符玉霞，郭欣，魏亞博，鄧小蓉，張建

石河子大學(xué)食品學(xué)院（石河子 832000）

紅棗，又稱(chēng)大棗，鼠李科、棗屬植物的成熟果實(shí)。作為一種膳食補(bǔ)充劑，紅棗是公認(rèn)的健康食品，含有多種生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、生物堿、皂苷、礦物質(zhì)和多糖[1]。植物多糖是廣泛存在于植物中的天然大分子，由于其獨(dú)特的特性，近年來(lái)在臨床上被廣泛用于增強(qiáng)機(jī)體免疫力、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力、調(diào)節(jié)機(jī)體糖代謝等[2]。紅棗多糖是紅棗中一種重要的生物活性物質(zhì)，研究表明紅棗多糖具有抗氧化、抗腫瘤、保肝和降血脂等多種生物活性[3]，可被廣泛用于食品行業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)。

天然植物性多糖的分子修飾是目前研究的熱點(diǎn)，對(duì)多糖進(jìn)行不同方法的修飾，可以提高其生物活性，可為保健食品和藥物應(yīng)用提供重要原料[4]。硫酸化修飾是采用化學(xué)方法將硫酸基團(tuán)引入多糖分子結(jié)構(gòu)中，進(jìn)而使多糖糖鏈結(jié)構(gòu)中單糖分子的羥基被硫酸基團(tuán)取代，與天然多糖相比，硫酸化修飾后的多糖生物活性更加廣泛和優(yōu)越[5]。研究表明對(duì)洋蔥多糖進(jìn)行修飾，可以顯著地提高多糖的抗氧化活性。小分子量的牛膝多糖有免疫增強(qiáng)活性，卻無(wú)抗病毒活性，經(jīng)硫酸酯化修飾后，產(chǎn)生較強(qiáng)的抗乙肝病毒活性。

迄今為止，中國(guó)已發(fā)現(xiàn)7 000多個(gè)棗品種，其種植面積超過(guò)150萬(wàn) hm2[6]。隨著生活品質(zhì)的提升和紅棗市場(chǎng)規(guī)模不斷擴(kuò)大，紅棗產(chǎn)品的多樣化需求比較明顯，這與紅棗深加工產(chǎn)業(yè)的滯后形成矛盾，因外觀不良、未干制加工和腐敗變質(zhì)的紅棗浪費(fèi)嚴(yán)重[7]。另外，由于人們對(duì)自由基生物學(xué)的興趣日益濃厚，而對(duì)大多數(shù)慢性疾病仍然缺乏有效的治療方法，人們開(kāi)始研究從植物中提取的天然抗氧化劑對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的治療效果。通過(guò)對(duì)紅棗多糖的硫酸酯化修飾、結(jié)構(gòu)表征、抗氧化活性的研究，以期提高原有生物活性或增加新活性，擴(kuò)大多糖利用范圍，并應(yīng)用于功能食品領(lǐng)域，則可實(shí)現(xiàn)紅棗產(chǎn)業(yè)的高值化應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗多糖（西安澤郎生物科技有限公司）；透析袋（截留分子量8 000～14 000 Da，上海源葉生物科技有限公司）；三氧化硫吡啶復(fù)合物（酯化劑）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（5-methyl-2-phenyl-1,2-dihydropyrazol-3-one，PMP）、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）：上海麥克林生化科技有限公司；1, 1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazine，DPPH）、2, 2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2, 2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）]、抗壞血酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaOH（天津市鑫鉑特化工有限公司）；K2SO4（天津市盛傲化學(xué)試劑有限公司）；聚乙二醇：polyethylene glycol，PEG，艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AD高效液相色譜儀（杭州賽析科技有限公司）；ENK-PRO型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bioteck公司）；NJF-120-01型掃描電子顯微鏡（蘇州晉松計(jì)量?jī)x器有限公司）；Nicolet IS 10型傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)Thermo公司）；HX-10-50B型真空冷凍干燥機(jī)（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）；Agilent1260凝膠滲透色譜儀（北京普立泰科儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 紅棗多糖的硫酸酯化修飾

參考王瑞芳等[8]的方法。稱(chēng)取0.5 g紅棗多糖于錐形瓶，磁力攪拌下加入20 mL DMF和10 mL吡啶，攪拌使其充分溶解，加入0.9 g三氧化硫吡啶復(fù)合物，放入水浴鍋使其反應(yīng)完全，冷卻到室溫，用適宜濃度NaOH調(diào)節(jié)pH到中性，透析72 h，冷凍干燥得到硫酸酯化紅棗多糖。

