王炳然 張立平 彭 龍

(1 北京中醫(yī)藥大學，北京，100029； 2 北京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院東方醫(yī)院，北京，100078)

黃疸(Jaundice)又稱高膽紅素血癥(Hyperbilirubinemia)，是指由于血液中發(fā)生過量的膽紅素積聚而導致的身體組織黏膜的黃染。其中以鞏膜的黃染最先出現(xiàn)，因鞏膜含有較多的彈性蛋白，與膽紅素具有較高的親和力[1]，隨著血清膽紅素水平的進一步提高，皮膚、黏膜及其他組織逐漸變?yōu)辄S色。黃疸的發(fā)生在不同年齡的人群中差異較大，其中以新生兒及老年人更易出現(xiàn)[2]。目前治療黃疸的化學藥物較少，而使用中藥治療臨床效果較明顯，黃疸的病機主要可概括為濕邪阻滯、瘀熱內結、風邪外襲、脾胃虛寒等。茵梔黃口服液作為臨床上廣泛應用的具有退黃作用的中成藥，對新生兒黃疸、膽汁淤積性黃疸等均有顯著的療效[3-5]，中藥及其復方在治療黃疸方面具有獨特的優(yōu)勢。

茵梔黃口服液的主要成分包括茵陳、梔子、黃芩和金銀花。茵陳具有清熱解毒、利膽、保肝、抗病毒等作用[6]；梔子具有涼血解毒、活血化瘀、利膽等作用[7]；黃芩具有清熱解毒、利膽、抗炎、抗氧化等作用[8]；金銀花具有清熱解毒、保肝利膽、抗氧化、抗血小板聚集等作用[9]。然而目前對其治療黃疸的作用機制研究較少，因此，探討分析茵梔黃口服液的有效成分、作用靶點及其可能的作用機制，有利于對其科學內涵的闡釋和臨床應用的推廣。本文通過網絡藥理學預測茵梔黃口服液可能的活性成分，并通過化合物相似性分析和蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡分析等手段，探討茵梔黃口服液治療黃疸的主要活性成分、重要靶點及相關通路。

1 資料與方法

1.1 茵梔黃口服液的有效成分和靶點篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)對茵梔黃口服液的4種成分進行篩選[10]。以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18作為篩選條件[11]，利用TCMSP對有效成分作用靶點加以預測。

1.2 有效成分-靶點網絡的構建 “有效成分-靶點網絡”的構建和分析主要通過Cytoscape 3.7.2進行，用“節(jié)點”(Node)表示成分、蛋白，用“邊”(Edge)表示成分之間的相互作用關系[12]；用Network Analyzer插件進行網絡特征分析，節(jié)點的度值(Degree)表示網絡中與該節(jié)點相連節(jié)點的數(shù)量，一般來說，節(jié)點的度值越大則越可能是化合物的關鍵靶點。

1.3 疾病相關靶點的篩選 將“jaundice(黃疸)”作為關鍵詞，對3個常用數(shù)據(jù)庫：GeneCards(https://www.genecards.org/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)進行已知疾病的靶點檢索及篩選，并刪除檢索結果中重復的靶點，整理后建立黃疸相關靶點數(shù)據(jù)集。對比分析藥物化學成分作用靶點與黃疸相關靶點，得到藥物與疾病的交集靶點。

1.4 PPI網絡的構建 將上述得到的交集靶點錄入STRING平臺(https://string-db.org/)獲得PPI網絡，再將PPI網絡導入Cytoscape 3.7.2，利用MCODE插件進行分析，得到潛在的蛋白功能模塊，并對其參與的生物學進程進行功能描述。利用Cytoscape 3.7.2對有效成分及潛在靶點的關系網絡進行繪制和分析，確定茵梔黃口服液中發(fā)揮重要作用的成分和靶點，根據(jù)不同靶點與成分的對應關系進行分類展示。

