翟立公，李港回,周紫潔,黃菊,蔡秋慧,王俊穎,楊劍婷

(安徽科技學(xué)院 食品工程學(xué)院，安徽 滁州，233100)

沙門氏菌作為一種全球重要的人獸共患病食源性致病菌，以人類和動(dòng)物為宿主，引發(fā)各種疾病。最常表現(xiàn)為胃腸炎，易引起惡心、嘔吐、腹痛等癥狀，過量時(shí)能夠危及人們的生命安全，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)在世界范圍內(nèi)，全球每年有超過1億人感染沙門氏菌。而在中國有接近70%～80%細(xì)菌性食物中毒是由沙門氏菌感染所引起的[2]。德爾卑沙門氏菌(Salmonellaentericasubsp.entericaDerby,S.Derby)是沙門氏菌中對(duì)豬具有宿主適應(yīng)性的重要血清型[3]，豬肉中的沙門氏菌是導(dǎo)致沙門氏菌感染的第二大來源，經(jīng)檢測(cè)，歐洲等26個(gè)國家豬源沙門氏菌的主要血清型主要有鼠傷寒沙門菌、德爾卑沙門菌和腸炎沙門菌，而且德爾卑沙門菌的分離率也在日漸增長。近幾年，我國各地區(qū)也相繼在豬肉中檢測(cè)出德爾卑沙門氏菌[4]。沙門氏菌的爆發(fā)不僅對(duì)食品制造業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)消費(fèi)者的安全威脅也逐漸增加。

沙門氏菌在外界環(huán)境中會(huì)受到多種脅迫因子的交叉協(xié)同作用，造成其對(duì)環(huán)境耐受性的改變。在食品加工及貯存過程中，常常會(huì)使用高溫、有機(jī)酸、NaOH、消毒劑等殺菌措施。有研究表明，沙門氏菌在45 ℃下處理30 min(亞致死)后，菌體的耐受性出現(xiàn)增強(qiáng)的現(xiàn)象；當(dāng)沙門氏菌在較為干燥的環(huán)境中，它的熱適應(yīng)能力也會(huì)隨著增強(qiáng)，對(duì)紫外輻射也有著較強(qiáng)的耐受力[5]。沙門氏菌經(jīng)過亞致死的高溫脅迫后，毒力基因發(fā)生了改變，對(duì)宿主的感染率也隨之提高。在貯藏過程中，由于多種因子的交叉脅迫作用，造成了沙門氏菌對(duì)環(huán)境耐受性的變化。另外，具有酸適應(yīng)能力的沙門氏菌在受到溫度及高滲環(huán)境的脅迫后，存活率反而高于一般性的沙門氏菌，但對(duì)NaClO的應(yīng)激脅迫更為敏感[6]。為控制沙門氏菌的污染傳播，本文以檢出率較高的德爾卑沙門氏菌為對(duì)象，主要研究在高滲應(yīng)激與其他環(huán)境溫度(高溫、低溫、pH、NaClO、膽鹽等)交叉脅迫對(duì)其生存的影響，以期為食品工業(yè)針對(duì)高滲耐受沙門氏菌選擇合適滅菌及保藏技術(shù)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 培養(yǎng)基及試劑

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(tryptose soya broth,TSB)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(tryptose soya agar,TSA)，北京陸橋技術(shù)有限公司；NaCl、無水乙醇、NaOH、膽鹽、30%H2O2(分析純)、檸檬酸(分析純，≥99%)，上海麥克林生化科技有限公司；NaClO(分析純，有效氯≥5.5%)，成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2 菌株及活化保藏

德爾卑沙門氏菌(Salmonellaentericasubsp.entericaDerby)CMCC 50719標(biāo)準(zhǔn)菌株，購自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心。細(xì)菌在TSB中活化培養(yǎng)或在TSA培養(yǎng)基上斜面畫線培養(yǎng)，37 ℃下培養(yǎng)18 h，并在-80 ℃冰箱中保藏備用。

