白玉，紀海鵬，陳存坤,3，于晉澤,3，張娜，董成虎*，姜余梅*

1(天津科技大學 食品科學與工程學院，天津，300457)2(天津市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術研究所(國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術研究中心(天津))，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點實驗室，天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津，300384)3(天津國嘉農(nóng)產(chǎn)品保鮮生產(chǎn)力促進有限公司，天津，300384)

阿克蘇蘋果以其獨特的“冰糖心”而聞名，因其主要產(chǎn)區(qū)在新疆阿克蘇地區(qū)而得名，屬于薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)水果，是一種紅富士蘋果。阿克蘇蘋果品質(zhì)、口感俱佳，主要是由于該地區(qū)晝夜溫差大、無霜期長等氣候因素導致，這種獨特的自然條件使得蘋果果核糖分堆積呈透明狀[1]。其果肉中富含維生素、礦物質(zhì)、類黃酮和多種微量元素等營養(yǎng)元素[2-3]。蘋果是典型的呼吸躍變型果實，具有后熟現(xiàn)象，在成熟過程中會產(chǎn)生大量的乙烯[4]，同時，在采后運輸及貯藏過程中，還會出現(xiàn)軟化、失水皺縮、營養(yǎng)成分下降以及被病原微生物侵染等現(xiàn)象[5]，這些都會加速蘋果的腐敗變質(zhì)，最終影響果實的品質(zhì)，造成大量經(jīng)濟損失。

臭氧具有高效、易分解、無殘留、綠色、抑菌和保鮮效果好等優(yōu)點[6]。它能夠降低乙烯的釋放量，抑制呼吸作用，清除環(huán)境中的有害氣體，抑制或殺滅多種微生物[7]。高聰聰?shù)萚8]發(fā)現(xiàn)臭氧可以有效延緩果實可滴定酸和硬度的下降，延緩葡萄的衰老進程，LIN等[9]發(fā)現(xiàn)了臭氧處理可以抑制香椿乙烯釋放速率從而延長香椿的采后貯藏時間。羅文靖等[10]發(fā)現(xiàn)臭氧處理可以延緩庫爾勒香梨褐變和硬度的下降，維持果實色彩飽和度，抑制呼吸作用，維持庫爾勒香梨內(nèi)在和外觀品質(zhì)。綜合研究得出，臭氧在果蔬采后貯藏保鮮方面具有一定的積極效果。

因此本試驗以阿克蘇蘋果為實驗材料，采用不同臭氧濃度(0、2.14、10.7、19.26 mg/m3)處理阿克蘇蘋果，探究其對阿克蘇蘋果貯藏品質(zhì)和酶活性的影響，以期找到適宜的臭氧處理濃度，為完善阿克蘇蘋果的采后貯藏保鮮技術提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試所需阿克蘇冰糖心蘋果于2020年3月8日從天津市西青區(qū)紅旗農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場采購，當日運往天津市農(nóng)業(yè)科學院國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術研究中心(天津)，從中篩選出果肉新鮮飽滿、充分成熟和未損傷的蘋果作為試驗試材。

1.2 主要試劑

聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、95%乙醇，天津市江天化工技術股份有限公司；冰乙酸、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、30% H2O2、無水醋酸鈉，天津市風船化學試劑科技有限公司；聚乙二醇6 000、愈創(chuàng)木酚、NaOH、石英砂、酚酞指示劑，天津市光復精細化工研究所。以上試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

H2500R高速冷凍離心機，湘儀離心機儀器有限公司；TA.XT.Plus型質(zhì)構(gòu)儀，英國SMS公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州天瑞儀器有限公司；FA1004 型電子天平，上海天平儀器廠；UV-1780紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司；DL-1萬用電爐，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；GC2010 氣相色譜儀，日本島津。

1.4 實驗方法

1.4.1 試驗分組處理

本試驗共分為4組，每組80個，共計320個蘋果。在臭氧濃度分別為0、2.14、10.7、19.26 mg/m3的條件下每隔7 d處理1次，每次1 h，貯藏38 d。貯藏溫度為(0±0.5) ℃、相對濕度85%～90 %，在處理前進行生理指標初值的測定，之后每7 d隨機取樣測定生理指標，每個指標進行3次重復測定，然后取平均值。同時將每次處理后的蘋果切成小塊進行液氮快速冷凍，然后放入-80 ℃冰箱中進行冷凍保存，以供備用。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 失重率的測定

