王炳然 張立平 彭 龍

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院東方醫(yī)院，北京，100078)

黃疸(Jaundice)又稱高膽紅素血癥(Hyperbilirubinemia)，是指由于血液中發(fā)生過量的膽紅素積聚而導(dǎo)致的身體組織黏膜的黃染。其中以鞏膜的黃染最先出現(xiàn)，因鞏膜含有較多的彈性蛋白，與膽紅素具有較高的親和力[1]，隨著血清膽紅素水平的進(jìn)一步提高，皮膚、黏膜及其他組織逐漸變?yōu)辄S色。黃疸的發(fā)生在不同年齡的人群中差異較大，其中以新生兒及老年人更易出現(xiàn)[2]。目前治療黃疸的化學(xué)藥物較少，而使用中藥治療臨床效果較明顯，黃疸的病機(jī)主要可概括為濕邪阻滯、瘀熱內(nèi)結(jié)、風(fēng)邪外襲、脾胃虛寒等。茵梔黃口服液作為臨床上廣泛應(yīng)用的具有退黃作用的中成藥，對(duì)新生兒黃疸、膽汁淤積性黃疸等均有顯著的療效[3-5]，中藥及其復(fù)方在治療黃疸方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

茵梔黃口服液的主要成分包括茵陳、梔子、黃芩和金銀花。茵陳具有清熱解毒、利膽、保肝、抗病毒等作用[6]；梔子具有涼血解毒、活血化瘀、利膽等作用[7]；黃芩具有清熱解毒、利膽、抗炎、抗氧化等作用[8]；金銀花具有清熱解毒、保肝利膽、抗氧化、抗血小板聚集等作用[9]。然而目前對(duì)其治療黃疸的作用機(jī)制研究較少，因此，探討分析茵梔黃口服液的有效成分、作用靶點(diǎn)及其可能的作用機(jī)制，有利于對(duì)其科學(xué)內(nèi)涵的闡釋和臨床應(yīng)用的推廣。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)茵梔黃口服液可能的活性成分，并通過化合物相似性分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析等手段，探討茵梔黃口服液治療黃疸的主要活性成分、重要靶點(diǎn)及相關(guān)通路。

1 資料與方法

1.1 茵梔黃口服液的有效成分和靶點(diǎn)篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)對(duì)茵梔黃口服液的4種成分進(jìn)行篩選[10]。以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18作為篩選條件[11]，利用TCMSP對(duì)有效成分作用靶點(diǎn)加以預(yù)測(cè)。

1.2 有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 “有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”的構(gòu)建和分析主要通過Cytoscape 3.7.2進(jìn)行，用“節(jié)點(diǎn)”(Node)表示成分、蛋白，用“邊”(Edge)表示成分之間的相互作用關(guān)系[12]；用Network Analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，節(jié)點(diǎn)的度值(Degree)表示網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點(diǎn)相連節(jié)點(diǎn)的數(shù)量，一般來說，節(jié)點(diǎn)的度值越大則越可能是化合物的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 將“jaundice(黃疸)”作為關(guān)鍵詞，對(duì)3個(gè)常用數(shù)據(jù)庫：GeneCards(https://www.genecards.org/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)進(jìn)行已知疾病的靶點(diǎn)檢索及篩選，并刪除檢索結(jié)果中重復(fù)的靶點(diǎn)，整理后建立黃疸相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。對(duì)比分析藥物化學(xué)成分作用靶點(diǎn)與黃疸相關(guān)靶點(diǎn)，得到藥物與疾病的交集靶點(diǎn)。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述得到的交集靶點(diǎn)錄入STRING平臺(tái)(https://string-db.org/)獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，再將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，利用MCODE插件進(jìn)行分析，得到潛在的蛋白功能模塊，并對(duì)其參與的生物學(xué)進(jìn)程進(jìn)行功能描述。利用Cytoscape 3.7.2對(duì)有效成分及潛在靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行繪制和分析，確定茵梔黃口服液中發(fā)揮重要作用的成分和靶點(diǎn)，根據(jù)不同靶點(diǎn)與成分的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行分類展示。