硫酸酯化紅棗多糖取代度的測(cè)定參考卜丹丹[9]和程浩[10]的方法。分別取0.02，0.06，0.10，0.14，0.18和0.20 mL質(zhì)量濃度1.0 mg/mL的硫酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，加1.0 mol/L鹽酸補(bǔ)體積至0.5 mL，加入3.5 mL 8%三氯乙酸，分別加入1.0 mL明膠氯化鋇溶液和明膠溶液，室溫放置20 min，在360 nm處測(cè)其吸光度，以硫酸基含量為橫坐標(biāo)，明膠氯化鋇溶液與明膠溶液吸光度之差（A1-A2，A1為加氯化鋇-明膠溶液后的吸光度；A2為只加明膠溶液后的吸光度）為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程：y=0.310 6x-0.013 6，R2=0.997 3。

取適量樣品于具塞試管，加3 mL濃度為1 mol/L的鹽酸，于100 ℃水浴鍋水解5 h，待其完全水解，冷卻后過(guò)濾，取1 mL水解液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作方法得到（A1-A2），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算硫酸基含量（S），取代度按式（1）計(jì)算。

式中：DS為硫酸酯化取代度；S為硫酸基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.3.2 紅棗多糖結(jié)構(gòu)表征

1.3.2.1 單糖組成

采用高效液相色譜法[11]測(cè)紅棗多糖各單糖含量。

色譜柱Xtimate C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm：進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH 6.70）∶乙腈=83∶17（V/V）。

標(biāo)準(zhǔn)品的制備：精密稱(chēng)取適量甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、N-乙酰-氨基葡萄糖、葡萄糖、N-乙酰-氨基半乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解稀釋至每1 mL各含50 μg的混合標(biāo)準(zhǔn)品。

標(biāo)準(zhǔn)品的衍生：精密稱(chēng)取250 μL混合標(biāo)準(zhǔn)品，加入250 μL 0.6 mol/L的NaOH溶液和500 μL 0.4 mol/L PMP-甲醇溶液，于70 ℃反應(yīng)1 h，冷水中冷卻10 min，用0.3 mol/L鹽酸中和，加入1 mL氯仿旋渦1 min，按3 000 r/min離心10 min，取上清液，萃取3次。上清液進(jìn)樣檢測(cè)。

待測(cè)樣品水解與衍生過(guò)程：精密稱(chēng)取適量待測(cè)樣品于10 mL安培瓶中，加入3 mL 2 mol/L的TFA于10 mL安培瓶中，封管，于120 ℃酸解4 h。取出加入甲醇氮吹揮干剩余的TFA，加3 mL水復(fù)溶。精密稱(chēng)取250 μL多糖水解液，加入250 μL 0.6 mol/L的NaOH溶液和500 μL 0.4 mol/L PMP-甲醇溶液，于70 ℃反應(yīng)1 h，冷水中冷卻10 min，用0.3 mol/L的鹽酸中和，加入1 mL氯仿旋渦1 min，按3 000 r/min離心10 min，取上清液，萃取3次。上清液進(jìn)樣檢測(cè)。

1.3.2.2 相對(duì)分子量的測(cè)定

采用凝膠滲透色譜（GPC）法[12]測(cè)多糖相對(duì)分子量。

色譜柱Waters Ultrahydrogel（7.8 mm×300 mm），柱溫30 ℃，流動(dòng)相為超純水；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)器，RID-20示差折光檢測(cè)器；標(biāo)準(zhǔn)品，聚乙二醇。

測(cè)試方法：將樣品溶于流動(dòng)相，配制成1 mg/mL溶液，使用0.43 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣測(cè)試。進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min。

1.3.2.3 傅里葉紅外光譜（FTIR）

分別稱(chēng)取適量羧甲基化修飾前后的紅棗多糖，加入適量KBr粉末研磨均勻，壓片處理，分析4 000～500 cm-1波數(shù)下紅外光譜圖。

1.3.2.4 原子力顯微鏡分析

將1 mg多糖溶解在1 mL超純水中，在室溫下連續(xù)攪拌4 h。將溶解完全的樣品滴到云母載玻片上，待其干燥，進(jìn)行測(cè)樣。

1.3.2.5 熱重分析

分別稱(chēng)取10 mg多糖，溫度由室溫升高到800 ℃，進(jìn)行熱重（TG）分析。橫坐標(biāo)作為溫度，縱坐標(biāo)作為質(zhì)量，繪制熱重曲線(xiàn)。

