姜國(guó)偉 常 慶 孟擁軍 梁冬雨 易清清

(1 上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上海，201800； 2 上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海，201800)

白花丹參(SalviaMiltiorrhizaBge)為唇形科鼠尾草本屬植物，藥用其根。白花丹參有效成分為脂溶性和水溶性兩部分，后者主要為酚酸類，包括丹參素，原兒茶醛，丹參酸甲、乙、丙[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明丹參具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化、減少心肌耗氧量、抗肝纖維化、抗消化性潰瘍、抗菌消炎及抗腫瘤等作用[2]。白花丹參對(duì)心血管的作用為降低心肌耗氧量、縮小梗死面積、抗動(dòng)脈粥樣硬化，這些都和丹參對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)有關(guān)[3-6]。同時(shí)白花丹參可通過減弱缺氧時(shí)血管平滑肌細(xì)胞的收縮起保護(hù)作用[7]。因此，白花丹參的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞生長(zhǎng)的作用引起了人們的注意[8]。故本研究探討其水提物對(duì)損傷后大鼠血管內(nèi)皮修復(fù)的促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 Wistar雄性大鼠，購(gòu)自南京君科生物工程有限公司(許可證號(hào)：J002)，共60只，體質(zhì)量250～280 g。動(dòng)物飼養(yǎng)于上海嘉定先進(jìn)技術(shù)創(chuàng)新與育成中心的無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度為25 ℃，濕度為65%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：2020-GZR-16-33028219803169204)。

1.1.2 藥物 白花丹參由山東萊蕪苗山中藥產(chǎn)業(yè)化科技示范基地提供。采收時(shí)間為2018年10月。

1.1.3 試劑與儀器 鹽酸腎上腺素(批號(hào)：329-63-5)購(gòu)于天津金耀氨基酸有限公司，大鼠血管性血友病因子(von WillebrandFactor，vWF)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：PV977)、大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：PV960)、大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白(Monocyte Chemoattractant Protein，MCP-1)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：PC128)和大鼠白細(xì)胞介素-10(Interleukin，IL-10)試劑盒(批號(hào)：PI525)均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。eppendorf離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó)，型號(hào):eppendorf 5424/5424R)，Leica切片機(jī)(Leica Biosystems，德國(guó)，型號(hào)：RM2235)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 分組：60只大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，禁食12 h，自由飲水。隨機(jī)選出15只作為空白對(duì)照組，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。余45只均制作血管內(nèi)皮損傷模型。將模型大鼠分成3組，每組15只，其中1組灌胃生理鹽水作為模型組，另2組分別灌胃不同濃度白花丹參水提物作為低劑量給藥組和高劑量給藥組。

白花丹參水提物制備：將白花丹參根洗凈自然曬干，切片后取適量置于煎煮容器內(nèi)，入相當(dāng)于藥材量5倍的冷蒸餾水浸泡2 h，強(qiáng)火煮沸后，再以文火煎煮30 min，過濾；藥渣加4倍量蒸餾水繼續(xù)煎煮，煮沸后改文火再煎煮20 min，過濾。合并2次濾液，經(jīng)濾紙過濾后噴霧干燥，得到白花丹參水提取物，4 ℃冰箱儲(chǔ)存。臨用時(shí)以蒸餾水配成1 g/mL和2 g/mL濃度[9]。

鹽酸腎上腺素溶液配制：用生理鹽水將1 mg/mL的鹽酸腎上腺素稀釋1.5倍，配成0.67 mg/mL溶液[10]。

血管內(nèi)皮損傷模型制備：用上述0.67 mg/mL的鹽酸腎上腺素，每天的8：00、12：00、16：00于大鼠腹部相同的部位皮下注射33.3 μg(0.05 mL)/100 g，連續(xù)注射5 d[10]。5 d后，將大鼠處死，開胸，分離大鼠胸主動(dòng)脈，放入4%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色，顯微鏡下觀察胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷情況，進(jìn)而判斷是否造模成功。

1.2.2 給藥方法 30只模型給藥組在模型建立的第1天開始給藥，低劑量給藥組每只大鼠每天給1 g/mL丹參水提物1.5 mL，高劑量給藥組每只大鼠每天給2 g/mL丹參水提物1.5 mL，連續(xù)灌胃給藥17 d，其他對(duì)照組大鼠每天給予等量的水。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 在模型建立后的第1、8、17天分別于各組中隨機(jī)選擇5只大鼠進(jìn)行尾靜脈取血約1 mL，血樣于室溫放置2 h后以4 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心10 min，取上清液備用。

vWF、VEGF、MCP-1和IL-10檢測(cè)：分別按vWF、VEGF、MCP-1和IL-10檢測(cè)試劑盒說明書步驟進(jìn)行4種因子的檢測(cè)。

