0%之間，丁醚脲、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺中C18對其回收率的影響最大，PSA次之，MWCNTs的影響最?。患谆蚓`、氯噻啉中C18對其回收率的影響最大，MWCNTs次之，PSA的影響最小。丁醚脲、甲基硫菌靈、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺對PSA、C18、MWCNTs的最佳用量均分別是200，200和50 mg，氯噻啉對PSA、C18、MWCNTs的最佳用量分別是200，200和100 mg，氯噻啉對MWCNTs使用量的K2、K3值比較接近，綜合考慮，試驗PSA、C18、MWCNTs的最佳用量均分別是200，200和50 mg。具體結(jié)果見表2和表3。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 正交試驗結(jié)果分析

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

在檢測農(nóng)藥殘留時基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果的準確性和重復(fù)性影響較大?；|(zhì)效應(yīng)主要是在前處理過程或樣品本身引入的雜質(zhì)干擾導(dǎo)致目標化合物的信號減弱和增強。方法采用相對響應(yīng)強度的比值來評價基質(zhì)效應(yīng)的強弱，即ME=B/A，A表示分析物在純?nèi)軇┑捻憫?yīng)值，B表示分析物在空白基質(zhì)中的響應(yīng)強度。ME小于0.9為基質(zhì)效應(yīng)減弱，大于1.2為基質(zhì)效應(yīng)增強[19]。方法分別以空白茶葉提取液與乙腈溶劑配制50 ng/mL 5種農(nóng)藥混標以考察樣品的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果表明5種農(nóng)藥的ME值為0.613～0.825，均為基質(zhì)減弱效應(yīng)，因此采用基質(zhì)配標消除基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響。

2.6 方法的標準曲線、檢出限和定量限

用空白茶葉基質(zhì)溶液配制質(zhì)量溶度為0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 ng/mL的5種農(nóng)藥的混合標準工作溶液，采用外標法定量，5種農(nóng)藥在0.1～50 ng/mL線性關(guān)系良好，具體結(jié)果見表3。

對空白茶葉基質(zhì)添加5種農(nóng)藥混合標準品，用空白基質(zhì)提取液逐級稀釋，以3倍信噪比（rSN）和10倍信噪比（rSN）分別作為方法的檢出限（limit of detection，SLOD）和定量限（limit of quantification，SLOQ），具體結(jié)果見表4。

表4 5種農(nóng)藥的線性方程、檢出限及定量限

2.7 回收率和精密度

在空白茶葉樣品中添加適量的5種農(nóng)藥標準溶液，每個加標濃度制備6個平行樣，5種農(nóng)藥的平均回收率為81.0%～97.6%，相對標準偏差（relative standard deviation，SRSD）在5.6%～9.9%，滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》對回收率和相對標準偏差的要求，表明該方法能夠滿足丁醚脲、甲基硫菌靈、氯噻啉、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺5種農(nóng)藥的檢測，具體結(jié)果見表5。

表5 5種農(nóng)藥的回收率和相對標準偏差

2.8 實際樣品的測定

以試驗建立的方法對市售151批茶葉進行檢測，其中：丁醚脲檢出24批次，檢出率為15.9%，其值為0.001 3～2.224 9 mg/kg；甲基硫菌靈檢出9批次，檢出率為6.0%，其值為0.004 3～0.073 6 mg/kg；氯噻啉均未檢出，檢出率為0；唑蟲酰胺檢出127批次，檢出率為84.1%，其值為0.001 2～0.670 8 mg/kg；氯蟲苯甲酰胺檢出27批次，檢出率為17.9%，其值為0.000 8～0.028 3 mg/kg。丁醚脲、氯噻啉、唑蟲酰胺檢出值均在GB 2763—2021中規(guī)定的限值范圍內(nèi)，甲基硫菌靈、氯蟲苯甲酰胺在GB 2763—2021中均未規(guī)定限量值，但均有一定程度檢出，說明有部分茶農(nóng)在茶葉種植過程中使用甲基硫菌靈、氯蟲苯甲酰胺，因此存在著一定風(fēng)險。

3 結(jié)論

試驗采用多壁碳納米管/QuEChERS凈化方法與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相結(jié)合，建立茶葉中丁醚脲、甲基硫菌靈、氯噻啉、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺5種農(nóng)藥殘留的檢測方法。研究表明，該方法的相關(guān)系數(shù)為0.997 1～0.999 6，檢出限在0.5～5 μg/kg；在茶葉空白基質(zhì)中進行加標試驗，平均回收率為81.0%～97.6%，SRSD為5.6%～9.9%。該方法操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好、準確可靠，能夠滿足日常檢測要求，可為國內(nèi)食品監(jiān)管部門監(jiān)測茶葉中丁醚脲、甲基硫菌靈、氯噻啉、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺5種農(nóng)藥殘留提供一種可行的參考方法和理論支持。