1.1.3 儀器與設(shè)備

LDZX-50 KBS型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；752型紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；DHG-9030 A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、SHP-160型智能生化培養(yǎng)箱、ZHP-100F型恒溫培養(yǎng)振蕩器、DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；DHG-9030 A型高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；BSC-1100ⅡA2-X型生物安全柜、BDF-86V50型-80超低溫冰箱，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；ME403E型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 德爾卑沙門氏菌高滲適應(yīng)性誘導(dǎo)

高滲馴化：德爾卑沙門氏菌經(jīng)TSB及固體平板活化后，挑取單菌落，接種于TSB，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)18 h。再取0.1 mL菌懸液劃線接種至含質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% NaCl的TSA中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。如此反復(fù)進(jìn)行10輪馴化。將馴化后的耐滲菌株與對(duì)照菌株分別接種至TSB中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)18 h，平板菌落計(jì)數(shù)法獲得以上菌株的初始濃度。各取1 mL培養(yǎng)液于滅菌后的1.5 mL離心管中，120 r/min離心3 min，棄上清液，分別加入1 mL飽和NaCl溶液重懸菌體。將2管菌液常溫下處理2、4、8 h，用無菌生理鹽水梯度稀釋，取適宜稀釋度平板菌落計(jì)數(shù)。存活率計(jì)算如公式(1)所示，評(píng)價(jià)德爾卑沙門氏菌高滲適應(yīng)性菌株的耐受性。

(1)

高滲適應(yīng)性抗性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)：將耐滲菌株與對(duì)照菌株分別接種于TSB中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)2 h后，加入不同濃度已過濾除菌的NaCl溶液，調(diào)節(jié)其濃度依次為0.1、0.5、1 mol/L NaCl的TSB。每間隔1 h進(jìn)行取樣，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)OD600 nm評(píng)價(jià)菌株的生長狀況，并繪制生長曲線。

1.2.2 高滲適應(yīng)德爾卑沙門氏菌環(huán)境脅迫抗性分析

將德爾卑沙門氏菌耐滲菌株與對(duì)照菌株分別經(jīng)TSB中，37 ℃培養(yǎng)18 h，取1 mL培養(yǎng)液于滅菌后的離心管中，120 r/min離心3 min，棄上清液。使用移液槍加入1 mL飽和NaCl溶液重懸菌體并在常溫下處理4 h后，120 r/min離心3 min棄上清液。

參考劉佳玫等[7]的方法進(jìn)行高滲適應(yīng)德爾卑沙門氏菌抗脅迫能力實(shí)驗(yàn)。高溫處理：用1 mL滅菌生理鹽水重懸菌體，混合均勻后制成細(xì)胞懸液，分別置于50、55、65 ℃水浴鍋中處理30 min，在60 ℃水浴鍋中處理15、30、45、60 min后，快速置于冰上短暫冷卻；低溫處理：用1 mL滅菌生理鹽水重懸菌體后，置于4 ℃冰箱冷藏；酸脅迫：用檸檬酸將無菌生理鹽水的pH調(diào)整為1.5、2.0、2.5，使用移液槍各取1 mL加入離心管中重懸菌體(處理30 min)；堿脅迫：用NaOH將無菌生理鹽水的pH調(diào)整為11、12、13，使用移液槍各取1 mL加入離心管中重懸菌體(處理15 min)；膽鹽處理：將菌體分別重懸于0.22 μm濾膜除菌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%、20%、25%膽鹽溶液中處理30 min；紫外燈照射處理：用1 mL滅菌生理鹽水重懸菌體，混合均勻后制成細(xì)胞懸液，分別置于距離紫外燈70 cm處照射5、10、15 min；NaClO溶液處理：將菌體分別重懸于無菌水與NaClO制成的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%、0.5%、1% NaClO溶液中處理30 min，用過量的Na2S2O3終止反應(yīng)；H2O2脅迫：將菌體分別重懸于用體積分?jǐn)?shù)30%的H2O2溶液與無菌水配制成的25、75、125 mmol/L H2O2溶液中處理30 min；乙醇處理：將菌體分別重懸于無菌水與無水乙醇配制成的體積分?jǐn)?shù)65%、70%的乙醇溶液中處理5 min。

