蘇日耶姆·尼加提，魏亞博，鄧小蓉，郭欣，雷用東，張建

石河子大學(xué)食品學(xué)院（石河子 832000）

白斑狗魚（Esox lucius），在我國主要分布于新疆阿勒泰地區(qū)額爾齊斯河流域[1]，具有肉厚刺少、營養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)。近年來，我國冷鮮魚消費(fèi)比例逐漸增大，白斑狗魚由于受到地域性限制，其發(fā)展受到很大阻礙[2-3]。水產(chǎn)品貯藏過程中，因外界溫度變化和冷藏鏈間斷等原因，水產(chǎn)品在被消費(fèi)前處于反復(fù)凍融狀態(tài)[4]，導(dǎo)致魚肉組織中的冰晶重結(jié)晶，蛋白質(zhì)變性，從而影響其結(jié)構(gòu)和功能，對水產(chǎn)品市場發(fā)展造成極大阻礙[5]。有研究表明，鮰魚、蝦等水產(chǎn)品貯藏過程中，反復(fù)凍融導(dǎo)致其肌肉質(zhì)地劣變、水分流失嚴(yán)重，降低了消費(fèi)者可接受的程度[6-7]。因此，研究新型凍結(jié)方式、提高白斑狗魚貯藏過程中凍融穩(wěn)定性具有重要意義。

不凍液凍結(jié)法是水產(chǎn)品凍結(jié)領(lǐng)域中的新型凍結(jié)方法。不凍液也被稱為低溫載冷劑，具有冷凍速度快、能耗低、冷凍質(zhì)量好等優(yōu)勢[8]，通過與冷凍食品接觸換熱，從而使食品降溫達(dá)到凍結(jié)效果[9]。目前有關(guān)不凍液凍結(jié)白斑狗魚的研究較少。為適應(yīng)當(dāng)前白斑狗魚市場需求、提高新疆特色冷水魚經(jīng)濟(jì)效益，試驗(yàn)以新疆特色冷水魚白斑狗魚為研究對象，研究不同凍結(jié)點(diǎn)的不凍液（-39，-48，-57和-63 ℃）對白斑狗魚凍融穩(wěn)定性的影響，旨在提高白斑狗魚的凍融穩(wěn)定性，以期為促進(jìn)白斑狗魚市場發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

白斑狗魚（單個(gè)體質(zhì)量1 300～1 500 g，石河子市農(nóng)貿(mào)市場）。

蘇木素-伊紅染液、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（北京索萊寶科技有限公司）；其他所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

不凍液組成（所用原料均為食品級）：1號不凍液，0.15 g/mL乙醇+0.12 g/mL低聚果糖+0.04 g/mL檸檬酸+0.03 g/mL氯化鈣+0.10 g/mL丙二醇，其余為水（凍結(jié)點(diǎn)為-39 ℃）；2號不凍液，0.20 g/mL乙醇+0.12 g/mL低聚果糖+0.04 g/mL檸檬酸+0.05 g/mL氯化鈣+0.10 g/mL丙二醇，其余為水（凍結(jié)點(diǎn)為-48 ℃）；3號不凍液，0.20 g/mL乙醇+0.10 g/mL低聚果糖+0.04 g/mL檸檬酸+0.07 g/mL氯化鈣+0.10 g/mL丙二醇，其余為水（凍結(jié)點(diǎn)為-57 ℃）；4號不凍液，0.20 g/mL乙醇+0.10 g/mL低聚果糖+0.03 g/mL檸檬酸+0.05 g/mL氯化鈣+0.10 g/mL丙二醇，其余為水（凍結(jié)點(diǎn)為-63 ℃）。

1.2 儀器與設(shè)備

KD-3000低溫恒冷切片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；DC-2015低溫恒溫槽（上海習(xí)仁科學(xué)儀器有限公司）；K3 Plus酶標(biāo)儀（上海珂淮儀器有限公司）；CX21顯微鏡[奧林巴斯（深圳）工業(yè)有限公司]；H2500R-2高速冷凍離心機(jī)（北京澎昆博遠(yuǎn)科貿(mào)發(fā)展有限責(zé)任公司）；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀（英國Stable Micro System公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

