張瑛梅，王飛，任小兵，王玥蓮，陳俊，胡瑩，胡曉勤，徐文革*

我國是結(jié)核病和糖尿病高負(fù)擔(dān)國家［1］，耐藥結(jié)核?。╠rug resistant tuberculosis，DR-TB）是當(dāng)前全球健康的一個嚴(yán)重威脅，其發(fā)病率、病死率高，治療復(fù)雜，花費(fèi)巨大［2］，是人類戰(zhàn)勝結(jié)核病的重大阻礙。臨床上糖尿病合并肺結(jié)核很常見。近年來，國內(nèi)外在糖尿病對肺結(jié)核耐藥率、療效差異、復(fù)發(fā)率等方面有一些臨床研究，但結(jié)論并不統(tǒng)一［3-4］。有研究發(fā)現(xiàn)合并糖尿病的肺結(jié)核（DM-PTB）比單純肺結(jié)核（PTB）有更高的異煙肼耐藥率，但利福平耐藥無差異［5］，也有研究表明DM-PTB的耐藥率與PTB無差異［6］。國外有研究發(fā)現(xiàn)DM-PTB患者異煙肼、利福平和吡嗪酰胺的耐藥率較高，相較于PTB更有可能出現(xiàn)耐多藥結(jié)核?。?］。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，既往研究多以回顧性研究為主，糖尿病對肺結(jié)核菌株表型耐藥、基因突變影響的前瞻性對比研究尚少。為進(jìn)一步探究糖尿病對肺結(jié)核耐藥的影響，本研究前瞻性地對DM-PTB及PTB患者進(jìn)行表型耐藥、基因突變檢測，旨在為后續(xù)研究提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018—2020年在簡陽市人民醫(yī)院就診的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性的肺結(jié)核患者357例，根據(jù)是否合并糖尿病，將其分為PTB組216例和DMPTB組141例。本研究通過簡陽市人民醫(yī)院倫理委員會倫理審核〔編號：（2018）19〕，已在中國臨床試驗(yàn)注冊中心注冊，注冊號：ChiCTR2000039148。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《肺結(jié)核診斷：WS 288—2017》中的涂片陽性肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］；符合《中國慢性疾病防治基層醫(yī)生診療手冊（糖尿病分冊）2015年版》中的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］：有糖尿病典型癥狀，空腹靜脈血糖＞7.0 mmol/L，隨機(jī)或空腹葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）2 h靜脈血糖＞11.1 mmol/L；若無癥狀，需非同日2次檢測明確。排除標(biāo)準(zhǔn)：菌種鑒定為非結(jié)核分枝桿菌。

1.3 材料與方法 試劑及設(shè)備：結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定采用美國BD公司BACTEC MGIT960 System全自動分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)。采用異煙肼、乙胺丁醇、利福平、鏈霉素藥敏試劑盒（熒光法）進(jìn)行表型藥物敏感試驗(yàn)（簡稱：藥敏試驗(yàn)）。分子檢測試劑：結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變檢測試劑盒（PCR-反向點(diǎn)雜交法），由亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司提供；伯樂基因擴(kuò)增儀（儀器型號S1000）。

1.4 試驗(yàn)方法 從門診、住院的患者中篩查痰抗酸染色陽性患者，記錄患者年齡、性別、是否合并糖尿病，取晨痰送結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)進(jìn)行菌株鑒定。培養(yǎng)為陽性且鑒定為結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)本繼續(xù)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。PTB組隨機(jī)抽樣選擇62例、DM-PTB組隨機(jī)選擇61例進(jìn)行耐藥基因位點(diǎn)突變檢測，檢測位點(diǎn)包括異煙肼inhA基因-15位堿基、KatG基因315位氨基酸；利福平rpoB基因RRDR區(qū)、rpoB基因516位氨基酸、rpoB基因526位氨基酸、rpoB基因531位氨基酸；乙胺丁醇embB基因306位氨基酸；鏈霉素rpsL基因43位氨基酸、rpsL基因88位氨基酸。

1.5 耐藥定義 根據(jù)《耐藥結(jié)核病化學(xué)治療指南（2019年簡版）》［10］定義，單耐藥結(jié)核?。航Y(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌經(jīng)體外藥敏試驗(yàn)被證實(shí)對一種一線抗結(jié)核藥物耐藥。多耐藥結(jié)核病：結(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌經(jīng)體外藥敏試驗(yàn)被證實(shí)對一種以上一線抗結(jié)核藥物耐藥（但不包括同時(shí)對異煙肼、利福平耐藥）。耐多藥結(jié)核病（MDR-TB）：結(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌經(jīng)體外藥敏試驗(yàn)被證實(shí)至少同時(shí)對異煙肼和利福平耐藥。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，偏態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher's確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 患者入組流程見圖1。PTB組男162例，女54例；中位年齡52（34，65）歲。DM-PTB組男124例，女17例；中位年齡53（39，61）歲。兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.78，P=0.07）。兩組性別比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.97，P=0.003）。

