張蕊杰，顧茁，薛辰旭，祝亞輝，王冕，謝翀，王沛，楊潤強*

1(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京，210095)2(西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝，860000)

植源性食物是營養(yǎng)、膳食纖維、礦物質(zhì)和酚類化合物的良好來源[1]。其中酚類化合物具有優(yōu)異的抗氧化能力，以及預(yù)防慢性炎癥、心血管疾病、癌癥和糖尿病等疾病的功能得到廣泛的研究。植物生長過程中酚類物質(zhì)起到一定的生物防御作用、抗逆作用以及生長調(diào)節(jié)作用。植物酚類物質(zhì)合成以苯丙烷代謝途徑為主[2]，見電子版附圖1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.028750)。L-苯丙氨酸經(jīng)苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL)脫氨基形成反式肉桂酸，在肉桂酸-4-羥化酶(cinnamic acid-4-hydroxylase,C4H)作用下生成p-香豆酸，經(jīng)4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate-CoA ligase,4CL)作用生成p-香豆酰輔酶A，最后產(chǎn)生黃酮、花色苷和酚酸等酚類物質(zhì)。種子萌發(fā)時，其部分結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，同時合成新的酚酸類化合物[3]。目前對于植源性食物尤其是芽類食物中酚類化合物的研究較多，CHEN等[3]發(fā)現(xiàn)金絲雀籽在發(fā)芽結(jié)束時游離酚、結(jié)合酚以及總酚含量與生子粒相比顯著增加1 042%、120%和741%。PHAM等[4]對2種加拿大小麥、加拿大西部紅春麥、加拿大西部琥珀杜倫麥的研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)芽過程中，小麥中酚類化合物含量和抗氧化活性增加。此外，籽粒萌發(fā)后，其自身大分子物質(zhì)被降解成容易消化吸收的小分子物質(zhì)，同時抗?fàn)I養(yǎng)因子如植酸等含量顯著降低[5]，從而提升了籽粒營養(yǎng)和功能品質(zhì)。

青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHook.f)為禾本科大麥屬一年生草本植物，為我國藏區(qū)主要的作物和糧食來源[6]。青稞中富含β-葡聚糖、膳食纖維等功能性成分[7]，也是酚類物質(zhì)的良好來源。楊希娟等[8]研究了青藏高原主要栽培品種的不同粒色青稞酚類化合物含量與抗氧化活性的差異，發(fā)現(xiàn)紫色、藍色、黑色、黃色組青稞中酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性最高的品種分別為云青2 號、循化亮藍、947和短白青稞。靳玉龍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，藏區(qū)紫青稞7個品種中酚類物質(zhì)和總黃酮含量差異較大?？梢?，青稞品種是萌發(fā)富集酚類物質(zhì)的第一影響因素。此外，不同發(fā)芽條件對于植物種子酚類物質(zhì)積累也有一定影響，KRUMA等[10]研究發(fā)現(xiàn)，除燕麥種子浸泡后總酚含量顯著降低外，小麥、黑麥、黑小麥、大麥等谷物浸泡后總酚含量均顯著增加。萌發(fā)12 h后大麥、小麥總酚含量沒有顯著變化，黑麥和小黑麥的總酚含量降低，燕麥的總酚含量增加，隨著萌發(fā)時間的延長，酚類物質(zhì)得到持續(xù)積累。因此，研究萌發(fā)條件對增加谷物中酚類物質(zhì)至關(guān)重要。

本研究以我國藏區(qū)產(chǎn)果洛、喜馬拉雅22號、喜馬拉雅19號、冬青1號、藏青2000和藏青690等6個品種的青稞作為材料，分析其預(yù)萌芽后酚類物質(zhì)含量變化，優(yōu)選品種；研究萌發(fā)條件對青稞酚類物質(zhì)積累的影響，為開發(fā)富含酚類物質(zhì)的預(yù)萌芽青稞提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