1.3.2.6 剛果紅試驗(yàn)

參考胡月[13]的方法。各稱(chēng)5 mg多糖于6支試管中，分別加2 mL蒸餾水用以溶解完全，加入2 mL濃度80 μmol/L的剛果紅溶液，分別加入2 mL不同濃度（0，0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mol/L）NaOH溶液，混合體系在室溫下反應(yīng)25 min后，用紫外分光光度計(jì)在200～600 nm范圍內(nèi)掃描得到最大吸收波長(zhǎng)（λmax），橫坐標(biāo)為NaOH的濃度，縱坐標(biāo)為最大吸收波長(zhǎng)（λmax），繪制曲線(xiàn)。

1.3.3 抗氧化活性測(cè)定

1.3.3.1 DPPH自由基清除活性

配制質(zhì)量濃度0.04 mg/mL的DPPH溶液和不同質(zhì)量濃度（1，2，3，4和5 mg/mL）修飾前后紅棗多糖溶液。試管中依次加入2 mL DPPH溶液和2 mL不同濃度的紅棗多糖溶液，搖勻，室溫放置30 min，測(cè)定其在517 nm處的吸光度，蒸餾水為空白對(duì)照，計(jì)算清除率（S，%）[14]。

式中：A1為反應(yīng)液的吸光度；A2為不加DPPH時(shí)多糖液自身的吸光度；A0為空白對(duì)照DPPH溶液加蒸餾水的吸光度。

1.3.3.2 ABTS自由基清除活性

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.038 4 g ABTS定容到10 mL，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.013 4 g過(guò)硫酸鉀定容至10 mL，二者按1∶1（V/V）混合，避光保存12 h得到ABTS溶液，稀釋到吸光度為0.7待用。取不同濃度（1，2，3，4和5 mg/mL）紅棗多糖溶液。試管中依次加入2 mL ABTS溶液和2 mL不同濃度的紅棗多糖溶液，搖勻，室溫放置10 min，測(cè)定其在734 nm處的吸光度，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，計(jì)算清除率[15]（S，%）。

式中：A1為反應(yīng)液的吸光度；A2為不加ABTS時(shí)多糖液自身的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 單糖組成

圖2是未修飾紅棗多糖單糖組成液相色譜圖。根據(jù)峰面積和出峰時(shí)間對(duì)比單糖標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖（圖1），可以確定紅棗多糖由1-甘露糖、2-核糖、3-鼠李糖、4-葡萄糖醛酸、5-半乳糖醛酸、6-葡萄糖、7-半乳糖、8-木糖、9-阿拉伯糖、10-巖藻糖組成，說(shuō)明紅棗多糖是一類(lèi)組成復(fù)雜、結(jié)構(gòu)多樣的雜多糖[16]。從表1可以得到，紅棗多糖主要是由葡萄糖、葡萄糖醛酸和阿拉伯糖組成，占比分別為96.243%，1.269%和1.064%。

圖1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

圖2 紅棗多糖單糖液相色譜圖

圖3是硫酸酯化修飾的紅棗多糖單糖組成液相色譜圖。由圖3可知，硫酸酯化修飾紅棗多糖主要由10種單糖組成，它們是1-甘露糖、2-核糖、3-鼠李糖、4-葡萄糖醛酸、5-半乳糖醛酸、6-葡萄糖、7-半乳糖、8-木糖、9-阿拉伯糖、10-巖藻糖。由表2得，硫酸酯化修飾的紅棗多糖主要也是由葡萄糖、葡萄糖醛酸和阿拉伯糖組成的，只是占比與未修飾的紅棗多糖不同，分別為96.064%，1.426%和0.938%。結(jié)合表1和表2，研究發(fā)現(xiàn)未修飾的紅棗多糖和硫酸酯化修飾的紅棗多糖單糖組分一樣，只是各自含量不同。