圖1 患者入組流程圖Figure 1 Flowchart of participants enrollment

2.2 抗結(jié)核藥耐藥及基因位點(diǎn)突變情況

2.2.1 一線藥物耐藥結(jié)果 兩組利福平、乙胺丁醇、鏈霉素耐藥率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；DM-PTB組異煙肼耐藥率高于PTB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 PTB組和DM-PTB組患者一線抗結(jié)核藥物耐藥率比較〔n（%）〕Table 1 First-line drug-resistant profile between pulmonary tuberculosis patients with and without diabetes

2.2.2 不同類型耐藥結(jié)果 兩組患者異煙肼、利福平、鏈霉素單耐藥率以及多耐藥率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；DM-PTB組耐多藥率高于PTB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 PTB組和DM-PTB組患者不同類型耐藥情況比較〔n（%）〕Table 2 Different types of drug resistance between pulmonary tuberculosis patients with and without diabetes

2.2.3 檢測基因位點(diǎn)突變結(jié)果 兩組患者檢測基因位點(diǎn)突變率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 PTB組和DM-PTB組患者檢測基因位點(diǎn)突變率比較〔n（%）〕Table 3 Rate of mutation at the gene loci between pulmonary tuberculosis patients with and without diabetes

2.2.4 一線抗結(jié)核藥耐藥基因位點(diǎn)突變分布 PTB組異煙肼耐藥位點(diǎn)均為KatG基因315位氨基酸S315T/N位點(diǎn)突變5例（5/5）；利福平耐藥位點(diǎn)為rpoB基因RRDR區(qū)6例（6/15），rpoB基因526位氨基酸H526D位點(diǎn)突變4例（4/15），rpoB基因531位氨基酸S531L位點(diǎn)突變5例（5/15）；鏈霉素耐藥位點(diǎn)rpsL基因43位氨基酸K43R位點(diǎn)突變2例（2/3），rpsL基因88位氨基酸K88R位點(diǎn)突變1例（1/3）。

DM-PTB組異煙肼耐藥位點(diǎn)均為KatG基因315位氨基酸S315T/N位點(diǎn)突變7例（7/7）；利福平耐藥位點(diǎn)為rpB基因RRDR區(qū)3例（3/5），rpoB基因531位氨基酸S531L位點(diǎn)突變2例（2/5）；乙胺丁醇耐藥位點(diǎn)為embB基因306位氨基酸M306L/V位點(diǎn)突變1例（1/1）。

3 討論

世界衛(wèi)生組織指出，糖尿病是結(jié)核病發(fā)生的重要風(fēng)險(xiǎn)因素［1］。免疫和激素的變化、不同細(xì)胞因子的產(chǎn)生、微生物群的改變、內(nèi)皮功能障礙和維生素D缺乏是導(dǎo)致2型糖尿病和肺結(jié)核共病的主要因素［11］。合并糖尿病同樣也會增加耐藥風(fēng)險(xiǎn)，國內(nèi)一項(xiàng)納入13項(xiàng)研究、33 747例患者的Meta分析結(jié)果顯示，在新診斷的結(jié)核病患者中，糖尿病與異煙肼耐藥性顯著相關(guān)〔RR=1.22，95%CI（1.04，1.43）〕［12］。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病程≥5年是發(fā)生耐多藥的危險(xiǎn)因素（OR=19.469，P=0.015）［13］。糖尿病和結(jié)核病重疊可能會對全球結(jié)核病防控工作產(chǎn)生不利影響［14］，國外研究也證實(shí)合并糖尿病的新發(fā)結(jié)核病患者耐藥風(fēng)險(xiǎn)增加［15］。糖化血紅蛋白（HbA1c）＜7%的DM-PTB患者發(fā)生利福平耐藥、異煙肼耐藥和耐多藥風(fēng)險(xiǎn)更低［16］。本研究通過對PTB組患者及DM-PTB組患者進(jìn)行前瞻性的基因突變、表型耐藥檢測，證實(shí)糖尿病會提高肺結(jié)核的異煙肼耐藥率及耐多藥率，但是對利福平、乙胺丁醇、鏈霉素的耐藥率無差異。