青稞由西藏農(nóng)牧學(xué)院植物科學(xué)學(xué)院實習(xí)農(nóng)場提供，來源及編號見表1。經(jīng)挑選、除雜后的青稞籽粒50 g，用1% NaClO溶液消毒15 min，用去離子水沖洗至pH中性。在30 ℃條件下用去離子水浸泡6 h，浸泡過的青稞籽粒用去離子水沖洗2次。將浸泡后的青稞籽粒均勻鋪在發(fā)芽機(夢飛揚科技有限公司)苗盤上，在設(shè)定的萌發(fā)條件下進行發(fā)芽，每24 h換水1次，每次1 L。

表1 供試青稞種質(zhì)材料地理來源及編號Table 1 Geographical sources and numbers of tested highland barley

品種篩選：浸泡的青稞在30 ℃條件下避光發(fā)芽36 h，測定發(fā)芽率、芽長、株重和呼吸強度；取發(fā)芽36 h的青稞，測定總酚、酚酸含量以及PAL、C4H、4CL活力。

萌發(fā)條件研究：控制發(fā)芽溫度為30 ℃，研究發(fā)芽時間(0、36、54、72 h)以及控制發(fā)芽時間為36 h，研究發(fā)芽溫度(25、30、35、40 ℃)對青稞酚類物質(zhì)含量的影響。然后對發(fā)芽時間和溫度進行Miscellaneous響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化，因素水平見表2。

表2 響應(yīng)曲面分析因素水平Table 2 Response surface analysis factors and levels

1.2 指標(biāo)測定

呼吸強度：采用小籃子法測定[11]。

芽長：隨機選取30株青稞芽苗，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量其芽長，結(jié)果以mm表示。

鮮重(fresh weight,FW)：隨機選取100株新鮮的青稞芽苗為1組并稱取其質(zhì)量，即為100株青稞芽苗的FW，重復(fù)稱量3組，結(jié)果以g/100株表示。

干重(dry weight,DW)：隨機選取100株新鮮的青稞芽苗為1組，冷凍干燥后稱取其質(zhì)量，即為100株青稞芽苗的DW，重復(fù)稱量3組，結(jié)果以g/100株表示。

酚類物質(zhì)提?。翰捎肕A等[12]的方法。取預(yù)萌芽青稞經(jīng)真空冷凍干燥，粉碎后過40目篩得到青稞粉，提取游離酚和結(jié)合酚。

酚類物質(zhì)含量測定：采用MA等[12]的方法測定預(yù)萌芽青稞游離酚、結(jié)合酚及總酚物質(zhì)含量?？偡雍恳詍g GAE/100 g DW計。

酚酸含量：采用CHEN等[13]的方法測定預(yù)萌芽青稞的酚酸含量。

PAL活力：參照ASSIS等[14]的方法，稍作修改。以每小時每克青稞芽苗(FW)酶促反應(yīng)體系吸光度值增加0.01為一個PAL活力單位(U)，表示為0.01△OD290/(h·g)，即U/g。

C4H活力：參照HAN等[15]的方法，稍作修改。以每分鐘每克青稞芽苗(FW)酶促反應(yīng)體系吸光度值增加0.01為一個C4H活力單位(U)，表示為0.01△OD340/(min·g)，即U/g。

4CL活力：參照HAN等[15]的方法，稍作修改。以每分鐘每克青稞芽苗(FW)酶促反應(yīng)體系吸光度值增加0.01為一個4CL活力單位(U)，表示為0.01△OD333/(min·g)，即U/g。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，顯著性水平為P<0.05。實驗設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 萌發(fā)青稞品種生理代謝變化

由表3可知，喜馬拉雅22號萌發(fā)36 h時發(fā)芽率為87.33%，顯著高于其他5個品種。喜馬拉雅19號在發(fā)芽36 h時芽長達到組間最大值，而此時藏青2000的芽長最短。發(fā)芽36 h時藏青690鮮重顯著高于其他品種，此時果洛青稞鮮重顯著低于其他品種，二者的干重也體現(xiàn)出同樣的趨勢。喜馬拉雅19號和冬青1號的呼吸強度顯著高于其他品種，果洛的呼吸強度則顯著低于其他品種。