采用重量法，單位以%計[11]。

1.5.2 硬度的測定

每次隨機取樣6個，用TA.XT.Plus型質(zhì)構(gòu)儀測定蘋果中段硬度，選擇P/2探頭(Φ2 mm)進行穿刺測量，測定參數(shù)為：測前速率5.0 mm/s，測試速率2.0 mm/s，測后速率5.0 mm/s，穿刺深度10 mm。單位以“kg/cm2”表示，測值取平均，分析程序選用LSP-force[12]。

1.5.3 可滴定酸的測定

采用酸堿滴定法，結(jié)果以%表示，以0.067蘋果酸折算系數(shù)計算[13]。

1.5.4 還原糖的測定

采用斐林試劑滴定法進行測定[14]。

1.5.5 乙烯釋放速率的測定

每次隨機選取6個蘋果，測定3次作為平行。在貯藏溫度條件下，將樣品稱重后在罐內(nèi)密封靜置3 h，使用注射器抽取20 mL罐內(nèi)氣體，用氣相色譜儀程序升溫法測定[15]。采用面積外標法計算乙烯釋放速率。

1.5.6 過氧化物酶的測定

采用比色法，在波長470 nm處，以1 min吸光度變化值增加1時為1個過氧化物酶活性單位，結(jié)果以ΔOD470/(min·g)表示[13]。

1.5.7 多酚氧化酶的測定

采用比色法，在波長420 nm處，以1 min吸光度變化值增加1時為1個多酚氧化酶活性單位，結(jié)果以ΔOD420/(min·g)表示[13]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用Excel 2016，SPSS 20.0進行統(tǒng)計和差異顯著性分析，使用 Origin 2019對圖形進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度臭氧處理對貯藏期阿克蘇蘋果乙烯釋放速率的影響

乙烯是果蔬自身產(chǎn)生的一種內(nèi)源性成熟激素，它能夠影響核酸代謝、激素水平和呼吸速率等重要生理過程，催化果實成熟，加速果實衰老[16]。如圖1所示，隨著貯藏時間的延長，各處理組蘋果的乙烯釋放速率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，0、2.14、10.7、19.26 mg/m3處理組均在第24天時達到乙烯高峰，分別為0.195、0.176、0.155、0.138 μL/(kg·h)，其中19.26 mg/m3處理組乙烯高峰最低。在整個貯藏過程中19.26 mg/m3處理組乙烯釋放率始終處于最低位置，與對照組差異明顯(P<0.05)，表明臭氧處理可以降低乙烯釋放速率，延緩果蔬衰老，且臭氧濃度越高效果越明顯。研究發(fā)現(xiàn)，臭氧處理能夠?qū)е乱蚁┣绑w1-氨基-環(huán)丙烷羧酸降低，抑制乙烯合成途徑中關鍵酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶活性[17]。

圖1 臭氧處理對阿克蘇蘋果乙烯釋放速率的影響Fig.1 Effects of ozone treatment on ethylene release rate of Aksu apple

2.2 不同濃度臭氧處理對貯藏期阿克蘇蘋果失重率的影響

失重率是能夠反映果蔬品質(zhì)和商業(yè)價值的主要指標之一。貯藏過程中失重率改變的原因可能是由于果蔬的蒸騰作用和呼吸作用導致[18]。從圖2可以看出，隨著貯藏時間的延長，各處理組失重率呈現(xiàn)上升趨勢，且處理組的失重率均低于對照組。在整個貯藏期，前10 d失重率上升較快，10 d后上升趨于緩慢，19.26 mg/m3處理組始終保持在較低水平，與對照組存在顯著差異(P<0.05)。貯藏結(jié)束時，對照組的失重率與2.14 mg/m3臭氧處理組數(shù)值相近，但卻是19.26 mg/m3處理組的1.3倍，這表明臭氧可以延緩蘋果失重率的上升，并且濃度越高效果越好，這可能與果實的呼吸強度和果皮表面組織的氣孔運動有關。氣孔的運動方式可以調(diào)控植物體內(nèi)的水分平衡，從而調(diào)控果實失重率。余澤龍[19]研究發(fā)現(xiàn)，臭氧處理可以影響氣孔的開放與閉合，并且具有明顯的濃度依賴性，臭氧抑制關閉氣孔的濃度閾值要低于促進氣孔關閉的閾值。

圖2 臭氧處理對阿克蘇蘋果失重率的影響Fig.2 Effects of ozone treatment on the weight loss rate of Aksu apple