各組大鼠胸主動(dòng)脈血管HE染色：各組大鼠處死后，取胸主動(dòng)脈，進(jìn)行固定、包埋、切片和HE染色。于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮形態(tài)學(xué)的病理改變。HE染色方法：1)切片脫蠟，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min。2)100%(Ⅰ、Ⅱ)、90%、80%、70%乙醇各5 min，自來水沖洗5 min×3次。3)蘇木精染色5 min，流水沖洗。4)5%鹽酸乙醇分化1 min，流水沖洗。5)溫水反藍(lán)。6)伊紅染色1 min，流水沖洗。7)70%、80%、90%、100%乙醇各10 s，二甲苯1 min，在通風(fēng)櫥自然晾干。8)滴上中性樹膠，封片。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮形態(tài)學(xué)的病理改變 正常對(duì)照組見圖1A，胸主動(dòng)脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)連續(xù)，完整光滑，內(nèi)膜無剝脫缺失。血管內(nèi)膜形態(tài)基本正常，結(jié)構(gòu)完整。模型對(duì)照組血管HE染色見圖1B，在顯微鏡下觀察，能夠看到模型組胸主動(dòng)脈內(nèi)皮不光滑，內(nèi)皮細(xì)胞局部剝脫缺失，內(nèi)皮表面炎癥細(xì)胞附著，中層平滑肌排列疏松紊亂，斷裂增厚，提示造模成功。白花丹參水提物低、高劑量組分別見圖1C，圖1D，鏡下見胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮輕度不光滑，內(nèi)皮表面有少量炎癥細(xì)胞附著，中層平滑肌排列輕度紊亂。

圖1 各組大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮病理學(xué)改變(HE染色，×100)

2.2 各組大鼠血清vWF含量比較 模型建立后取血測(cè)定vWF，與正常對(duì)照組(25.13±3.70)U/mL比較，模型組在1、8和17 d的vWF含量分別為(34.59±8.75)U/mL、(51.56±2.22)U/mL、(53.36±11.13)U/mL，白花丹參水提物低劑量給藥組分別為(31.88±4.77)、(47.30±7.96)U/mL、(45.18±5.41)U/mL，高劑量給藥組分別為(30.76±5.07)U/mL、(42.83±8.06)U/mL、(939.11±8.81)U/mL。給藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。白花丹參水提物給藥組的vWF含量低于血管內(nèi)皮損傷模型組。見圖2。

圖2 各組大鼠不同時(shí)間血清vWF含量比較(n=5)

2.3 各組大鼠血清VEGF含量比較 與正常對(duì)照組(926.87±285.96)pg/mL比較，模型組在1、8和17 d的VEGF含量分別為(1 350.83±234.63)pg/mL、(1 643.48±156.62)pg/mL、(1 763.67±198.59)pg/mL，白花丹參水提物低劑量給藥組分別為(1 314.83±255.36)pg/mL、(1 540.33±87.37)pg/mL、(1 607.32±244.07)pg/mL，高劑量給藥組分別為(1 256.83±198.13)pg/mL、(1 435.78±165.32)pg/mL、(1 517.82±204.50)pg/mL。白花丹參水提物給藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。白花丹參水提物給藥組的VEGF含量低于血管內(nèi)皮損傷模型組。見圖3。

圖3 各組大鼠不同時(shí)間血清VEGF含量比較(n=5)

2.4 各組大鼠血清MCP-1含量比較 模型建立后取血測(cè)定MCP-1，與正常對(duì)照組(23.87±2.96)pg/mL比較，模型組在1、8和17 d的MCP-1含量分別為(30.76±3.62)pg/mL、(38.83±4.63)pg/mL、(34.67±3.59)pg/mL，白花丹參水提物低劑量給藥組分別為(26.14±4.07)pg/mL、(32.83±1.36)pg/mL、(29.33±2.37)pg/mL，高劑量給藥組分別為(24.94±3.02)pg/mL、(28.73±2.32)pg/mL、(26.13±2.15)pg/mL。給藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。白花丹參水提物給藥組的MCP-1含量低于血管內(nèi)皮損傷模型組。見圖4。

圖4 各組大鼠不同時(shí)間血清MCP-1含量比較(n=5)