1.5 靶點(diǎn)功能與通路的富集分析 將茵梔黃口服液治療黃疸的靶點(diǎn)錄入有詳盡的功能注釋并且定期更新基因和蛋白數(shù)據(jù)的Metascape平臺(tái)(http://metascape.org/gp/index.html)[13]，進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，設(shè)置P<0.01，分別選擇生物過程(Biological Process，BP)、細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF)3個(gè)模塊的前10個(gè)條目錄入微生信平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化?；谕酚成浒袠?biāo)，使用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)以進(jìn)一步篩選茵梔黃口服液治療黃疸的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 利用AutoDock Vina 1.1.2軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白與入血的關(guān)鍵成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫和PubChem數(shù)據(jù)庫中獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)，應(yīng)用AutoDock Tools 1.5.6對(duì)上述靶點(diǎn)蛋白的受體和配體進(jìn)行常規(guī)處理,再利用插件AutoGrid將得到的對(duì)接活性位點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,選取對(duì)接結(jié)合能(Affinity)最低的構(gòu)象進(jìn)行對(duì)接結(jié)合模式分析，并使用PyMOL完成作圖。

2 結(jié)果

2.1 茵梔黃口服液的有效成分和靶點(diǎn)篩選 通過對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫中茵梔黃口服液所有已收錄的成分及其藥物動(dòng)力學(xué)(Absorption and Distribution and Metabolism and Excretion，ADME)參數(shù)的相關(guān)檢索，共搜集到相關(guān)成分530個(gè)。在OB≥30%，DL≥0.18的篩選條件下檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫共搜集到有效成分87個(gè)，其中包含相關(guān)靶點(diǎn)的有效成分共36個(gè)。利用TCMSP靶點(diǎn)預(yù)測(cè)模型對(duì)有效成分作用靶點(diǎn)加以預(yù)測(cè)，排除重復(fù)靶點(diǎn)，共獲得預(yù)測(cè)靶點(diǎn)233個(gè)。見圖1、表1。

圖1 根據(jù)ADME參數(shù)篩選出茵梔黃口服液有效成分

表1 茵梔黃口服液的有效化學(xué)成分

2.2 茵梔黃口服液“有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析 共得到273個(gè)節(jié)點(diǎn)(包含233個(gè)靶點(diǎn)、36個(gè)有效成分和4個(gè)中藥)和825條關(guān)系，其中節(jié)點(diǎn)的大小與該節(jié)點(diǎn)的Degree值正相關(guān)，而Degree值越大代表生物學(xué)重要性越強(qiáng)。見圖2。

圖2 茵梔黃口服液的有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 黃疸相關(guān)的疾病靶點(diǎn)檢索 去掉重復(fù)后共得到2 039個(gè)已知的靶點(diǎn)。

2.4 茵梔黃口服液治療黃疸的PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將茵梔黃口服液的成分靶點(diǎn)與黃疸的疾病靶點(diǎn)取交集后，得到了交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖3。其中橙色靶點(diǎn)如IL-6、TNF、MAPK1、MAPK8等被認(rèn)為在茵梔黃口服液治療黃疸的過程中具有重要的功能。對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)相互作用關(guān)系進(jìn)行分析，得到了Module，即更具有生物學(xué)意義的集合。見圖4。根據(jù)P值，保留PPI網(wǎng)絡(luò)與Module中3個(gè)評(píng)分最高的生物學(xué)進(jìn)程。見表2。

圖3 茵梔黃口服液治療黃疸的靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 茵梔黃口服液治療黃疸的靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中潛在Module網(wǎng)絡(luò)

表2 茵梔黃口服液治療黃疸的靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中潛在Module功能描述(前3位)

2.5 富集分析結(jié)果

2.5.1 GO富集分析 主要的BP有對(duì)無機(jī)物和脂多糖的應(yīng)答、對(duì)凋亡的調(diào)控；MF主要集中在調(diào)控細(xì)胞因子受體結(jié)合和對(duì)多種蛋白激酶活性的調(diào)節(jié)；CC則集中在膜筏、蛋白激酶復(fù)合物及囊腔結(jié)構(gòu)。見圖5。

圖5 GO功能富集分析

2.5.2 KEGG富集分析 “靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)共有20條信號(hào)通路、109個(gè)基因和614條關(guān)系，主要涉及以下通路：丙型肝炎、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、核因子κB信號(hào)通路等；具有較大Degree值的靶點(diǎn)TNF、MAPK8、MAPK1、PRKCA、IL6、BAX、AKT1、TGFB1等可能是茵梔黃口服液治療黃疸的核心靶點(diǎn)。見圖6。

圖6 茵梔黃口服液治療黃疸的靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對(duì)接結(jié)果分析 結(jié)果顯示，結(jié)合能均小于-5 kcal/mol(1 cal=4.184 J)，受體與配體能夠自發(fā)結(jié)合，并且具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。見圖7。結(jié)合能力最強(qiáng)的是TGFB1和木犀草素。見圖8。