2.3 不同濃度臭氧處理對貯藏期阿克蘇蘋果硬度的影響

在果實成熟過程中，隨著細胞壁組分發(fā)生降解和細胞壁結(jié)構(gòu)改變，果實硬度逐漸降低，出現(xiàn)軟化現(xiàn)象，影響果實的外觀品質(zhì)和貯藏性。如圖3所示，在整個貯藏期內(nèi)，阿克蘇蘋果的硬度呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。貯藏前期，硬度下降趨勢明顯，各處理組形成顯著性差異(P<0.05)，這有可能與貯藏前期阿克蘇蘋果失重率變化較大有關。10 d后，隨著貯藏時間的延長，下降幅度均逐漸降低，但與處理組相比，對照組下降幅度高于處理組。第38天時，19.26 mg/m3處理組硬度為15.442 kg/cm2，對照組硬度為11.923 kg/cm2，19.26 mg/m3處理組硬度顯著高于對照組(P<0.05)。說明，臭氧處理能夠抑制硬度的下降，其中19.26 mg/m3處理組效果最好，這可能與臭氧處理能夠維持細胞膜、細胞壁結(jié)構(gòu)完整，抑制細胞壁降解有關。HAN等[20]通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，臭氧處理組果實表皮結(jié)構(gòu)平整，表面沒有明顯的裂痕和蜂窩狀組織，維持了細胞形態(tài)的完整。肖玥惠子[21]研究發(fā)現(xiàn)，臭氧處理紅地球葡萄可以抑制膜脂過氧化反應和多聚半乳糖醛酸酶活性，延緩果實硬度下降。

圖3 臭氧處理對阿克蘇蘋果硬度的影響Fig.3 Effects of ozone treatment on hardness of Aksu apple

2.4 不同濃度臭氧處理對貯藏期阿克蘇蘋果可滴定酸的影響

可滴定酸是果蔬風味的主要來源，同時也是果實呼吸代謝的底物[22]。從圖4可以看出，阿克蘇蘋果的可滴定酸含量隨著貯藏期的延長，整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。貯藏前10 d，可滴定酸呈現(xiàn)上升趨勢，第10天，0、2.14、10.7、19.26 mg/m3處理組可滴定酸含量分別為0.299%、0.337%、0.369%、0.382%，10 d后各處理組可滴定酸含量均呈下降趨勢。在整個貯藏期間，處理組滴定酸含量始終高于對照組，這可能是因為臭氧處理抑制了果蔬的呼吸作用，從而延緩可滴定酸的下降速率。處理組中，19.26 mg/m3臭氧處理后的蘋果可滴定酸含量最高。因此，19.26 mg/m3處理蘋果有利于保持可滴定酸含量，提高阿克蘇蘋果的貯藏品質(zhì)，這可能與臭氧濃度抑制果蔬能量代謝和可滴定酸參與合成酚類、酯類、氨基酸和芳香物質(zhì)等有關。此外，CHEN等[23]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度臭氧處理組與其他處理相比，檸檬酸合酶和蘋果酸合酶蛋白表達量增加，有利于蘋果酸和其他酸的形成。

圖4 臭氧處理對阿克蘇蘋果可滴定酸的影響Fig.4 Effects of ozone treatment on titratable acid of Aksu apple

2.5 不同濃度臭氧處理對貯藏期阿克蘇蘋果還原糖的影響

從圖5可以看出，對照組一直處于下降趨勢，而處理組的還原糖含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。處理組在前10 d呈現(xiàn)上升趨勢，第10天開始下降，剛開始下降迅速，之后漸漸趨于平緩，這可能是因為貯藏前期，阿克蘇蘋果內(nèi)部的有機物質(zhì)轉(zhuǎn)化成了還原糖，從而導致含量有所增加，而還原糖含量下降的原因可能是與果實本身的呼吸作用和衰老有關[10]。貯藏過程中，19.26 mg/m3處理組下降幅度最小，最終含量顯著高于其他處理組(P<0.05)，這表明臭氧處理蘋果有助于抑制其還原糖的降解，19.26 mg/m3處理組的濃度為最適宜的臭氧濃度。這可能是因為臭氧可以抑制呼吸和乙烯釋放，從而減少了還原糖的消耗。紀海鵬等[24]在使用臭氧處理美人指葡萄的研究中也發(fā)現(xiàn)，臭氧可以抑制還原糖含量的下降，提高果實的營養(yǎng)價值。