1.5 靶點功能與通路的富集分析 將茵梔黃口服液治療黃疸的靶點錄入有詳盡的功能注釋并且定期更新基因和蛋白數(shù)據(jù)的Metascape平臺(http://metascape.org/gp/index.html)[13]，進行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，設置P<0.01，分別選擇生物過程(Biological Process，BP)、細胞組分(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF)3個模塊的前10個條目錄入微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)對數(shù)據(jù)進行可視化?；谕酚成浒袠耍褂肅ytoscape 3.7.2構建“靶點-通路”網絡以進一步篩選茵梔黃口服液治療黃疸的關鍵靶點。

1.6 分子對接驗證 利用AutoDock Vina 1.1.2軟件對PPI網絡中的關鍵靶點蛋白與入血的關鍵成分進行分子對接驗證。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫和PubChem數(shù)據(jù)庫中獲得關鍵靶點的三維結構，應用AutoDock Tools 1.5.6對上述靶點蛋白的受體和配體進行常規(guī)處理,再利用插件AutoGrid將得到的對接活性位點進行分子對接,選取對接結合能(Affinity)最低的構象進行對接結合模式分析，并使用PyMOL完成作圖。

2 結果

2.1 茵梔黃口服液的有效成分和靶點篩選 通過對TCMSP數(shù)據(jù)庫中茵梔黃口服液所有已收錄的成分及其藥物動力學(Absorption and Distribution and Metabolism and Excretion，ADME)參數(shù)的相關檢索，共搜集到相關成分530個。在OB≥30%，DL≥0.18的篩選條件下檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫共搜集到有效成分87個，其中包含相關靶點的有效成分共36個。利用TCMSP靶點預測模型對有效成分作用靶點加以預測，排除重復靶點，共獲得預測靶點233個。見圖1、表1。

圖1 根據(jù)ADME參數(shù)篩選出茵梔黃口服液有效成分

表1 茵梔黃口服液的有效化學成分

2.2 茵梔黃口服液“有效成分-靶點”網絡的構建和分析 共得到273個節(jié)點(包含233個靶點、36個有效成分和4個中藥)和825條關系，其中節(jié)點的大小與該節(jié)點的Degree值正相關，而Degree值越大代表生物學重要性越強。見圖2。

圖2 茵梔黃口服液的有效成分-靶點網絡

2.3 黃疸相關的疾病靶點檢索 去掉重復后共得到2 039個已知的靶點。

2.4 茵梔黃口服液治療黃疸的PPI網絡的構建 將茵梔黃口服液的成分靶點與黃疸的疾病靶點取交集后，得到了交集靶點的PPI網絡。見圖3。其中橙色靶點如IL-6、TNF、MAPK1、MAPK8等被認為在茵梔黃口服液治療黃疸的過程中具有重要的功能。對PPI網絡中的靶點相互作用關系進行分析，得到了Module，即更具有生物學意義的集合。見圖4。根據(jù)P值，保留PPI網絡與Module中3個評分最高的生物學進程。見表2。

圖3 茵梔黃口服液治療黃疸的靶點PPI網絡

圖4 茵梔黃口服液治療黃疸的靶點PPI網絡中潛在Module網絡

表2 茵梔黃口服液治療黃疸的靶點PPI網絡中潛在Module功能描述(前3位)

2.5 富集分析結果

2.5.1 GO富集分析 主要的BP有對無機物和脂多糖的應答、對凋亡的調控；MF主要集中在調控細胞因子受體結合和對多種蛋白激酶活性的調節(jié)；CC則集中在膜筏、蛋白激酶復合物及囊腔結構。見圖5。

圖5 GO功能富集分析

2.5.2 KEGG富集分析 “靶點-通路”網絡共有20條信號通路、109個基因和614條關系，主要涉及以下通路：丙型肝炎、T細胞受體信號通路、IL-17信號通路、PI3K-AKT信號通路、甲狀腺激素信號通路、核因子κB信號通路等；具有較大Degree值的靶點TNF、MAPK8、MAPK1、PRKCA、IL6、BAX、AKT1、TGFB1等可能是茵梔黃口服液治療黃疸的核心靶點。見圖6。

