靳祖瓏，馮思怡，胡亞雯，宋洪東，管驍*，孫注，戴智華

1(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院/國家糧食產(chǎn)業(yè)(城市糧油保障)技術(shù)創(chuàng)新中心，上海，200093) 2(內(nèi)蒙古燕谷坊生態(tài)農(nóng)業(yè)科技(集團(tuán))股份有限公司， 內(nèi)蒙古 呼和浩特，011700) 3(麥稻智慧糧食有限公司，上海，200241)

近年來，科學(xué)家們持續(xù)關(guān)注植物資源的開發(fā)利用，谷物和豆類中含有豐富的蛋白質(zhì)，約占其質(zhì)量的7%～15%，是蛋白質(zhì)的良好來源。在谷類和豆類作物的深加工中，蛋白質(zhì)因未被有效利用而產(chǎn)生極大的浪費(fèi)。蛋白質(zhì)基的納米載體是目前的研究熱點(diǎn)，高效、低毒、廉價(jià)、實(shí)用的新納米材料具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。白蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆分離蛋白已被證明是實(shí)用的蛋白納米載體。燕麥年產(chǎn)量高，但燕麥蛋白在納米領(lǐng)域的應(yīng)用研究相對(duì)較少。燕麥?zhǔn)且荒晟瘫究浦参?，種子中蛋白質(zhì)含量約為12%～20%，為蛋白質(zhì)含量最高的谷類[2]，且燕麥蛋白有較高的生物活性，十分適合食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

蛋白質(zhì)基納米載體是一種有效的運(yùn)載體系，能夠提高小分子活性物質(zhì)的溶解性和生物利用度，同時(shí)具有高安全性和容易制備的特點(diǎn)，因此在食品和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。然而在實(shí)際應(yīng)用中一部分蛋白具有很強(qiáng)的疏水性，難以在水中穩(wěn)定分散且表面活性較低，使其應(yīng)用價(jià)值大打折扣[3]。蛋白質(zhì)水解是一種操作簡(jiǎn)便且效果顯著的改良方法，能夠大大增加納米載體的水溶性[4-5]。蛋白質(zhì)經(jīng)過人體消化酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)水解后得到的肽具有耐消化的特點(diǎn)，不容易在消化道中進(jìn)一步分解[6]。同時(shí)，作為壁材的肽也具有一定的生物活性，能做為營養(yǎng)補(bǔ)劑達(dá)到高效利用的效果。

咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester, CAPE)來源于蜂膠，是其中的主要活性成分之一。CAPE具有多種功能活性，抗炎、抗癌、抗氧化和抗病毒效果顯著。然而CAPE的苯環(huán)結(jié)構(gòu)使其極難在水中分散，同時(shí)苯環(huán)上的酚羥基也容易氧化，這使得CAPE難以在人體中有效發(fā)揮功效。通過構(gòu)建肽納米顆粒可增大CAPE在水中的溶解性，同時(shí)保護(hù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)完整[7-8]。研究肽納米顆粒的組成模式并對(duì)耐消化肽納米載體進(jìn)行評(píng)估，可為深入研究和探索耐消化肽應(yīng)用價(jià)值提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料試劑

燕麥米，河北省淶水縣金谷糧油食品有限公司，產(chǎn)地為淶水縣。

正己烷、NaOH、鹽酸、二硫蘇糖醇、尿素、正十六烷、磷鎢酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡聚糖凝膠G-75，源葉生物科技有限公司；胃蛋白酶(P-7000)、胰酶(P-1750)、胰蛋白酶(93615)，Sigma-Aldrich公司；咖啡酸苯乙酯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

KjeltecTM8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀，丹麥FOSS分析儀器有限公司；NanoBrook 173Plus多角度動(dòng)態(tài)光散射儀，美國Brookhaven儀器公司；VCA Optima接觸角測(cè)量?jī)x，美國AST產(chǎn)品股份有限公司；JEM-2100透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；F7000熒光分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 燕麥分離蛋白提取