2.5 各組大鼠血清IL-10含量比較 模型建立后取血測(cè)定IL-10，與正常對(duì)照組(178.11±12.34)pg/mL比較，模型組在1、8和17 d的IL-10含量分別為(160.76±13.12)、(122.63±8.83)、(134.57±13.59)pg/mL，白花丹參水提物低劑量給藥組分別為(167.10±14.27)、(140.58±9.36)、(153.87±12.07)pg/mL，高劑量給藥組分別為(173.45±18.77)、(159.65±10.36)、(168.21±11.43)pg/mL。白花丹參水提物給藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。白花丹參水提物給藥組的IL-10含量高于血管內(nèi)皮損傷模型組。見圖5。

圖5 各組大鼠不同時(shí)間血清IL-10含量比較(n=5)

3 討論

vWF是來自血管內(nèi)皮細(xì)胞和血小板α顆粒的大分子糖蛋白，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并儲(chǔ)存于其中的懷布爾-帕拉德小體(Weibel-Palade body)。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受刺激時(shí)，vWF合成和釋放增加，與內(nèi)皮細(xì)胞上的膠原受體或血小板膜糖蛋白GM-Ib結(jié)合，完成血小板黏附并誘發(fā)血小板聚集和釋放反應(yīng)，釋放的活性物質(zhì)從多個(gè)環(huán)節(jié)激動(dòng)內(nèi)源性凝血途徑，進(jìn)而加速血栓形成[11]。此外，vWF還可促進(jìn)纖維蛋白原合成，使血液黏滯性增加有利于血栓形成。因此，vWF作為可用于判斷血管內(nèi)皮受損情況的公認(rèn)指標(biāo)，很好反映了血管內(nèi)皮的損傷情況。本研究發(fā)現(xiàn)白花丹參水提物給藥組的vWF含量低于血管內(nèi)皮損傷模型組，說明其可促進(jìn)鹽酸腎上腺素造成的大鼠血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)。

VEGF是近年來發(fā)現(xiàn)的直接而特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的高效促有絲分裂因子，在刺激新血管發(fā)生與生長(zhǎng)及維持血管壁的完整性和通透性方面均有重要意義。在眾多誘導(dǎo)血管生成的因子中，VEGF被認(rèn)為是特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞的最重要的血管生成因子。基本培養(yǎng)條件下，低濃度VEGF就可促進(jìn)不同來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[12-13]，很好反映了血管內(nèi)皮的損傷情況。研究表明VEGF的分泌與血清呈現(xiàn)一定的時(shí)間和濃度的依賴性。VEGF表達(dá)增高，則促內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂作用加強(qiáng)，內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖加速；血清能提供細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好和增殖加速，則VEGF表達(dá)量增加。本研究發(fā)現(xiàn)白花丹參水提物給藥組的VEGF含量低于血管內(nèi)皮損傷模型組，說明其可促進(jìn)鹽酸腎上腺素造成的大鼠血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)。

MCP-1可由單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞分泌，是屬于趨化因子CC亞家族的一員。MCP-1對(duì)單核細(xì)胞的趨化具有強(qiáng)烈的介導(dǎo)作用，可促使血液中的單核細(xì)胞附著在受損的內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞聚集。MCP-1由趨化因受體-2(Chemokine Receptor2,CCR-2)激活后可參與多種炎癥過程[14]。本研究發(fā)現(xiàn)白花丹參水提物給藥組的MCP-1含量低于血管內(nèi)皮損傷模型組，說明其具有促進(jìn)鹽酸腎上腺素造成的大鼠血管內(nèi)皮損傷修復(fù)作用。

IL-10是由Th2型T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞等產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可以抑制炎癥介質(zhì)的生成。IL-10能降低單核細(xì)胞的貼壁功能，下調(diào)細(xì)胞黏附分子和趨化因子的表達(dá)[15]。IL-10能抑制巨噬細(xì)胞的活性，對(duì)T淋巴細(xì)胞的黏附和分泌具有下調(diào)作用。同時(shí)能抑制中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的游走、浸潤(rùn)、增殖及活化[16]。本研究發(fā)現(xiàn)白花丹參水提物給藥組的IL-10含量高于血管內(nèi)皮損傷模型組，說明其具有促進(jìn)鹽酸腎上腺素造成的大鼠血管內(nèi)皮損傷修復(fù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)白花丹參水提物能夠降低大鼠內(nèi)皮損傷模型vWF、VEGF和MCP-1的含量，同時(shí)促進(jìn)IL-10的分泌，進(jìn)一步證實(shí)白花丹參水提物具有促進(jìn)鹽酸腎上腺素造成的大鼠血管內(nèi)皮損傷修復(fù)作用。