以上菌體在脅迫環(huán)境下處理一定時(shí)間后，120 r/min離心3 min，棄上清液。沉淀用1 mL生理鹽水重懸，振蕩混勻后梯度稀釋，取適宜稀釋度細(xì)胞懸液涂布TSA平板計(jì)數(shù)。根據(jù)脅迫前后的菌體數(shù)計(jì)算存活率大小。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SAS(V8)軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果用Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 德爾卑沙門氏菌高滲適應(yīng)性

2.1.1 高滲馴化

德爾卑沙門氏菌在含有4% NaCl 的TSA中經(jīng)過10輪馴化后，在飽和NaCl脅迫培養(yǎng)下的存活率如圖1所示。隨著高滲處理時(shí)間的延長，德爾卑沙門氏菌的存活率逐漸降低，但耐滲菌株的存活率顯著高于對(duì)照菌株。飽和NaCl脅迫處理2 h時(shí)，耐滲菌株的存活率為105.94%，高于未處理菌落數(shù)。在脅迫處理8 h時(shí)，耐滲菌株的存活率降低至93.53%，而對(duì)照菌株的存活率僅有65.32%。此時(shí)耐滲菌株與對(duì)照菌株的存活率相差最大。以上結(jié)果表明，德爾卑沙門氏菌經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% NaCl脅迫環(huán)境馴化后，具有高滲耐受性，對(duì)于高滲環(huán)境存活率顯著提高。與劉密等[8]的研究結(jié)果一致，在4% NaCl的BMM培養(yǎng)基中循環(huán)馴化使得沙門氏菌抗高滲脅迫的能力增強(qiáng)，證明馴化成功。

圖1 德爾卑沙門氏菌耐滲菌株在飽和NaCl脅迫下的存活率Fig.1 Survival rate of osmotic tolerant strains of S.Derby under saturated NaCl stress注：“*”表示不同組間在同一處理下差異顯著(P<0.05);“** ”表示差異極顯著(P<0.01)(下同)

2.1.2 耐滲菌株的高滲適應(yīng)

高滲適應(yīng)德爾卑沙門氏菌耐滲菌株與未適應(yīng)對(duì)照菌株在含有不同濃度NaCl的TSB中生長狀況如圖2所示。前5 h屬于德爾卑沙門氏菌的快速繁殖期。在0.1 mol/L與0.5 mol/L NaCl脅迫下(圖2-a、圖2-b)，耐滲菌株與對(duì)照菌株的生長趨勢(shì)與對(duì)照實(shí)驗(yàn)菌株相同，隨時(shí)間的延長逐漸上升，在18 h左右達(dá)到穩(wěn)定期。德爾卑沙門氏菌耐滲菌株基本未受NaCl影響，細(xì)菌數(shù)量與對(duì)照組幾乎相同。對(duì)照菌株受NaCl限制，細(xì)胞數(shù)量降低了15%。而在1 mol/L NaCl脅迫下(圖2-c)，耐滲菌株與對(duì)照菌株的生長趨勢(shì)明顯受到影響。但耐滲菌株的細(xì)菌增殖速率仍高于對(duì)照菌株。在18 h時(shí)，耐滲菌株還處于不斷繁殖的狀態(tài)，接近正常水平，而對(duì)照菌株因受到NaCl脅迫，細(xì)菌數(shù)量降低了50%。由此可見，經(jīng)過馴化后的德爾卑沙門氏菌耐滲菌株能夠適應(yīng)高滲環(huán)境，不影響細(xì)菌正常繁殖水平。

a-0.1 mol/L NaCl處理;b-0.5 mol/L NaCl處理;c-1 mol/L NaCl處理圖2 德爾卑沙門氏菌耐滲菌株的高滲適應(yīng)性分析Fig.2 Analysis of hypertonic adaptability of S.Derby osmotic resistant strains