采用堿溶酸沉法提取燕麥分離蛋白。取脫脂燕麥粉，以料液比1∶10(g∶mL)加入去離子水，調(diào)節(jié)pH至10.0，攪拌提取1 h。以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液調(diào)節(jié)pH至4.5，在4 ℃下靜置30 min待蛋白析出，離心以沉淀蛋白，用去離子水分散蛋白并調(diào)節(jié)pH至中性后離心，冷凍干燥即得到燕麥分離蛋白，在-20 ℃下密封保存。

1.2.2 燕麥分離蛋白組分測(cè)定

蛋白含量測(cè)定采用凱氏定氮法，蛋白含量換算系數(shù)為5.83。油脂含量測(cè)定采用甘油三酯測(cè)試盒法。多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法。

1.2.3 蛋白水解度評(píng)估

以pH-Stat法對(duì)蛋白酶解過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)并計(jì)算最終水解度[9-10]。

胃蛋白酶酶解：將200 mg燕麥分離蛋白分散于20 mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，升溫至37 ℃，加入1 mL 5 mg/mL的胃蛋白酶鹽酸溶液(pH 2.0)，并用3 mol/L的鹽酸維持pH在2.0。分別在10、30、60、90、120 min統(tǒng)計(jì)鹽酸的總消耗量，計(jì)算燕麥分離蛋白在胃消化中水解度(degree of hydrolysis，DH)，如公式(1)所示：

(1)

式中：V，滴定消耗的鹽酸體積，mL；c，鹽酸的摩爾濃度，mmol/mL；m，蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；htot，單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中的肽鍵摩爾數(shù)，取8.33 mmol/g；αCOOH(pH)，羧基的平均解離度。

胰酶/胰蛋白酶酶解：將200 mg燕麥分離蛋白分散于20 mL水中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.4并升溫至37 ℃，將10 mg胰酶/胰蛋白酶分散在1 mL pH 7.4的Na2CO3緩沖液中并加入酶解體系，用0.5 mol/L的NaOH溶液維持pH在7.4。分別在10、30、60、90、120 min統(tǒng)計(jì)NaOH溶液的總消耗量，計(jì)算燕麥分離蛋白在腸消化中的DH，如公式(2)所示：

(2)

式中：V，滴定消耗的NaOH溶液體積，mL；c，NaOH溶液濃度，mmol/mL；αNH2(pH)，氨基的平均解離度。

1.2.4 燕麥分離蛋白體外消化

為確保燕麥蛋白被胃蛋白酶和胰蛋白酶完全水解，參考1.2.3中酶與底物比例和酶解時(shí)間，消化時(shí)間定為2 h，此時(shí)得到耐消化肽納米顆粒，不會(huì)被消化酶進(jìn)一步水解。

模擬胃液(simulated gastric fluid, SGF)：將250 mg胃蛋白酶分散在100 mmol/L的PBS中，調(diào)節(jié)pH至2.0并定容至500 mL。

模擬腸液(simulated intestinal fluid, SIF)：將500 mg胰酶分散在100 mmol/L的PBS中，調(diào)節(jié)pH至7.4并定容至500 mL。

模擬體外消化：將1 g燕麥分離蛋白分散在50 mL 100 mmol/L的PBS中并調(diào)節(jié)pH至2.0，并另取50 mL SGF同時(shí)在37 ℃下溫育5 min。將SGF加入蛋白分散液，在37 ℃下水浴振蕩2 h。模擬胃消化結(jié)束后調(diào)節(jié)pH至7.4，并加入100 mL SIF，模擬腸消化2 h，并在消化結(jié)束后水浴煮沸5 min。離心除去不溶成分后，將上清液凍干得燕麥耐消化肽，于-20 ℃下密封保存。

1.2.5 燕麥肽納米顆粒尺寸測(cè)定

將燕麥肽凍干粉分散在去離子水中，配成質(zhì)量濃度1 mg/mL的溶液。靜置0.5 h后，用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)定納米顆粒的尺寸和多分散系數(shù)。

1.2.6 燕麥肽納米顆粒形貌觀測(cè)

通過透射電子顯微鏡觀察，將燕麥肽配成質(zhì)量濃度1 mg/mL的溶液，滴加10 μL納米顆粒溶液于碳支持膜上，靜置2 min后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的磷鎢酸溶液染色，并在室溫下自然干燥。在200 kV場(chǎng)加速電壓下對(duì)納米顆粒進(jìn)行成像觀察。