將白斑狗魚敲暈致死，去頭、尾、內(nèi)臟，用流動水洗去表面的雜物，去皮、脊骨，用刀將魚脊背肌肉分割成長寬各為4 cm、厚度為2 cm的肉塊，真空包裝后放置備用。

1.3.2 樣品凍結(jié)凍藏處理

不凍液處理組：將配好的不凍液分別預(yù)冷至-20℃，將包裝好的魚塊放置于不凍液中進(jìn)行凍結(jié)?？諝鈨鼋Y(jié)組：另取包裝好的魚塊放置于-20 ℃的冰箱中進(jìn)行凍結(jié)。凍結(jié)期間測定魚塊中心溫度，待魚塊中心溫度達(dá)到-18 ℃時(shí)取出不凍液凍結(jié)組魚塊，放置于-20℃冰箱中凍藏，間隔5 d取1次樣進(jìn)行冷凍切片及顯微觀察，并將樣品在4 ℃環(huán)境中進(jìn)行解凍，待樣品溫度達(dá)到0～2 ℃時(shí)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.3.3 凍結(jié)曲線的測定

將中心溫度計(jì)探頭插入魚塊幾何中心位置，另一端連接電腦，將備好的魚塊放置于預(yù)冷好的不凍液中，不凍液凍結(jié)組每隔30 s記錄1次溫度，空氣凍結(jié)組每隔5 min記錄1次溫度繪制凍結(jié)曲線。

1.3.4 冷凍切片

對冷凍切片機(jī)進(jìn)行預(yù)冷處理，設(shè)置冷凍切片機(jī)冷凍室及冷動臺溫度-30 ℃。取5種不同凍結(jié)處理后的樣品，盡快修成長寬各為2 cm，厚度為1 cm，將修整好的樣品放置于樣品托并進(jìn)行凍固。設(shè)置修片厚度（15 μm）并對樣品進(jìn)行修片處理，待樣品表面修整為平整表面后對樣品進(jìn)行切片，切片厚度為10 μm。用載玻片貼取切片，在固定液中進(jìn)行固定并用蘇木素-伊紅染色液進(jìn)行染色，使用光學(xué)顯微鏡對切片組織進(jìn)行觀察。

1.3.5 色澤

取5種解凍后的魚肉樣品，為防止魚肉表面的水分對光的反射從而影響色澤，用濾紙將魚肉表面的水分吸干。以儀器白板色澤為標(biāo)準(zhǔn)，使用CIELAB表色系統(tǒng)進(jìn)行色澤測定。將待測樣品放在探測器端面，每個(gè)樣品測3次。

1.3.6 汁液流失率

汁液流失率的測定方法參考聶小寶等[10]方法并略加改動。將樣品在解凍前和解凍后稱其質(zhì)量，分別得到解凍前的質(zhì)量（M1）和解凍后質(zhì)量（M2），汁液流失率按照式（1）計(jì)算。

式中：M1為解凍前的質(zhì)量，g；M2為解凍后的質(zhì)量，g。

1.3.7 肌原纖維蛋白的提取及測定

白斑狗魚肌原纖維的測定參考Deng等[11]的方法進(jìn)行。在解凍后的白斑狗魚中加入10倍體積的磷酸鹽緩沖溶液A（50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，pH 7.5），均質(zhì)勻漿直至肌肉破碎，在8 000 r/min、15 min、4 ℃條件下提取2次，棄去上清液，在沉淀中加入10倍體積的磷酸鹽緩沖溶液B（50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，0.6 mol/L NaCl，pH 7.5），均質(zhì)1 min，在8 000 r/min、15 min、4 ℃條件下提取2次，合并2次上清液，即為肌原纖維蛋白。采用雙縮脲法[12]測定蛋白質(zhì)的濃度，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，測定標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.026 3x+0.003 6，R2=0.999 3。