2.2 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌抗環(huán)境脅迫能力

2.2.1 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌高溫抗性

分別以50、55、60、65 ℃熱水浴處理高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏與非適應(yīng)性對(duì)照的菌懸液，結(jié)果如圖3所示。在50 ℃水浴條件下(圖3-a)，耐滲菌株與對(duì)照菌株都保持著非常高的存活率。50 ℃ 1 mol/L NaCl脅迫條件下，耐滲菌株的存活率為90.45%，高于對(duì)照菌株的82.71%。當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)(圖3-b)，耐滲菌株的存活仍然高于對(duì)照菌株。但隨著NaCl濃度從0增加到1 mol/L時(shí)，耐滲菌株的存活率從92.62%降低為63.95%，減少了28.67%。而對(duì)照菌株只減少了17.09%(從68.85%降低至51.76%)。耐滲菌株存活率的減少量相對(duì)于對(duì)照菌株增加了1.68倍，存活率顯著降低。當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)(圖3-c)，耐滲菌株的存活率開始隨著NaCl濃度的升高逐漸低于對(duì)照菌株。在0.5 mol/L NaCl脅迫下，耐滲菌株與對(duì)照菌株的存活率基本相同(56.39%、54.03%)，NaCl濃度達(dá)到1 mol/L時(shí)，耐滲菌株存活率降低為40.16%，低于對(duì)照菌株的48.04%。在65 ℃熱水浴處理下時(shí)，耐滲菌株的存活率已經(jīng)明顯低于對(duì)照菌株。在1 mol/L NaCl脅迫下，耐滲菌株的存活率與對(duì)照菌株相差3.11倍(13.41%、41.73%)，此時(shí)差距最大。在溫度從50 ℃上升到65 ℃過程中，耐滲菌株在同一濃度NaCl脅迫下(0、0.1、0.5、1 mol/L)存活率分別降低了60.52%、58.14%、78.28%、77.04%，其中，當(dāng)溫度從55 ℃升高到60 ℃時(shí)，耐滲菌株的存活率減少量最為明顯(23.24%、22.61%、19.57%、21.71%)且逐漸低于對(duì)照菌株。因此，針對(duì)60 ℃高溫脅迫下高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌的耐受性做進(jìn)一步分析。

a-50 ℃;b-55 ℃;c-60 ℃;d-65 ℃圖3 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌在高溫條件下的存活率Fig.3 Survival rate of hypertonic adapted S.Derby under high temperature

2.2.2 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌在60 ℃條件下的存活率

根據(jù)2.2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇在60 ℃溫度下水浴加熱處理15、30、45、60 min進(jìn)一步探究耐滲菌株的高溫耐受性。如圖6所示，在60 ℃、15 min時(shí)(圖4-a)，耐滲菌株的存活率仍高于對(duì)照菌株。在此條件下，耐滲菌株的存活率隨NaCl濃度的增加降低了11.52%(從76.42%降低至64.90%)。在30 min時(shí)(圖4-b)，耐滲菌株存活率逐漸低于對(duì)照菌株。

a-15 min;b-30 min;c-45 min;d-60 min圖4 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌在60 ℃條件下不同處理時(shí)間的存活率Fig.4 Survival rate of hypertonic adapted S.Derby at 60 ℃ for different treatment times