圖7 分子對(duì)接結(jié)果

圖8 TGFB1與關(guān)鍵活性成分結(jié)合模式

3 討論

“黃疸”一詞最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》：“身痛而色微黃，齒垢黃，爪甲上黃，黃疸也。”“溺黃赤安臥者，黃疸也”“目黃者，曰黃疸”“濕熱相交，民當(dāng)病疸?！敝嗅t(yī)學(xué)將黃疸歸納為一種以目黃、身黃、小便黃為主要特性的疾病。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，膽紅素代謝異常是導(dǎo)致黃疸發(fā)生的主要病因，目前臨床上治療黃疸的化學(xué)藥物較少，而茵梔黃口服液具有消退黃疸和降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用，對(duì)慢性病毒性肝炎、肝細(xì)胞性黃疸、新生兒黃疸等均有較好的療效[14]。茵梔黃口服液由茵陳、梔子、黃芩和金銀花4味藥組成，其中茵陳為君藥，梔子、黃芩為臣藥，3藥配伍，加強(qiáng)了清熱利濕，解毒退黃的作用，又佐以能清熱解毒，消腫敗毒的金銀花，得以共奏利濕退黃，清熱解毒之功。

通過對(duì)茵梔黃口服液治療黃疸的主要活性成分、靶點(diǎn)和通路進(jìn)行分析，篩選出主要活性成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素、黃芩素等。相關(guān)研究證實(shí)，槲皮素能夠增加肝細(xì)胞對(duì)血液中膽紅素的攝取功能，減少膽紅素對(duì)器官造成的損傷，對(duì)肝損傷起到較好的修復(fù)作用，同時(shí)，槲皮素可通過增加法尼酯X受體(Farnesoid X Receptor，F(xiàn)XR)的表達(dá)量來誘導(dǎo)膽鹽輸出泵(Bile Salt Export Pump，BSEP)與多藥耐藥蛋白2(Multidrug Resistance Proteins 2，MRP2)的表達(dá)，加速膽酸鹽的排泄[15]；山柰酚可以通過調(diào)節(jié)核因子κB信號(hào)通路來減輕肝臟的炎癥反應(yīng)，從而進(jìn)一步改善肝臟損傷，達(dá)到保護(hù)肝臟的作用，同時(shí)，山柰酚能夠提高發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的肝細(xì)胞生存率，減少肝細(xì)胞乳酸脫氫酶的釋放，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-同源蛋白(C/Enhancer-Binding Protein-Homologous Protein，CHOP)的表達(dá)，從而減輕肝細(xì)胞的凋亡[16-17]；木犀草素能夠降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平下降，使血紅素氧合酶-1表達(dá)明顯升高，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化性，減輕組織的氧化損傷，緩解肝損傷[18]；Shi等[19]研究表明黃芩素能夠誘導(dǎo)核因子-紅系2相關(guān)因子(Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2，Nrf2)的活化，并增加其下游抗氧化基因的表達(dá)，發(fā)揮對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝毒性的保護(hù)作用。

同時(shí)，研究結(jié)果表明，茵梔黃口服液治療黃疸的主要靶點(diǎn)可能是TNF、MAPK8、MAPK1、PRKCA、IL-6、BAX、AKT1、TGFB1等。有研究表明，在梗阻性黃疸大鼠模型中，腫瘤壞死因子-α?xí)ㄟ^多種途徑激活中性粒細(xì)胞使之向肝竇內(nèi)皮黏附并穿過、激活凝血系統(tǒng)導(dǎo)致肝內(nèi)毛細(xì)血管中血栓形成、激活肝內(nèi)的磷脂酶，分解磷脂為花生四烯酸，而產(chǎn)生對(duì)肝細(xì)胞有毒性作用的白三烯和超氧自由基，同時(shí)，腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6和血小板活化因子可協(xié)同作用而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[20]。促分裂原活化的蛋白激酶可以調(diào)節(jié)肝臟組織的氧化還原反應(yīng)、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，間接對(duì)肝細(xì)胞損傷起到改善作用[21]。蛋白激酶Cα(Protein Kinase C alpha，PRKCA)能夠通過阻斷P53的誘導(dǎo)保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，并且能通過誘導(dǎo)κB抑制物(Inhibitor of KappaB，IκB)來下調(diào)核因子κB介導(dǎo)的多種炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)[22]。B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X(B-cell Lymphoma-2 Associated X，BAX)蛋白可以引起細(xì)胞線粒體膜的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而激活凋亡執(zhí)行蛋白胱天蛋白酶-3，引起細(xì)胞凋亡[23]。研究發(fā)現(xiàn)，梗阻性黃疸發(fā)生時(shí)磷酸化-蛋白激酶B(p-Protein Kinase B,p-AKT)蛋白表達(dá)水平會(huì)應(yīng)激性增高，AKT能夠激活下游通路發(fā)揮抗氧化、保護(hù)腸黏膜屏障的作用[24]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B1(Transforming Growth Factor Beta 1,TGFB1會(huì)影響正常肝細(xì)胞和受損肝細(xì)胞的纖連蛋白生成，導(dǎo)致肝細(xì)胞和導(dǎo)管再生并增加肝組織中的細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)黃疸導(dǎo)致的肝損害起到保護(hù)作用[25]。以上研究表明，茵梔黃口服液可以通過多靶點(diǎn)對(duì)黃疸起到調(diào)治作用。