1.3.8 總巰基含量的測定

總巰基含量的測定參考Simplicio等[13]的方法并略加改動。取5種蛋白樣品溶液，各1 mL，加入8 mL三羥甲基氨基甲烷（Tris）-甘氨酸（pH 8），渦旋混勻1 min，按4 ℃、8 000 r/min離心15 min，在溶液中加入0.5 mL 10 mmol/L Ellman 試劑（DTNB試劑），反應(yīng)0.5 h后，在412 nm處測定吸光度，使用摩爾消光系數(shù)13 600 L/（mol·cm），利用式（2）計(jì)算總巰基含量（nmol/mg）。

式中：1.36×104為摩爾吸光系數(shù)，L/（mol·cm）；ρ為雙縮脲法測得的蛋白質(zhì)量濃度，mg/L。

1.3.9 表面疏水性的測定

表面疏水性的測定參考Chelh等[14]的方法并略加改動。將蛋白濃度稀釋至5 mg/mL，取2 mL稀釋后的蛋白溶液加入200 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)，渦旋混勻10 min，按8 000 r/min離心15 min，取上清液在595 nm下測定吸光度，記作A595nm。溴酚藍(lán)空白樣是用1 mL 20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）加200 μL溴酚藍(lán)，磷酸鹽緩沖液作空白樣，在595 nm下測定吸光度，記作A0。表面疏水性（溴酚藍(lán)，μg）按式（3）計(jì)算。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理和差異顯著性分析分別采用Origin和SPSS軟件進(jìn)行，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同凍結(jié)條件下白斑狗魚塊的凍結(jié)曲線

不同凍結(jié)條件下白斑狗魚塊的中心溫度變化如圖1所示。白斑狗魚塊的凍結(jié)過程分為3個(gè)階段：初階段為冷卻過程，魚塊溫度從原始溫度降低至凍結(jié)點(diǎn)，該階段具有降溫快的特點(diǎn)；中階段為結(jié)冰過程，此過程中魚塊中大部分水結(jié)成冰，放出大量潛熱，因此降溫緩慢；終階段為繼續(xù)凍結(jié)的過程，降溫速率較快[15]。比較不同凍結(jié)條件下白斑狗魚塊的凍結(jié)速率可發(fā)現(xiàn)，不凍液凍結(jié)速率明顯高于空氣凍結(jié)速率，并且在同一溫度下，當(dāng)不凍液的凍結(jié)點(diǎn)越低時(shí)，其凍結(jié)速率越快。

圖1 不同凍結(jié)條件下白斑狗魚塊中心溫度變化

2.2 不同條件凍藏過程中白斑狗魚塊的冰晶形態(tài)

水產(chǎn)品在凍藏過程中，隨著凍藏時(shí)間的延長及凍融次數(shù)的增加，其微觀結(jié)構(gòu)的完整性會發(fā)生變化，并且凍結(jié)過程中形成的冰晶大小和數(shù)量在很大程度上影響水產(chǎn)品的品質(zhì)[16]。圖2為凍藏過程中不同凍結(jié)條件下白斑狗魚塊橫切面，可以通過冰晶留下的間隙反映魚塊中冰晶的大小。通過對比凍融0～5次期間5組魚塊中的冰晶大小可知，隨著凍融次數(shù)的增加，魚塊中的冰晶逐漸增大，且其微觀結(jié)構(gòu)的完整性逐漸降低。相比于不凍液凍結(jié)組，空氣凍結(jié)組魚塊中的冰晶大，組織結(jié)構(gòu)的破壞程度高，凍融5次后魚肉中纖維組織嚴(yán)重?cái)嗔选?/p>