表1 紅棗多糖單糖組成

表2 硫酸化多糖單糖組成

圖3 硫酸酯化紅棗多糖單糖液相色譜圖

2.1.2 相對(duì)分子量的測(cè)定

圖4是未修飾和硫酸酯化修飾紅棗多糖高效糖凝膠滲透色譜圖?？梢钥闯?，紅棗多糖峰比較對(duì)稱(chēng)單一，說(shuō)明紅棗多糖純度較高，且分子量分布寬度較小，說(shuō)明均一性較好[17]，多糖的分子量具有相對(duì)性，通常所測(cè)定的分子量只是一種統(tǒng)計(jì)平均值，代表相似鏈長(zhǎng)的平均分布。GPC法測(cè)得的未經(jīng)修飾的紅棗多糖的相對(duì)分子量為4.865×103Da，硫酸酯化修飾過(guò)的紅棗多糖相對(duì)分子量為7.426×103Da，這可能是因?yàn)榱蛩狨セ揎椧肓蛩峄鶊F(tuán)，使得紅棗多糖的分子量增大。

圖4 高效凝膠滲透色譜圖

2.1.3 傅里葉紅外光譜分析

圖5為硫酸酯化修飾和未修飾的紅棗多糖在4 000～500 cm-1波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光譜圖。3 371.38 cm-1和3 376.70 cm-1是O—H的拉伸振動(dòng)引起，表明紅棗多糖存在分子內(nèi)氫鍵。2 921.99 cm-1和2 919.66 cm-1是C—H不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)引起的[18-19]，1 720.41 cm-1和1 656.53 cm-1是由酯或羧基中C＝O的拉伸振動(dòng)引起的，表明可能存在糖醛酸或乙?；鵞20]。1 411.81 cm-1是對(duì)稱(chēng)C—O拉伸振動(dòng)和C—H耦合作用引起的，1 155.29 cm-1和1 157.06 cm-1是C—O—H和C—O—C結(jié)構(gòu)產(chǎn)生振動(dòng)吸收引起的。1 024.14 cm-1和1 029.78 cm-1為—OH的O—H變角振動(dòng)，919.99 cm-1和921.79 cm-1為α-吡喃糖的吸收峰。852.49 cm-1為β-吡喃糖的吸收峰，由此推測(cè)紅棗多糖是α-和β-構(gòu)型共存的吡喃型甘露糖苷雜多糖[21]。783.05 cm-1和755.95 cm-1是吡喃型特征吸收峰。1 250 cm-1附近是S＝O的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，810 cm-1附近是C—O—S伸縮振動(dòng)，修飾后—OH特征吸收峰明顯減弱，說(shuō)明—OH基團(tuán)被取代。綜上所述，紅棗多糖硫酸酯化修飾成功。

圖5 紅外光譜圖

2.1.4 分子形態(tài)學(xué)分析

圖6是紅棗多糖原子力顯微鏡圖，a和b是未修飾的紅棗多糖的相圖和3D圖，a1和b1是硫酸酯化修飾多糖的相圖和3D圖。從原子力顯微鏡可以觀察多糖分子形貌、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、表面粗糙度及黏彈性，球體、隨機(jī)線(xiàn)性鏈和帶有分枝和棒狀的隨機(jī)鏈?zhǔn)浅Ｒ?jiàn)的植物多糖構(gòu)象[22]。如圖6（a）所示，未修飾的紅棗多糖分子排列疏松，顆粒大小不均一，有明顯凸起，表面呈顆粒狀。圖6（a1）中分子排列較密集，顆粒較小且較均一，表面比較平整。圖6（b）和（b1）均呈分支狀，圖6（b1）分支形態(tài)大小均一，圖6（b）分支分支不均一，這可能是因?yàn)榱蛩狨セ揎椚〈嗵侵胁糠至u基，羥基數(shù)目減少，多糖分子間的締合作用減弱，有效降低了多糖的聚合程度，有利于觀察多糖的真實(shí)形態(tài)[23]。

圖6 原子力顯微鏡

2.1.5 熱重分析

圖7是未修飾和硫酸酯化修飾的紅棗多糖熱穩(wěn)定性分析曲線(xiàn)。未修飾和硫酸酯化修飾紅棗多糖熱降解過(guò)程分4個(gè)階段：從室溫分別到175和100 ℃為降解的第1階段，約有9.98%和8.50%的質(zhì)量損失，主要是由于水分的流失；第2階段是多糖聚合物的降解，初始降解溫度為242和273 ℃，質(zhì)量損失為22.28%和23.54%；第3階段約為280～450和316～483 ℃，溫度為455和500 ℃時(shí)，質(zhì)量損失率為97.68%和96.56%；在第4階段，隨著溫度增高，2組多糖樣品就形成碳化結(jié)構(gòu)[24]。從熱重分析曲線(xiàn)發(fā)現(xiàn)，硫酸酯化修飾的紅棗多糖熱穩(wěn)定性更好一些，說(shuō)明硫酸酯化修飾可以提高多糖熱穩(wěn)定性。