當(dāng)水浴時(shí)間延長至45 min以上時(shí)(圖4-c、圖4-d)，耐滲菌株在高滲/高溫交叉脅迫下存活率明顯低于對(duì)照菌株。在60 ℃、60 min、1 mol/L NaCl脅迫下耐滲菌株存活率僅為36.48%，顯著低于對(duì)照菌株的45.22%。這與翟立公等[9]的研究結(jié)果存在差異。這可能與細(xì)胞膜的感知溫度系統(tǒng)及細(xì)胞膜的作用有關(guān)。在4組實(shí)驗(yàn)中未經(jīng)NaCl脅迫時(shí)耐滲菌株的存活率(76.42%、69.38%、68.02%、61.79%)都高于對(duì)照株(73.05%、54.77%、51.31%、50.9%)。高滲適應(yīng)性誘導(dǎo)的細(xì)胞高溫抗性與rpoS基因表達(dá)量有關(guān)[10]。RpoS轉(zhuǎn)錄因子能夠通過溫度的改變控制核糖體結(jié)合部位的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)RopS不僅是大多數(shù)致病菌穩(wěn)定壓力的因子也是調(diào)控外膜蛋白表達(dá)量的重要影響因子[11]。暗示其可能參與高滲適應(yīng)性誘導(dǎo)的沙門氏菌高溫交叉抗性。

2.2.3 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌在4 ℃低溫條件的存活率

低溫保鮮是延長及儲(chǔ)存食品常用的保藏技術(shù)，耐滲菌株與對(duì)照菌株在4 ℃低溫冷藏條件下存活狀況良好(圖5)，2種菌株均呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢(shì)。高滲適應(yīng)德爾卑沙門氏菌在7～19 d的存活率明顯高于對(duì)照菌株。在19 d內(nèi)，耐滲菌株的存活率下降了17.25%，對(duì)照菌株降低了27.15%，但2種菌株的存活率整體均在70%以上，說明高滲適應(yīng)性使德爾卑沙門氏菌對(duì)4 ℃低溫環(huán)境產(chǎn)生抗性。低溫儲(chǔ)藏可作為某些食品保鮮的方法。包文智等[20]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境脅迫誘導(dǎo)不改變細(xì)菌在低溫條件下的存活情況，這些細(xì)菌對(duì)低溫條件的不同反應(yīng)，可能與微生物種類和環(huán)境脅迫處理?xiàng)l件不同有關(guān)，食品加工過程中沙門氏菌常處于多種脅迫因子的共同作用，同時(shí)也代表了沙門氏菌中廣泛存在著與低溫條件的交叉抗性[12]。

圖5 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌在低溫條件下的存活率Fig.5 Survival rate of hypersonic adapted S.Derby under low temperature

2.2.4 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌酸脅迫抗性

如圖6所示，2種菌株在檸檬酸脅迫下存活率都比較低且存活率差異顯著。在pH 2.5脅迫條件下，耐滲菌株的存活率最高，但僅有49.75%。當(dāng)處于pH 2環(huán)境下時(shí)，耐滲菌株與對(duì)照菌株的存活率相差35.76%(46.87%、11.11%)，差異最大。在pH 1.5極酸性環(huán)境下時(shí)，對(duì)照菌株無法適應(yīng)酸性環(huán)境，存活率為0，但此時(shí)耐滲菌株仍有5.46%的存活率。以上結(jié)果表明，高滲適應(yīng)性誘導(dǎo)的德爾卑沙門氏菌對(duì)酸性環(huán)境產(chǎn)生交叉抗性。在食品加工階段有機(jī)酸常常被用作殺菌劑，對(duì)蔬果、肉品表面微生物具有良好的殺菌效果[13]。而高滲適應(yīng)性的德爾卑沙門氏菌能夠抵抗酸性環(huán)境，無法被徹底消滅，因此在使用有機(jī)酸對(duì)腌制類食品殺菌時(shí)，應(yīng)充分考慮到高滲誘導(dǎo)的細(xì)胞酸脅迫抗性，建立高效、徹底的殺菌條件，保證高滲適應(yīng)性菌完全滅活。

圖6 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌在酸脅迫下的存活率Fig.6 Survival rate of hypertonic adapted S.Derby under acid stress