圖2 不同凍結(jié)條件下白斑狗魚塊的冰晶形態(tài)變化（×80）

對比4種不凍液處理組魚塊凍融后的微觀結(jié)構(gòu)可知，不凍液凍結(jié)點(diǎn)對白斑狗魚貯藏過程中魚塊內(nèi)的冰晶大小及纖維結(jié)構(gòu)完整性有顯著影響。1號和2號不凍液處理組魚塊中的冰晶體積大且纖維結(jié)構(gòu)破損程度嚴(yán)重，其中1號不凍液處理組魚塊在凍融5次后冰晶體積最大。3號和4號不凍液處理組魚塊在凍融0次時(shí)冰晶體積小且分布均勻，隨著凍融次數(shù)的增加，魚塊內(nèi)冰晶體積逐漸增大，凍融2次時(shí)，3號不凍液處理組魚塊內(nèi)冰晶體積顯著大于4號不凍液處理組魚塊。凍融5次完成后，4號不凍液處理組魚塊內(nèi)冰晶體積最小且結(jié)構(gòu)完整性最高。這可能是因?yàn)轸~塊在凍結(jié)過程中體內(nèi)液體形成的冰晶會對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成機(jī)械性損傷，并且反復(fù)凍融過程導(dǎo)致魚塊內(nèi)的冰晶重結(jié)晶，這對其結(jié)構(gòu)造成進(jìn)一步損傷。

2.3 不同條件凍藏過程中白斑狗魚塊色澤的變化

魚肉在貯藏過程中因發(fā)生一系列生化反應(yīng)，會導(dǎo)致色澤變化[17]。不凍液凍結(jié)對白斑狗魚凍融循環(huán)過程中色澤的影響如圖3所示。隨著凍融次數(shù)的增加，不同處理組魚肉的L值出現(xiàn)逐漸下降趨勢，而a值和b值逐漸增加。這可能是由于貯藏過程中凍融循環(huán)促使魚肉中脂肪氧化，其產(chǎn)生深色物質(zhì)導(dǎo)致魚肉表面逐漸暗淡。姜晴晴等[18]研究帶魚凍融循環(huán)過程中色澤變化也得到相似結(jié)果。

圖3 不凍液凍結(jié)對白斑狗魚凍融循環(huán)貯藏過程中色澤的影響

與空氣凍結(jié)組相比，不凍液凍結(jié)組魚塊L值偏高，說明不凍液凍結(jié)處理能有效減緩白斑狗魚在貯藏過程中因凍融循環(huán)導(dǎo)致的色澤暗淡。不凍液凍結(jié)點(diǎn)對魚塊色澤有顯著影響，4號不凍液處理組魚塊L值顯著高于其他處理組，1號不凍液處理組魚塊L值最低，與空氣凍結(jié)組魚塊L值較為接近。a值與b值則與不凍液凍結(jié)點(diǎn)呈正相關(guān)趨勢，4組不凍液處理組中1號和2號不凍液處理組魚塊a值顯著高于其他處理組，4號不凍液處理組魚塊a值上升趨勢較為緩慢。這可能是因?yàn)閮鋈谘h(huán)過程中凍結(jié)速率越快，魚肉脂肪氧化程度越低，魚塊在貯藏過程中色澤變化程度越低。

2.4 不凍液對白斑狗魚凍融循環(huán)貯藏過程中汁液流失率的影響

不凍液對白斑狗魚凍融循環(huán)貯藏過程中汁液流失率的影響如圖4所示。隨著凍融次數(shù)的增加，魚塊汁液流失率逐漸增加。這是因?yàn)樵诜磸?fù)凍融過程中，魚塊中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，肌原纖維脫水，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性，魚塊在解凍時(shí)水分流失逐漸增大。常海軍等[19]研究凍融次數(shù)對豬肉品質(zhì)的影響時(shí)也得到一致結(jié)果。

圖4 不凍液凍結(jié)對白斑狗魚凍融循環(huán)貯藏過程中汁液流失率的影響

凍融貯藏期間，空氣凍結(jié)組魚塊汁液流失率顯著高于不凍液處理組，說明不凍液凍結(jié)處理可在一定程度上降低白斑狗魚解凍后的汁液流失率。不凍液凍結(jié)點(diǎn)對魚塊汁液流失率有顯著影響，不凍液凍結(jié)點(diǎn)越高，魚塊汁液流失率上升趨勢越明顯，4號不凍液處理組魚塊汁液流失率顯著低于其它處理組。