表3 不同青稞品種萌發(fā)36 h的生理變化Table 3 Physiological changes of different barley varieties at 36 h of germination

2.2 萌發(fā)青稞品種總酚含量

由圖1可知，喜馬拉雅19號、冬青1號以及藏青2000三個品種的總酚酸含量顯著高于其他品種，其中喜馬拉雅19號和冬青1號的結(jié)合酚含量也顯著高于其他品種，而冬青1號和藏青2000的游離酚含量顯著高于其他品種。

a-游離酚；b-結(jié)合酚；c-總酚圖1 不同萌芽品種青稞的游離酚、結(jié)合酚和總酚含量Fig.1 Effects of different varieties on the free, bound and total phenolics content in germinated highland barley注：圖中I～VI分別表示果洛、喜馬拉雅22號、喜馬拉雅19號、冬青1號、藏青2000、藏青690的青稞品種；不同小寫字母表示品種間存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3 萌發(fā)青稞品種酚酸含量

從表4可知，供試的6個品種發(fā)芽青稞的結(jié)合酚酸含量均高于其對應(yīng)的游離酚酸含量，結(jié)合酚酸是發(fā)芽青稞酚酸的主要存在形式。其中芥子酸是發(fā)芽青稞中的主要酚酸，且主要以結(jié)合態(tài)存在。6個品種青稞中，均未檢測到丁香酸。喜馬拉雅22號中檢測到?jīng)]食子酸、原兒茶酸、對苯酚、香草酸和芥子酸均以結(jié)合態(tài)存在，喜馬拉雅19號青稞中檢測到的酚酸大多以結(jié)合態(tài)存在，其中沒食子酸和對香豆酸以游離態(tài)存在。冬青1號、藏青2000中的阿魏酸以游離態(tài)存在。冬青1號和藏青2000中酚酸組成一致，結(jié)合態(tài)酚酸分別占71.33%和63.01%。供試品種冬青1號中總酚酸含量最高。

表4 不同萌芽青稞品種中的酚酸組成及含量Table 4 The composition and content of phenolic acids in different varieties of germinated highland barley

續(xù)表4

2.4 萌發(fā)青稞品種苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活力測定

由圖2可知，供試6種發(fā)芽青稞中PAL酶活力無顯著性差異，其中冬青1號PAL酶活力最高為40.3 U/g FW。C4H酶活力具有顯著性差異，其中冬青1號C4H酶活力為35.6 U/g FW，高于其他5個品種。喜馬拉雅19號的4CL酶活力差異顯著，為220.1 U/g FW，顯著高于其他5個品種。

a-PAL;b-C4H;c-4CL圖2 不同品種青稞的PAL、C4H和4CL酶活力測定Fig.2 Effects of different varieties on the PAL, C4H and 4CL activity of germinated highland barley

2.5 青稞萌發(fā)條件研究

2.5.1 萌發(fā)時間和溫度對青稞總酚含量的影響

以冬青1號青稞為試材，控制溫度30 ℃，研究萌發(fā)時間對酚類含量的影響。由圖3-a可知，萌發(fā)顯著提高青稞總酚含量，但是36～72 h差異不顯著。游離酚含量隨發(fā)芽時間的延長呈降低趨勢，說明在發(fā)芽過程中游離酚酸會被降解或溶出。青稞中結(jié)合酚含量隨發(fā)芽時間呈增加趨勢，當(dāng)發(fā)芽時間為36 h時達到最高。