1.2.7 內(nèi)部相互作用力分析

分別將1 mg燕麥肽溶解于十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)和尿素(Urea)的單一溶液和復(fù)合溶液中(SDS+DTT,DTT+Urea，SDS+Urea和SDS+DTT+Urea)，其中SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、DTT濃度為30 mmol/L、Urea濃度為6 mol/L[11-12]。以去離子水為溶劑作為對(duì)照。

1.2.8 燕麥肽納米顆粒表面活性評(píng)估

通過接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)定水表面張力并對(duì)納米顆粒的表面活性進(jìn)行評(píng)估，測(cè)定方法為懸滴法。

1.2.9 燕麥肽-CAPE納米顆粒制備及包封效果評(píng)估

制備：稱取20 mg CAPE溶于1 mL乙醇中制成母液。配制10 mL燕麥肽溶液，加入100 μL CAPE乙醇溶液后，在超聲細(xì)胞破碎儀中以240 W功率超聲波處理5 min[12-13]。在1 000×g下離心2 min并重復(fù)5次，除去未被包封的CAPE。過飽和CAPE水溶液通過離心法制備。

包封率及載藥量計(jì)算：取制備的燕麥肽-CAPE納米顆粒溶液100 μL，用乙醇定容至1 mL。以CAPE乙醇母液配制1、5、10、15、20 μg/mL的CAPE乙醇溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用酶標(biāo)儀測(cè)定載藥納米顆粒在323 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CAPE的包封率及載藥量。同時(shí)測(cè)定并計(jì)算飽和CAPE水溶液中CAPE濃度?？蛰d體溶液吸光度作為空白對(duì)照。包封率及載藥量的計(jì)算如公式(3)、(4)所示：

(3)

(4)

1.2.10 燕麥肽-CAPE納米顆粒胃腸消化特性

按1.2.9中的方法制備新鮮的燕麥肽-CAPE納米顆粒，以體積比1∶1分別與SGF和SIF混合，取1 mL混合液置于10 kDa的透析袋，在9 mL不含酶的SGF和SIF中連續(xù)透析2 h，每隔30 min從外側(cè)透析液中取1 mL并補(bǔ)充1 mL新透析液，測(cè)定釋放出的CAPE質(zhì)量。整個(gè)體外模擬消化在37 ℃振蕩水浴中進(jìn)行。胃腸消化各做3組平行，CAPE累計(jì)釋放率計(jì)算如公式(5)所示：

(5)

1.2.11 燕麥肽-CAPE納米顆粒穩(wěn)態(tài)熒光光譜

配制多份10 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的燕麥肽納米顆粒溶液，將濃度10 mmol/L的CAPE乙醇母液加入肽納米顆粒溶液中，配制成CAPE濃度為0、5、10、20、40、60、80、100 mmol/L的燕麥肽-CAPE納米顆粒溶液，并用超聲法輔助包埋。設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)光狹縫5 nm，發(fā)射光狹縫10 nm，掃描速度2 000 nm/min，掃描范圍為300～450 nm，對(duì)各個(gè)濃度的燕麥肽-CAPE納米顆粒溶液進(jìn)行熒光光譜掃描，分別在25和37 ℃下以同樣參數(shù)掃描。

1.2.12 統(tǒng)計(jì)分析

每次實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行，圖表中的數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。顯著性分析(P<0.05)由 SPSS 20.0軟件分析后得到，不同的字母代表差異顯著。用GraphPad Prism軟件進(jìn)行擬合分析并繪制成圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥分離蛋白組成成分分析

經(jīng)測(cè)定，燕麥分離蛋白純度為(75.69±0.14)%，殘存油脂含量約為(10.57±0.00)%，多糖含量為(10.04±0.16)%。

2.2 燕麥分離蛋白水解度評(píng)估

用胃蛋白酶、胰酶和胰蛋白酶對(duì)燕麥分離蛋白進(jìn)行水解并測(cè)定水解度，結(jié)果見圖1。由于pH值在1.5 h后趨于穩(wěn)定，選擇2 h為體外模擬消化時(shí)間。胃蛋白酶酶解最終水解度為3.1%，胰酶為16.9%，胰蛋白酶為10.7%。由于胰脂肪酶水解油脂也會(huì)導(dǎo)致pH降低，這會(huì)導(dǎo)致蛋白在小腸的水解度計(jì)算值偏高。因此認(rèn)為10.7%為燕麥分離蛋白腸消化的水解度。