2.2.5 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌堿脅迫抗性

如圖7所示，當(dāng)?shù)聽柋吧抽T氏菌在低堿性環(huán)境時(shí)，耐滲菌株與對(duì)照菌株的存活率均較高。在pH 11脅迫條件下，耐滲菌株的存活率(94.63%)僅高于對(duì)照菌株(89.97%)的4.66%，在pH 12脅迫條件下耐滲菌株(93.51%)與對(duì)照菌株(83.95%)只相差9.56%，差異都不明顯。但當(dāng)pH增大到13，在強(qiáng)堿環(huán)境時(shí)，耐滲菌株與對(duì)照菌株存活率急劇降低。耐滲菌株存活率降低為55.33%仍高于對(duì)照菌株的21.86%。以上結(jié)果表明，德爾卑沙門氏菌高滲適應(yīng)性使其對(duì)堿脅迫抗性增強(qiáng)。因此，在對(duì)腌制類等高鹽類食品進(jìn)行殺菌時(shí)，無法使用有機(jī)酸以及強(qiáng)堿起到滅菌效果。

圖7 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌在NaOH脅迫下的存活率Fig.7 Survival rate of hypertonic adapted S.Derby under NaOH stress

翟立公等[9]研究發(fā)現(xiàn)，高溫耐受性德爾卑沙門氏菌對(duì)于強(qiáng)堿的敏感性提升。而高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌對(duì)于高溫抗性降低，因此，建立多種脅迫共同作用下的滅菌方式是一種新穎的選擇。

2.2.6 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌膽鹽抗性

膽鹽是肝臟分泌的膽汁的重要成分，主要參與脂類食物在小腸的分解和吸收[14]，因此在細(xì)菌通過胃部酸性屏障后，其依賴于膽鹽抗性的腸道定殖、存活能力也是研究的一大熱點(diǎn)。據(jù)報(bào)道沙門氏菌具有膽汁鹽環(huán)境脅迫適應(yīng)性[15]，本實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%、20%、25%的膽鹽溶液模擬沙門氏菌可能面臨的宿主膽鹽環(huán)境，結(jié)果如圖8所示，不同濃度的膽鹽對(duì)于德爾卑沙門氏存活率影響較大。在15%膽鹽脅迫下，耐滲菌株的存活率為83.77%，高于對(duì)照菌株的73.63%，此時(shí)2種菌株的存活率均在70%以上，處于較高水平。當(dāng)膽鹽濃度增大到20%時(shí)，耐滲菌株的存活率(43.90%)降低了39.87%，對(duì)照菌株存活率(31.37%)降低了42.26%。而在25%膽鹽溶液中，耐滲菌株的存活率僅有19.65%，但高于對(duì)照菌株的15.90%。高滲適應(yīng)性明顯增強(qiáng)了菌株對(duì)膽鹽的耐受性，也意味著高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌一旦被誤食進(jìn)入人體腸道后，其致病率也顯著提高了。

圖8 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌在膽鹽環(huán)境下的存活率Fig.8 Survival rate of hypertonic adapted S.Derby in bile salt environment

2.2.7 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌在紫外燈照射條件下的存活率

紫外燈通過利用汞燈發(fā)出的紫外線，來實(shí)現(xiàn)殺菌消毒功能[16]。在生化實(shí)驗(yàn)室中，經(jīng)常要對(duì)生物安全柜等儀器進(jìn)行紫外光照射殺菌消毒，以防止雜菌污染。圖9為德爾卑沙門氏菌耐滲菌株與對(duì)照菌株在距紫外燈70 cm處照射下的存活率?？梢钥闯?，耐滲菌株的存活率明顯高于對(duì)照菌株。在照射5 min時(shí)，耐滲菌株與對(duì)照菌株的存活率均較高(64.95%、54.73%)。照射15 min時(shí)，耐滲菌株的存活率降低為46.32%。15 min照射下，耐滲菌株存活率只降低了18.63%。由此可見，在使用生物安全柜等儀器進(jìn)行高滲適應(yīng)性沙門氏菌生化實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)使用紫外燈長時(shí)間殺菌，同時(shí)配合多種消毒劑以達(dá)到徹底殺菌的目的。

圖9 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌在紫外燈照射環(huán)境下的存活率Fig.9 Survival rate of hypertonic adapted S.Derby under ultraviolet irradiation