從富集分析結(jié)果可知，茵梔黃口服液可以通過多種途徑發(fā)揮對(duì)黃疸的治療作用：1)改變膽紅素代謝。主要與甲狀腺激素信號(hào)通路相關(guān)。甲狀腺激素具有調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的作用，有研究發(fā)現(xiàn)，采用外源性甲狀腺激素能夠改善梗阻性黃疸大鼠的甲狀腺激素水平異常，調(diào)節(jié)梗阻性黃疸大鼠膽紅素的代謝，在減輕肝組織損傷的同時(shí)改善肝組織的合成功能，發(fā)揮對(duì)肝組織的保護(hù)作用[26]。2)減輕對(duì)肝組織的損傷。主要與PI3K-AKT信號(hào)通路、核因子κB信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等相關(guān)。PI3K-AKT信號(hào)通路在細(xì)胞中普遍存在，它參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞代謝、增殖、分化、凋亡等多個(gè)重要的生理過程[27]。有研究顯示，由于梗阻性黃疸會(huì)導(dǎo)致肺通氣功能降低，PI3K-AKT信號(hào)通路可通過缺氧誘導(dǎo)因子-1上調(diào)Toll樣受體4的表達(dá)，從而增加炎癥反應(yīng)和組織損傷[28-29]；同時(shí)有實(shí)驗(yàn)表明，地塞米松可能通過激活PI3K-AKT信號(hào)通路改善梗阻性黃疸誘導(dǎo)的肝組織損傷，減少肝細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對(duì)肝組織的保護(hù)作用[30]。核因子κB信號(hào)通路的活化與機(jī)體炎癥有密切關(guān)系，并會(huì)參與抗原遞呈、炎癥介質(zhì)釋放、免疫激活等過程[31]。有研究表明，在梗阻性黃疸發(fā)生時(shí)，肝組織中核因子κB通路的關(guān)鍵蛋白表達(dá)增加，肝細(xì)胞凋亡指數(shù)上升，肝組織損傷加重[32]。T細(xì)胞受體(T Cell Receptor，TCR)能夠通過與共刺激分子CD226的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)協(xié)同作用，使酪氨酸磷酸化觸發(fā)VAV1(vav鳥嘌呤核苷酸交換因子)的激活，來正向調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-7等細(xì)胞因子[33]，白細(xì)胞介素-17是由CD4+T細(xì)胞分泌的一種重要的炎癥介質(zhì)，可誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)，如白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子、趨化因子等表達(dá)，并介導(dǎo)中性粒細(xì)胞在肝臟的浸潤(rùn)，導(dǎo)致肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)和組織損傷[34]，在膽汁淤積過程中，白細(xì)胞介素-17可能會(huì)增強(qiáng)肝細(xì)胞對(duì)膽汁酸誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)而在正反饋通路中誘導(dǎo)Th17細(xì)胞腫脹[35]。

綜上所述，膽紅素的代謝是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，有多種酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體及細(xì)胞因子參與，當(dāng)參與膽紅素生物轉(zhuǎn)化的因子出現(xiàn)異常時(shí)，可能會(huì)引起膽紅素代謝異常，導(dǎo)致黃疸等疾病的發(fā)生[36]。因此，在治療時(shí)應(yīng)針對(duì)病因、機(jī)體內(nèi)環(huán)境、代謝過程等，進(jìn)行多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)的干預(yù)，這正與中醫(yī)理論中整體觀念、辨證論治、根據(jù)標(biāo)本緩急進(jìn)行治療的理念相吻合。故應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥復(fù)方“多成分、多靶點(diǎn)、多通路”的特點(diǎn)，既能在分子水平上理解疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，又能系統(tǒng)分析和預(yù)測(cè)作用機(jī)制，為后續(xù)的驗(yàn)證和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供重要依據(jù)。