圖1 燕麥分離蛋白水解曲線Fig.1 Hydrolysis curve of oat protein isolate

2.3 燕麥肽納米顆粒的尺寸分析

大豆分離蛋白、玉米醇溶蛋白和乳清蛋白已被廣泛研究證明通過酶解法制備納米載體是合理且可靠的手段。DONG等[14]使用堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白并通過超聲輔助法制備了大豆聚集肽-EGCG納米顆粒，尺寸約為87 nm。JIANG等[15]酶解α-乳清蛋白并用水解肽構(gòu)建了具有pH響應(yīng)性的納米載體。本研究中燕麥耐消化肽被證明具有自組裝能力，能夠形成具有一定尺寸和結(jié)構(gòu)的納米顆粒。如圖2所示，動(dòng)態(tài)光散射結(jié)果顯示燕麥蛋白消化后，自發(fā)形成尺寸為(51.80±1.62) nm的納米結(jié)構(gòu)。CHITHRANI等[16]的研究表明，納米顆粒直徑在50 nm左右被腸細(xì)胞攝取量最高。

圖2 燕麥肽納米顆粒粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of oat peptide nanoparticles

圖3中透射電子顯微鏡(1 μm尺度)可以觀察到主要含有2種微粒結(jié)構(gòu)。其中10～100 nm的納米顆粒數(shù)量較多，可歸類為膠束。小尺寸的納米顆粒具有極高的比表面積，易吸附于大尺寸的納米顆粒表面或者聚集成簇。同時(shí)可以觀察到另一種囊泡結(jié)構(gòu)，數(shù)量較少，但形狀均勻，直徑在500 nm以上。一般認(rèn)為，小尺寸的膠束能夠較順利地穿過小腸黏液屏障，而大尺寸的囊泡難以進(jìn)入黏液網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)因而吸附在黏液表面。

圖3 燕麥肽納米顆粒的TEM照片F(xiàn)ig.3 TEM photographs of oat peptide nanoparticles

2.4 燕麥肽納米顆粒內(nèi)部相互作用

氫鍵、疏水相互作用、靜電作用、范德華力是肽自發(fā)聚集形成納米結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動(dòng)力[17]，二硫鍵在蛋白/肽結(jié)構(gòu)中也有著重要作用。如圖4所示，單獨(dú)或復(fù)合使用3種蛋白變性劑得到的結(jié)果顯示，疏水作用是燕麥肽納米顆粒形成的主要驅(qū)動(dòng)力[18-20]。變性劑誘導(dǎo)的納米顆粒尺寸變化可分析顆粒內(nèi)部相互作用(P<0.05),單獨(dú)使用SDS變性劑使得納米顆粒尺寸略微變大但并不顯著，而單獨(dú)使用尿素變性劑納米顆粒尺寸沒有變化。SDS和尿素復(fù)配使用時(shí)納米顆粒尺寸顯著變大，這是因?yàn)?種變性劑對(duì)疏水作用的破壞效果疊加，原本納米顆粒內(nèi)部較為致密緊湊的結(jié)構(gòu)變得松散。當(dāng)SDS、DTT和尿素共同作用時(shí)，相比于SDS和尿素復(fù)配使用納米顆粒的尺寸顯著變小。這可能是因?yàn)楫?dāng)SDS和尿素破壞疏水作用后，二硫鍵依然存在并阻止整個(gè)納米顆粒分裂成較小的顆粒。進(jìn)一步添加DTT破壞二硫鍵后，得到的納米顆粒碎片雖然和原始納米顆粒尺寸相當(dāng)，但這些碎片結(jié)構(gòu)更加松散。因此可以初步判斷，整個(gè)納米顆粒形成的主要驅(qū)動(dòng)力為疏水相互作用，而二硫鍵對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定也起一定作用。