結(jié)核分枝桿菌耐藥的主要原因是基因突變［15］，已有研究證實(shí)結(jié)核分枝桿菌耐利福平rboB基因位點(diǎn)突變主要與531位點(diǎn)、526位點(diǎn)高度相關(guān)，耐異煙肼katG315位點(diǎn)、inhA基因-15位點(diǎn)突變與異煙肼耐藥高度相關(guān)，提示利福平和異煙肼敏感性的基因型與這些藥物的表型耐藥性高度相關(guān)［17］。katG、rpoB、rpsL基因突變檢測能有效預(yù)測異煙肼、利福平、鏈霉素耐藥［18］。本研究選擇inhA基因-15位堿基、KatG基因315位氨基酸、rpoB基因RRDR區(qū)、rpoB基因516位氨基酸、rpoB基因526位氨基酸、rpoB基因531位氨基酸、embB基因306位氨基酸、rpsL基因43位氨基酸、rpsL基因88位氨基酸能有效預(yù)測異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素一線藥物的耐藥。通過研究發(fā)現(xiàn)，異煙肼突變率第1位的基因位點(diǎn)為：katG315，與前期研究結(jié)果一致［19］。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)無論是PTB還是DM-PTB患者，均以KatG基因315位氨基酸為主，突變類型為S315T/N。利福平耐藥位點(diǎn)突變分布有一定差別，DM-PTB患者利福平耐藥位點(diǎn)主要為rpoB基因RRDR區(qū)、rpoB基因531位氨基酸，耐藥位點(diǎn)與徐小溪等［20］研究相似。本研究PTB患者耐藥位點(diǎn)除上述位點(diǎn)外，還發(fā)現(xiàn)有rpoB基因526位氨基酸突變，提示利福平耐藥位點(diǎn)突變可能存在多態(tài)性。乙胺丁醇耐藥相關(guān)基因突變以embB基因306位氨基酸突變?yōu)橹?，突變類型為M306L/V。鏈霉素耐藥相關(guān)基因突變主要以rpsL基因43位氨基酸K43R位點(diǎn)突變?yōu)橹?。本研究結(jié)果提示PTB患者及DM-PTB患者之間各一線抗結(jié)核藥物相關(guān)耐藥基因位點(diǎn)突變分布及突變率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與國內(nèi)其他研究有一定區(qū)別［5］。

本研究進(jìn)行了以藥敏試驗(yàn)作為結(jié)果的表型耐藥研究及以基因位點(diǎn)突變結(jié)果的耐藥位點(diǎn)研究，發(fā)現(xiàn)簡陽地區(qū)的耐藥率與其他地方的檢測結(jié)果有一定差異［21］。這與地域差異及醫(yī)療分布有關(guān)，簡陽市人民醫(yī)院作為縣級市三甲醫(yī)院，主要收治來自基層初篩懷疑結(jié)核的患者，患者主要以初治結(jié)核為主。另外，從培養(yǎng)和基因檢測結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，基因位點(diǎn)突變與表型耐藥之間并不完全對等，本研究檢測的位點(diǎn)突變率低于藥敏試驗(yàn)結(jié)果，這可能與基因檢測樣本相對偏少有關(guān)，也可能提示表型耐藥的患者不一定伴隨相應(yīng)藥物耐藥位點(diǎn)的突變。臨床的最終治療應(yīng)以藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)，同時(shí)需密切觀察患者抗結(jié)核治療后的應(yīng)答情況。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，DM-PTB患者中男性所占比例較高，與吳桂輝等［22］、李雪等［23］研究相似，提示應(yīng)該重視男性糖尿病群體中肺結(jié)核的排查以及男性肺結(jié)核患者中糖尿病的篩查。

綜上所述，本研究證實(shí)糖尿病會加重肺結(jié)核患者異煙肼耐藥及耐多藥情況的出現(xiàn)，從而加重耐藥結(jié)核負(fù)擔(dān)。臨床工作中應(yīng)該加強(qiáng)對DM-PTB患者的耐藥篩查，尤其是抗結(jié)核治療效果欠佳的患者，同時(shí)要強(qiáng)化血糖的控制。

本研究也存在一些不足之處：入組患者多為初治患者，但也有個別是再發(fā)、復(fù)治患者，未進(jìn)行區(qū)分，結(jié)果可能會有一定偏倚，可以在以后更大樣本量的研究中優(yōu)化。另外，本研究嘗試通過基因位點(diǎn)突變間的差異探索對于糖尿病影響異煙肼耐藥的具體機(jī)制，但未發(fā)現(xiàn)兩組患者基因位點(diǎn)間存在差異，考慮可能與基因位點(diǎn)監(jiān)測樣本偏少，得出的耐藥數(shù)量、耐藥率相對偏低有一定關(guān)系。以上不足與未探明的機(jī)制也將是下一步研究的重點(diǎn)。

作者貢獻(xiàn)：張瑛梅提出研究思路、設(shè)計(jì)研究方案、負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、繪制圖表、論文起草以及最終版本修訂，對論文負(fù)責(zé)；王飛設(shè)計(jì)研究方案、進(jìn)行論文的修訂；任小兵負(fù)責(zé)文章修改；王玥蓮負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集；陳俊、胡瑩、胡曉勤負(fù)責(zé)樣本的采集；徐文革負(fù)責(zé)最終版本修訂，對論文負(fù)責(zé)。

本文無利益沖突。