2.6 不同濃度臭氧處理對貯藏期阿克蘇蘋果過氧化物酶活性的影響

過氧化物酶(peroxidase，POD)能夠清除活性氧，與果蔬的許多生理過程都有著密切的關系，是存在于果蔬中的一種重要的防御酶之一，它能夠參與活性氧代謝，清除超氧化物歧化酶與超氧陰離子反應產(chǎn)生的H2O2，破壞H2O2與超氧陰離子反應生成的羥自由基，延緩細胞衰老，降低膜脂過氧化程度[25]。如圖6所示，在整個貯藏期中，POD活性呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，處理組的酶活性始終高于對照組。這是因為果蔬在貯藏過程中除了會受到自身衰老的影響外，還有可能會被病原性微生物侵染，從而導致果蔬POD活性增加來抵御不良環(huán)境，延緩衰老。臭氧的強氧化性也會促使POD活性增加。前17 d POD活性增長迅速，之后增長幅度下降，這表明臭氧對POD活性增加的促進作用主要集中在貯藏前期。19.26 mg/m3處理組的POD活性在整個貯藏過程中一直保持在較高水平，第17天開始與對照組差異顯著(P<0.05)。由此可知，19.26 mg/m3為最適臭氧貯藏濃度。

2.7 不同濃度臭氧處理對貯藏期阿克蘇蘋果多酚氧化酶活性的影響

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是果蔬中常見的一種以酮為輔基的酶，它能夠?qū)⒍喾N酚類物質(zhì)及其衍生物催化形成有色的聚合物，導致果蔬發(fā)生褐變[26]。如圖7所示，PPO活性在貯藏期間持續(xù)下降，下降到一定值后，下降速度有所減緩。在整個貯藏過程中，前10 d PPO活性下降緩慢，各組之間沒有顯著性差異(P>0.05)，10 d后PPO活性下降幅度增大，24 d后下降漸漸趨于平緩。貯藏第38天時，0、2.14、10.70、19.26 mg/m3處理組PPO活性分別為0.175、0.142、0.129、0.120 ΔOD420/(min·g)，19.26 mg/m3處理組和對照組有顯著性差異(P<0.05)。表明臭氧處理能夠有效抑制PPO活性，延緩果肉氧化褐變進程。這與紀海鵬等[24]的研究結(jié)果相似。

圖7 臭氧處理對阿克蘇蘋果PPO活性的影響Fig.7 Effects of ozone treatment on the activity of polyphenol oxidase of Aksu apple

3 結(jié)論與討論

果實貯藏過程中產(chǎn)生的乙烯可以介導果實的呼吸高峰，促進果實對可滴定酸、還原糖等呼吸底物的消耗，影響果實的成熟。結(jié)果表明，與對照組相比，臭氧處理可以抑制乙烯的釋放速率，延緩阿克蘇蘋果的成熟衰老。這可能與臭氧可以直接清除乙烯，抑制與乙烯合成相關基因的表達有關[17]。

失重率和硬度與果實商品價值和品質(zhì)密切相關。在采后貯藏期間，果實失重率上升，硬度下降，而臭氧處理可以延緩阿克蘇蘋果的這種變化趨勢，其中，19.26 mg/m3處理組效果最好。這可能與臭氧可以調(diào)控果實的表面組織氣孔的運動方式，降低呼吸作用和蒸騰作用，抑制果實表皮組織的降解等有關。伍小紅等[27]使用臭氧水清洗紅富士蘋果10 min，晾干后在室溫下放置35 d，發(fā)現(xiàn)臭氧可以抑制采后貯藏過程中硬度的下降。

隨著果實貯藏時間的延長，果實需要消耗自身營養(yǎng)物質(zhì)來滿足呼吸代謝、糖代謝等生理代謝的需求。其中，果實可滴定酸和還原糖影響其風味和口感。本研究表明，臭氧處理可以抑制阿克蘇蘋果中還原糖和可滴定酸的降解，維持較好的品質(zhì)。這與張慧杰等[22]的研究結(jié)果相似。

多種酶都與果實褐變有關，果皮褐變以酶促褐變?yōu)橹?，其中多酚氧化酶和過氧化物酶發(fā)揮著重要作用。過氧化物酶可以利用活性氧釋放出酚類物質(zhì)，導致果蔬褐變，臭氧處理能夠促進過氧化物酶活性的升高，提高蘋果的防御能力。多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐變的主要內(nèi)源性激素，隨著果實的衰老，多酚氧化酶呈逐漸降低的趨勢，而臭氧處理可以促進多酚氧化酶活性的下降，延緩褐變，維持果實品質(zhì)。

綜上所述，臭氧在蘋果貯藏保鮮上具有一定的積極效果，可以提高其商業(yè)價值，本研究對其廣泛應用于阿克蘇蘋果具有一定的借鑒意義。