2.5 不凍液對白斑狗魚凍融循環(huán)貯藏過程中總巰基含量的影響

魚塊凍結(jié)過程中形成的冰晶，導(dǎo)致肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的改變，從而促使內(nèi)部的巰基暴露，進(jìn)而氧化為二硫鍵，因此巰基的含量可作為衡量蛋白質(zhì)變性的重要指標(biāo)之一[20]。不凍液對白斑狗魚凍融循環(huán)貯藏過程中總巰基含量的影響如圖5所示。隨著凍融次數(shù)的增加，魚塊內(nèi)總巰基含量整體呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，說明隨著凍融次數(shù)的增加，魚塊內(nèi)蛋白質(zhì)變性逐漸增強(qiáng)。Zhang等[21]通過試驗(yàn)證實(shí)凍融循環(huán)促進(jìn)鳙魚肉中總巰基含量下降。

圖5 不凍液凍結(jié)對白斑狗魚凍融循環(huán)貯藏過程中總巰基含量的影響

凍融貯藏過程中，空氣凍結(jié)組魚塊總巰基含量顯著低于不凍液凍結(jié)組，且不凍液凍結(jié)點(diǎn)顯著影響總巰基含量變化。凍融期間，4號不凍液凍結(jié)組魚塊總巰基含量顯著高于其他處理組，其蛋白質(zhì)變性程度最低。原因可能是凍結(jié)速率快，形成的冰晶小，且在細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞間隙中均勻分布，蛋白冷凍變形程度低[22]。

2.6 不凍液對白斑狗魚凍融循環(huán)貯藏過程中表面疏水性的影響

圖6表示不凍液對白斑狗魚凍融循環(huán)貯藏過程中表面疏水性的影響。隨著凍融次數(shù)的增加，表面疏水性呈現(xiàn)上升趨勢，且經(jīng)4次凍融后魚塊表面疏水性增長迅速，說明隨著凍融次數(shù)增加，蛋白質(zhì)變性程度逐漸增強(qiáng)。Zhang等[23]和袁麗等[24]在鰱魚和凡納濱對蝦中發(fā)現(xiàn)相似的研究結(jié)果。這可能是因?yàn)榉磸?fù)凍融過程中，蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致內(nèi)部疏水性基團(tuán)暴露，促使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)肽鏈的卷曲或三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)表面疏水性增強(qiáng)。

圖6 不凍液凍結(jié)對白斑狗魚凍融循環(huán)貯藏過程中表面疏水性的影響

凍融貯藏期間，空氣凍結(jié)組魚塊表面疏水性顯著高于其他處理組，蛋白質(zhì)變性程度最高。不凍液凍結(jié)點(diǎn)越低，魚塊表面疏水性越低，4種不凍液處理組魚塊表面疏水性呈下降趨勢。3號和4號不凍液處理組魚塊表面疏水性較低，隨凍融次數(shù)的增加其表面疏水性增長趨勢顯著低于其他處理組，蛋白質(zhì)變性程度較低。

3 結(jié)論

不凍液凍結(jié)對白斑狗魚的凍融穩(wěn)定性有顯著影響。凍融貯藏期間，凍結(jié)點(diǎn)為-63 ℃的4號不凍液凍結(jié)組魚塊內(nèi)冰晶體積顯著小于其他處理組。與空氣凍結(jié)組相比，不凍液凍結(jié)處理可在一定程度上抑制反復(fù)凍融導(dǎo)致魚塊的色澤、汁液流失率發(fā)生不同程度的劣化，其中4號不凍液凍結(jié)組魚塊色澤明亮，汁液流失率最低。不凍液凍結(jié)點(diǎn)對魚塊貯藏過程中蛋白質(zhì)變性程度有顯著影響，不凍液凍結(jié)點(diǎn)越低，魚塊中蛋白質(zhì)變性程度越低。因此，不凍液凍結(jié)更有利于保證白斑狗魚的凍融穩(wěn)定性，4號不凍液（凍結(jié)點(diǎn)為-63 ℃）凍結(jié)速率快，魚塊品質(zhì)最佳，可最大程度減少貯藏過程中反復(fù)凍融對白斑狗魚品質(zhì)的影響。