1-水；2-十二烷基硫酸鈉；3-二硫蘇糖醇；4-尿素；5-十二烷基硫酸鈉+二硫蘇糖醇；6-二硫蘇糖醇+尿素；7-尿素+十二烷基硫酸鈉；8-十二烷基硫酸鈉+二硫蘇糖醇+尿素圖4 不同變性劑處理后燕麥肽納米顆粒尺寸Fig.4 Size of oat peptide nanoparticles treated with different denaturants

2.5 燕麥肽納米顆粒表面性質(zhì)

納米顆粒的表面性質(zhì)對(duì)其應(yīng)用具有重要的參考價(jià)值[21]。燕麥肽溶液中一部分表面疏水的納米顆粒和一些具有疏水性的多肽在液滴中難以相對(duì)穩(wěn)定地做布朗運(yùn)動(dòng)，這些溶質(zhì)趨向于逃逸，因此會(huì)在短時(shí)間內(nèi)吸附在氣-液表面。這種逃逸行為產(chǎn)生的力與表面張力相反，因此可以認(rèn)為疏水性越強(qiáng)，其降低表面張力的能力越強(qiáng)。圖5-a表明，燕麥肽溶液隨著肽濃度的增大，其空氣-水表面張力逐漸減小，在肽質(zhì)量濃度1 mg/mL時(shí)表面張力約為53 mN/m。燕麥蛋白溶液在蛋白質(zhì)量濃度1 mg/mL時(shí)表面張力為41 mN/m，顯然酶解后燕麥肽納米顆粒的親水性大大增強(qiáng)。水解增強(qiáng)了肽的柔性，使納米顆粒表面的親水氨基酸增多。燕麥肽納米顆粒表面具有一定疏水性，能夠降低水的表面張力，這可能是由于納米顆粒在界面吸附時(shí)誘發(fā)表層肽的去折疊[22-24]。而圖5-b中，隨著燕麥肽濃度的逐漸增大十六烷-水界面張力逐漸減小，顯然燕麥肽納米顆粒對(duì)油脂類有一定親和性。總體來說，燕麥肽納米顆粒具有優(yōu)良的表面活性，其親疏水性適中，作為天然無毒的材料有著較廣泛的使用前景。

a-燕麥蛋白、燕麥肽納米顆粒空氣-水表面張力;b-燕麥肽納米顆粒十六烷-水界面張力圖5 燕麥肽納米顆粒的界面吸附Fig.5 Interfacial adsorption of oat peptide nanoparticles

2.6 燕麥肽-CAPE納米顆粒包載力評(píng)估

CAPE中的酯鍵在一定條件下會(huì)自發(fā)水解，而酚羥基則容易誘導(dǎo)氧化反應(yīng)。作為壁材的燕麥肽具有一定抗氧化性，能夠保護(hù)內(nèi)部的CAPE。經(jīng)計(jì)算得燕麥肽-CAPE納米顆粒的包封率為(71.71±3.21)%，載藥量為(3.59±0.16)%。包封后CAPE在水中分散質(zhì)量濃度能達(dá)到140 μg/mL，而測(cè)定CAPE在水中的溶解度為(1.80±0.11)μg/mL，因此燕麥肽納米顆粒可以有效提升CAPE在水中的分散性。這可能與CAPE中苯環(huán)的結(jié)構(gòu)有關(guān)，一般認(rèn)為苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸3種芳香族氨基酸具有最強(qiáng)的疏水性，CAPE中的苯環(huán)和燕麥肽中的苯環(huán)能夠在相互接近時(shí)形成π-π共軛結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)燕麥肽-CAPE納米顆粒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[25]。

2.7 燕麥肽-CAPE納米顆粒耐消化性評(píng)估

消化酶水解制備的燕麥耐消化肽納米載體具有耐消化性。如圖6所示，燕麥肽-CAPE納米顆粒在模擬胃腸液中連續(xù)消化2 h，CAPE的累計(jì)釋放率較小，其中在模擬胃液中釋放23%，在模擬腸液中釋放7%。由于絕大部分可被胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的肽鍵已被水解，燕麥肽-CAPE納米顆粒在模擬消化液中受消化酶影響較小。在模擬胃液中累計(jì)釋放率比模擬腸液中的累計(jì)釋放率高，主要原因可能是pH較低引起納米顆粒內(nèi)部靜電相互作用的改變，整體結(jié)構(gòu)變得更疏松。通常胃排空所需時(shí)間為15 min～4 h，燕麥耐消化肽納米顆粒將消化酶對(duì)蛋白質(zhì)基納米載體的結(jié)構(gòu)破壞作用最小化。