控制發(fā)芽時間為36 h，研究不同發(fā)芽溫度(25、30、35、40 ℃)對酚類物質(zhì)含量的影響。圖3-b顯示，隨著發(fā)芽溫度的升高，青稞中總酚含量呈先增加后降低的趨勢，當(dāng)發(fā)芽溫度為25和30 ℃時總酚含量最高。當(dāng)發(fā)芽溫度為35 ℃時，發(fā)芽青稞中總酚、游離酚和結(jié)合酚含量均低于其他組。發(fā)芽溫度提高到40 ℃時，酚類含量高于35 ℃時的含量。

a-發(fā)芽時間;b-溫度圖3 不同發(fā)芽時間和溫度下酚類物質(zhì)含量Fig.3 Phenolics content at different germination time points and temperatures of germination注：同一指標(biāo)上不同小寫字母表示處理間存在顯著性差異(P<0.05)

2.5.2 萌發(fā)條件優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選用兩因素三水平Miscellaneous實驗設(shè)計對萌發(fā)富集酚類物質(zhì)的條件進行優(yōu)化，試驗方案及結(jié)果見表5。

利用Design Expert 8.0軟件，對表5中數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到發(fā)芽時間、溫度與總酚含量預(yù)測值的二次多項回歸方程：

y(總酚含量)=221.91+28.43A-31.50B+3.24AB-1.86A2+28.64B2+10.12A2B+1.81AB2

萌發(fā)時間和溫度對總酚含量都有顯著的影響(P<0.05)。但是，兩者之間對總酚含量的影響交互作用不顯著(P>0.05)。由圖4可知，隨著發(fā)芽時間延長，總酚含量呈上升趨勢，隨著發(fā)芽溫度的升高，總酚含量呈先下降后略微上升趨勢。由回歸方程可得到萌發(fā)富集青稞酚類物質(zhì)的最佳條件為：萌發(fā)時間47.68 h，溫度25.02 ℃。經(jīng)驗證，在此條件下(萌發(fā)時間48 h，萌發(fā)溫度25 ℃)，總酚含量可達296.72 mg GAE/100 g DW，是原料青稞(201.62 mg GAE/100 g DW)的1.47倍，說明本實驗所擬合的二次多項式模型可預(yù)測青稞萌發(fā)條件和試驗響應(yīng)值之間的關(guān)系。

表6 響應(yīng)曲面方差分析結(jié)果Table 6 The ANOVA results of response surface analysis

圖4 響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface figure

3 結(jié)論與討論

種子在萌發(fā)過程中，內(nèi)源酶系被激活和合成新的水解酶，一些大分子營養(yǎng)物質(zhì)被分解，形成小分子物質(zhì)有利于種子萌發(fā)，此外也更容易被人體消化吸收。同時，種子中原不含有或含量極低的功能性物質(zhì)如抗壞血酸[16]、γ-氨基丁酸、酚類等物質(zhì)[17]被合成，并且一些抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)如植酸[18]等被降解，從而提高其營養(yǎng)和功能品質(zhì)。本研究結(jié)果表明，不同品種青稞的芽長、鮮/干重比、呼吸速率等生理指標(biāo)差異顯著(表3)。雖然喜馬拉雅22號發(fā)芽率高，但是芽長、鮮重均較低。喜馬拉雅19號和冬青1號青稞呼吸速率強，同時鮮重較高，說明這2個品種在發(fā)芽后生命活動強，代謝活動旺盛。白盼等[19]研究表明，青稞籽粒未發(fā)芽時，代謝酶活力低，并且大多以無活性的酶原形式存在。只有在開始發(fā)芽時，胚中會釋放一種植物激素—赤霉素，在赤霉素的作用下，大量酶類被合成[20]。在這些酶的作用下，營養(yǎng)物質(zhì)完成降解和轉(zhuǎn)化。