2.2.8 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌對(duì)氧化類消毒劑抗性

高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌在食品及加工器械消毒劑NaClO、H2O2溶液中的存活率如圖10所示。

a-NaClO溶液處理;b-H2O2溶液處理圖10 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌在氧化類消毒劑脅迫下的存活率Fig.10 Survival rate of hypertonic adapted S.Derby under oxidative disinfectant stress

由圖10可知，2種消毒劑對(duì)德爾卑沙門氏菌的殺菌效果完全不同。明顯能夠看出德爾卑沙門氏菌對(duì)于NaClO的更為敏感。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3% NaClO溶液中(圖10-a)耐滲菌株的存活率為66.64%，高于對(duì)照菌株的54.55%，兩者存活率相差不大。當(dāng)NaClO溶液濃度增大為0.5%時(shí)，耐滲菌株的存活率只降低為51.61%，但此時(shí)對(duì)照菌株已經(jīng)被完全滅菌，在1%NaClO溶液中，耐滲菌株的存活率為49.11%，仍處于較高水平。然而與NaClO不同，在125 mmol/L高濃度H2O2溶液中，耐滲菌株的存活率雖然高達(dá)58.03%，卻低于對(duì)照菌株的69.50%。

H2O2和NaClO都是氧化類消毒劑，但高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌對(duì)二者的反應(yīng)不同，一方面與處理時(shí)間不同有關(guān)，也反映出它們與細(xì)胞的作用方式不同。H2O2產(chǎn)生活性氧作用于細(xì)胞DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)[17]，而NaClO強(qiáng)烈的殺菌效果與其破壞細(xì)胞膜滲透性、能量代謝等有關(guān)[18]。

2.2.9 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌對(duì)乙醇溶液敏感性

如圖11所示，與NaClO與H2O2作用不同，德爾卑沙門氏菌在乙醇溶液環(huán)境中，存活率都處于低水平狀態(tài)，但耐滲菌株對(duì)于乙醇的抗性明顯強(qiáng)于對(duì)照菌株。當(dāng)暴露于65%乙醇溶液時(shí)，耐滲菌株的存活率為44.33%高于對(duì)照菌株的39.94%。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大5%時(shí)，耐滲菌株的存活率降低了2.85%(41.48%)。雖然在65%～70 %乙醇溶液中，耐滲菌株的存活率較低但仍未達(dá)到殺菌要求。CHIANG等[19]報(bào)道的酸適應(yīng)性副溶血弧菌在8%乙醇溶液中的存活率顯著提高，與本研究中高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌對(duì)乙醇抗性增強(qiáng)結(jié)果一致。這說明乙醇、NaClO無法作為高滲適應(yīng)沙門氏菌的有效消毒劑。高濃度H2O2或許能夠起到殺菌效果，但H2O2屬于易燃易爆物，不適用于廣泛的消毒手段。綜上所述，高溫與高鹽協(xié)同消除食品及加工環(huán)境沙門氏菌污染及傳播是最為有效的方式。

圖11 高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌在乙醇條件下的存活率Fig.11 Survival rate of hypertonic adapted S.Derby under ethanol conditions