圖6 燕麥肽-CAPE納米顆粒體外模擬消化Fig.6 Simulated digestion of oat peptide nanoparticles loading CAPE in vitro

2.8 燕麥肽-CAPE納米顆粒熒光光譜分析

蛋白質(zhì)/多肽的內(nèi)源性熒光主要來自苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸3種含有苯環(huán)的芳香族氨基酸殘基。如圖7所示，隨著猝滅劑CAPE含量的增大，燕麥肽納米顆粒的最大熒光值減小且最大吸收波長(zhǎng)紅移，這是由于氨基酸殘基微構(gòu)像發(fā)生了變化，芳香族氨基酸殘基轉(zhuǎn)向納米顆粒內(nèi)部。

圖7 激發(fā)波長(zhǎng)280 nm條件下不同濃度CAPE對(duì)燕麥肽納米顆粒熒光發(fā)射光譜的影響Fig.7 Effects of different concentrations of CAPE on fluorescence emission spectra of oat peptide nanoparticles

CAPE猝滅熒光的方式可分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅2種，具體猝滅類型可通過Stern-Volmer方程擬合分析[8]，如圖8所示。

圖8 不同溫度下CAPE與燕麥肽納米顆粒相互作用的Stern-Volmer擬合曲線Fig.8 Stern-Volmer fitting curve of interaction between CAPE and oat peptide nanoparticles at different temperatures

由表1看出，Kq高出最大值2×1010L/(mol·s)兩個(gè)數(shù)量級(jí)，據(jù)此判讀猝滅類型為靜態(tài)猝滅，燕麥肽和CAPE形成了不發(fā)熒光的復(fù)合物。使用雙對(duì)數(shù)Stern-Volmer模型分析小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，如表2所示，經(jīng)計(jì)算n值均接近1，這表明CAPE分子與肽有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。表3結(jié)果顯示，ΔS和ΔH均大于0，表明疏水作用是分子結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力，并且ΔG的值越大，相互作用越強(qiáng)[26]。

表1 不同溫度條件下CAPE與燕麥肽結(jié)合的Stern-Volmer的KSV和KqTable 1 Stern-Volmer constant KSVand biomolecular quenching constant Kqfor the interaction between CAPE and oat peptide nanoparticles at different temperatures

表2 不同溫度下CAPE與燕麥肽結(jié)合的KA和nTable 2 Binding constant KA and numbers of binding sites n for interaction between CAPE and oat peptides at different temperatures

表3 不同溫度下CAPE與燕麥肽結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of interaction between CAPE and oat peptides at different temperatures

3 結(jié)論

本研究以燕麥蛋白為研究對(duì)象，通過酶水解法改性燕麥蛋白增強(qiáng)水溶性，透射電子顯微鏡照片和動(dòng)態(tài)光散射結(jié)果表明制備的燕麥肽納米顆粒主要為尺寸50 nm的球形膠束。燕麥蛋白經(jīng)過胃蛋白酶消化水解度為3.1%，胰蛋白酶消化水解度為10.7%。進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)特征，接觸角測(cè)試結(jié)果表明燕麥肽納米顆粒表面具有一定的疏水性和親油性，具有較好的乳化特性。通過分析變性劑破壞納米顆粒后的尺寸變化，結(jié)果顯示燕麥肽自組裝形成納米顆粒的主要驅(qū)動(dòng)力為疏水相互作用。以咖啡酸苯乙酯為模型藥物評(píng)估燕麥肽納米顆粒的包封效果，包封率為71%，載藥量為3.5%，體外模擬消化表明該納米顆粒具有良好的耐消化特性。燕麥肽-CAPE納米顆粒的穩(wěn)態(tài)熒光光譜分析表明疏水相互作用是CAPE與肽分子結(jié)合主要作用力。本研究為探索肽自組裝的機(jī)制問題提供了一定理論依據(jù)，且驗(yàn)證了燕麥肽作為一種新型納米載體的潛力。