本研究中，雖然供試的6個青稞品種均在青藏高原栽培，但是其酚類物質(zhì)含量差異顯著(圖1)。不同品種發(fā)芽青稞酚類物質(zhì)含量結(jié)果表明，發(fā)芽36 h后冬青1號的游離酚、結(jié)合酚及總酚含量均為最高。說明冬青1號青稞適合用于萌發(fā)富集酚類物質(zhì)。根據(jù)酚類化合物的生物合成途徑，PAL催化苯丙氨酸形成反式肉桂酸，是催化酚類化合物合成的起始反應(yīng)，在酚類化合物合成中起到極其重要的調(diào)控作用。C4H催化反式肉桂酸形成對香豆酸，是酚類化合物合成的第二步反應(yīng)。4CL催化對香豆酸形成的對香豆酰輔酶A是多種酚酸合成分支的重要前體物質(zhì)[21]。本研究結(jié)果表明，供試青稞的PAL活性無顯著差異，C4H活力在冬青1號青稞中最高，但是喜馬拉雅19號青稞中4CL活力最高，這可能與6個青稞品種本底酶活力的高低有關(guān)。有研究表明，由于發(fā)芽過程中酶活力的提高，燕麥酚類物質(zhì)含量得以提高。蕎麥發(fā)芽產(chǎn)生的酚酸和黃酮類等次級代謝產(chǎn)物主要通過苯丙烷代謝途徑合成，其中PAL是限速酶[23]。故PAL在酚類物質(zhì)合成過程中具有重要的作用。不同品種青稞的內(nèi)源酶有差異，導(dǎo)致芽長、鮮/干重比、呼吸速率等指標(biāo)有差異。研究表明，谷物中酚類物質(zhì)以酚酸為主，其中結(jié)合態(tài)的對香豆酸和阿魏酸為谷物中的主要酚酸[12]。然而在本研究中，游離型的沒食子酸、結(jié)合型的香草酸和芥子酸為青稞中的主要酚酸(表4)，并且與平原產(chǎn)青稞相比，酚酸組分更少[12]。除了品種差異外，還可能與栽培環(huán)境有關(guān)。

優(yōu)選青稞品種后，通過單因素分析的方法研究發(fā)芽時間和溫度對酚類物質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明，在萌發(fā)過程中，總酚含量升高，但是游離酚含量略有下降(圖3-a)，可能在浸泡和淋水發(fā)芽過程中游離酚溶出導(dǎo)致含量下降。趙珮等[24]研究表明在萌發(fā)過程中，酚類含量隨萌發(fā)時間的變化不完全相同，本研究結(jié)果與之相一致。此外，本實驗結(jié)果表明，低溫(25～30 ℃)更有助于酚類物質(zhì)的積累(圖3-b)。與其他溫度條件相比，35 ℃不利于酚類物質(zhì)的累積。前人研究結(jié)果也顯示青稞在35 ℃下萌發(fā)，酚類物質(zhì)含量與25和30 ℃無顯著差異[25]。冬青1號青稞產(chǎn)自西藏，為耐寒耐旱品種，生長環(huán)境溫度為25～30 ℃，當(dāng)溫度為35 ℃時，不利于該品種生長，可能影響酚類物質(zhì)的合成。當(dāng)溫度為40 ℃時，發(fā)芽青稞處于高溫脅迫狀態(tài)，可能激活了苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶，催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酚類物質(zhì)。通過進一步的響應(yīng)面實驗，在選定的發(fā)芽時間和發(fā)芽溫度范圍內(nèi)，獲得了最優(yōu)條件為發(fā)芽時間48 h和溫度25 ℃，與單因素試驗結(jié)果相符合。

綜上，供試的6個青稞品種中，結(jié)合萌發(fā)及其生長代謝與酚類合成情況，優(yōu)選冬青1號青稞為萌發(fā)富集酚類物質(zhì)的品種，冬青1號青稞中酚酸組成較少，且主要以游離型的沒食子酸以及結(jié)合型的香草酸和芥子酸為主。萌發(fā)時間和溫度對總酚含量有顯著的影響，采用響應(yīng)面法對萌發(fā)條件進行優(yōu)化后得到的最佳組合為萌發(fā)時間48 h和溫度25 ℃。