圖7 熱重分析曲線(xiàn)

2.1.6 剛果紅試驗(yàn)分析

剛果紅是一種酸性染料，可以與含有三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖形成絡(luò)合物，絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)同剛果紅相比發(fā)生紅移，NaOH濃度大于某一數(shù)值后，最大吸收波長(zhǎng)急劇下降[25]。如圖8所示，隨著NaOH濃度增大，未修飾和硫酸酯化修飾的多糖最大吸收波長(zhǎng)都與剛果紅相似，呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，并未發(fā)生紅移現(xiàn)象和急劇下降趨勢(shì)，所以未修飾和硫酸酯化修飾的多糖都不具備三螺旋結(jié)構(gòu)，硫酸酯化修飾不影響紅棗多糖三螺旋鏈狀結(jié)構(gòu)。

圖8 剛果紅試驗(yàn)

2.1.7 抗氧化活性測(cè)定

圖9顯示紅棗多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力。隨著濃度的增大，未修飾和硫酸酯化修飾的紅棗多糖對(duì)DPPH自由基都有較強(qiáng)的清除作用，并且清除能力隨著多糖濃度的增大而逐漸加強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。此外，硫酸酯化修飾后的紅棗多糖的清除能力遠(yuǎn)高于未修飾多糖，隨多糖濃度的增加，羧甲基化修飾的紅棗多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用顯著增大。質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到84.70%，未修飾的紅棗多糖清除率為53.85%。結(jié)果表明，硫酸酯化修飾可以顯著提高紅棗多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用，這可能是由于新基團(tuán)硫酸基團(tuán)的引入，抗氧化活性隨之增大。

圖9 紅棗多糖對(duì)DPPH的清除作用

圖10顯示紅棗多糖對(duì)ABTS自由基的清除能力。隨著濃度的增大，未修飾和硫酸酯化修飾紅棗多糖對(duì)ABTS自由基都有較強(qiáng)的清除作用，并且清除能力隨著多糖濃度增大而逐漸加強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。硫酸酯化修飾后的紅棗多糖的清除能力遠(yuǎn)高于未修飾多糖，隨多糖濃度的增加，硫酸酯化修飾紅棗多糖對(duì)ABTS自由基的清除作用顯著增大。質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到98.31%，未修飾的紅棗多糖清除率為48.05%。結(jié)果表明，硫酸酯化修飾可以顯著提高紅棗多糖對(duì)ABTS自由基的清除作用，這可能是因?yàn)榱蛩狨セ揎?，改變了多糖結(jié)構(gòu)，多糖分子量增大，單糖各組分含量發(fā)生變化。

圖10 紅棗多糖對(duì)ABTS的清除作用

3 結(jié)論

紅棗多糖通過(guò)三氧化硫-吡啶法，得到取代度較高的硫酸酯化紅棗多糖，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)得未修飾和硫酸酯化修飾后的紅棗多糖都由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖組成，只是含量不同，主要成分都是葡萄糖、葡萄糖醛酸和阿拉伯糖，未修飾的占比為96.243%，1.269%和1.064%，硫酸酯化修飾的占比為96.064%，1.426%和0.938%。凝膠滲透色譜法試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，未修飾和修飾后的紅棗多糖相對(duì)分子量相差較大，這可能是因?yàn)榱蛩狨セ揎椇?，引入硫酸基團(tuán)，導(dǎo)致其相對(duì)分子量發(fā)生變化，從而改變其抗氧化活性。紅外光譜分析表明，紅棗多糖硫酸酯化修飾成功，修飾后紅棗多糖的O—H峰明顯減弱。原子力顯微鏡表明，修飾后的紅棗多糖排列較密集，顆粒較小且較均一，表面比較平整。熱重分析說(shuō)明硫酸酯化修飾可以提高多糖熱穩(wěn)定性。剛果紅試驗(yàn)表明未修飾和硫酸酯化修飾的多糖都不具備三螺旋結(jié)構(gòu)，硫酸酯化修飾不影響紅棗多糖三螺旋鏈狀結(jié)構(gòu)?？寡趸囼?yàn)表明，硫酸酯化修飾可以顯著提高多糖對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除率。