3 討論

關(guān)于腸炎和鼠傷寒沙門氏菌在環(huán)境脅迫下的抗性研究已有很多，如海德爾堡沙門氏菌能夠在酸性環(huán)境中產(chǎn)生適應(yīng)性、鴨沙門氏菌的多重耐藥性等[7，26]。本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)德爾卑沙門氏菌在高滲環(huán)境下的適應(yīng)性以及脅迫環(huán)境下的耐受性。研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過高滲馴化后，耐滲菌株只在膽鹽、高溫以及低pH脅迫環(huán)境下生存能力顯著降低。而乙醇、強(qiáng)堿、NaClO、紫外光照射等都是對(duì)沙門氏菌有效的殺菌方式，但在本實(shí)驗(yàn)中，高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌對(duì)以上脅迫環(huán)境的抗性明顯增強(qiáng)。在以上環(huán)境脅迫時(shí)耐滲菌株的存活率是膽鹽環(huán)境下的2～3倍、高溫的4～5倍、極酸環(huán)境下的9～12倍。產(chǎn)生這種差異性的原因或許與沙門氏菌體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。據(jù)報(bào)道RpoS轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是沙門氏菌體內(nèi)穩(wěn)定壓力的因子，能夠調(diào)控特異性基因的表達(dá)，在細(xì)菌中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[20]。在高溫、高滲、膽鹽及酸適應(yīng)性，rpoS基因表達(dá)量均上調(diào)[14-15]。暗示其可能同時(shí)參與高滲適應(yīng)性誘導(dǎo)的沙門氏菌高溫、膽鹽或低pH環(huán)境的交叉抗性。

細(xì)胞滲透壓抗性與甜菜堿、脯氨酸、海藻糖等滲透壓保護(hù)劑以及與滲透壓相關(guān)的外膜蛋白誘導(dǎo)表達(dá)量和種類有關(guān)[19,21]。大多數(shù)食源性致病菌是通過氨基酸脫羧酶系統(tǒng)來維持體內(nèi)pH的穩(wěn)定，涉及的氨基酸主要為賴氨酸、精氨酸、谷氨酸[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌的細(xì)胞壁中谷氨酰胺和賴氨酸能夠有效提高對(duì)膽鹽的抗性[23]。細(xì)菌感知溫度的方式一是通過信號(hào)運(yùn)輸交換系統(tǒng)，二是通過RNA介導(dǎo)的反饋通道改變調(diào)節(jié)區(qū)域的結(jié)構(gòu)[24]。沙門氏菌在適應(yīng)以上4種環(huán)境脅迫的誘導(dǎo)基本都與基因調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)量有關(guān)。RpoS蛋白是RNA聚合酶的一種σ因子，而RNA聚合酶是DNA逆轉(zhuǎn)錄合成RNA翻譯蛋白質(zhì)的重要產(chǎn)物[25]。因此，RpoS很有可能是細(xì)菌在受到環(huán)境脅迫時(shí)起到主要調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。關(guān)于RpoS的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，這對(duì)于控制細(xì)菌耐受性的產(chǎn)生，以及徹底消滅具有環(huán)境抗性的食源性致病菌起到至關(guān)重要的作用，對(duì)于生物學(xué)研究也具有重要的意義。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)德爾卑沙門氏菌單一菌種進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)德爾卑沙門氏菌在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% NaCl環(huán)境條件下馴化誘導(dǎo)后會(huì)產(chǎn)生高滲適應(yīng)性，不僅能夠使其在高濃度NaCl下正常存活，還具有良好的遺傳穩(wěn)定性。同時(shí)，能夠誘導(dǎo)低溫、NaOH、乙醇、雙氧水、NaClO、紫外燈照射脅迫環(huán)境的交叉抗性。當(dāng)高鹽與這些措施協(xié)同殺菌時(shí)，會(huì)顯著降低殺菌效果，產(chǎn)生的交叉保護(hù)也是食品安全一大隱患。但是高滲適應(yīng)性也使得德爾卑沙門氏菌對(duì)某些壓力環(huán)境的敏感性增強(qiáng)，如在高溫、膽鹽、極酸環(huán)境下，高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌的存活率明顯受到抑制，顯著降低。研究結(jié)果表明以上措施可以與食用鹽聯(lián)合作用，采用較溫和的手段提高食品殺菌效果，保證可能產(chǎn)生的高滲適應(yīng)性菌快速滅活。由于高滲適應(yīng)性德爾卑沙門氏菌對(duì)于多種消毒滅菌手段的抗性都顯著提升，食品加工業(yè)還應(yīng)加大開發(fā)新的有效殺菌措施，并通過對(duì)沙門氏菌對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)機(jī)制研究，建立有效的食品安全系統(tǒng)，阻止疾病的傳播。