圖6 茵梔黃口服液治療黃疸的靶點-通路網絡

2.6 分子對接結果分析 結果顯示，結合能均小于-5 kcal/mol(1 cal=4.184 J)，受體與配體能夠自發(fā)結合，并且具有較強的結合活性。見圖7。結合能力最強的是TGFB1和木犀草素。見圖8。

圖7 分子對接結果

圖8 TGFB1與關鍵活性成分結合模式

3 討論

“黃疸”一詞最早見于《黃帝內經》：“身痛而色微黃，齒垢黃，爪甲上黃，黃疸也?！薄澳琰S赤安臥者，黃疸也”“目黃者，曰黃疸”“濕熱相交，民當病疸。”中醫(yī)學將黃疸歸納為一種以目黃、身黃、小便黃為主要特性的疾病?，F(xiàn)代藥理學研究證實，膽紅素代謝異常是導致黃疸發(fā)生的主要病因，目前臨床上治療黃疸的化學藥物較少，而茵梔黃口服液具有消退黃疸和降低谷丙轉氨酶的作用，對慢性病毒性肝炎、肝細胞性黃疸、新生兒黃疸等均有較好的療效[14]。茵梔黃口服液由茵陳、梔子、黃芩和金銀花4味藥組成，其中茵陳為君藥，梔子、黃芩為臣藥，3藥配伍，加強了清熱利濕，解毒退黃的作用，又佐以能清熱解毒，消腫敗毒的金銀花，得以共奏利濕退黃，清熱解毒之功。

通過對茵梔黃口服液治療黃疸的主要活性成分、靶點和通路進行分析，篩選出主要活性成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素、黃芩素等。相關研究證實，槲皮素能夠增加肝細胞對血液中膽紅素的攝取功能，減少膽紅素對器官造成的損傷，對肝損傷起到較好的修復作用，同時，槲皮素可通過增加法尼酯X受體(Farnesoid X Receptor，F(xiàn)XR)的表達量來誘導膽鹽輸出泵(Bile Salt Export Pump，BSEP)與多藥耐藥蛋白2(Multidrug Resistance Proteins 2，MRP2)的表達，加速膽酸鹽的排泄[15]；山柰酚可以通過調節(jié)核因子κB信號通路來減輕肝臟的炎癥反應，從而進一步改善肝臟損傷，達到保護肝臟的作用，同時，山柰酚能夠提高發(fā)生內質網應激的肝細胞生存率，減少肝細胞乳酸脫氫酶的釋放，抑制內質網應激誘導的CCAAT/增強子結合蛋白-同源蛋白(C/Enhancer-Binding Protein-Homologous Protein，CHOP)的表達，從而減輕肝細胞的凋亡[16-17]；木犀草素能夠降低血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶水平下降，使血紅素氧合酶-1表達明顯升高，增強機體的抗氧化性，減輕組織的氧化損傷，緩解肝損傷[18]；Shi等[19]研究表明黃芩素能夠誘導核因子-紅系2相關因子(Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2，Nrf2)的活化，并增加其下游抗氧化基因的表達，發(fā)揮對對乙酰氨基酚誘導的肝毒性的保護作用。

同時，研究結果表明，茵梔黃口服液治療黃疸的主要靶點可能是TNF、MAPK8、MAPK1、PRKCA、IL-6、BAX、AKT1、TGFB1等。有研究表明，在梗阻性黃疸大鼠模型中，腫瘤壞死因子-α會通過多種途徑激活中性粒細胞使之向肝竇內皮黏附并穿過、激活凝血系統(tǒng)導致肝內毛細血管中血栓形成、激活肝內的磷脂酶，分解磷脂為花生四烯酸，而產生對肝細胞有毒性作用的白三烯和超氧自由基，同時，腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6和血小板活化因子可協(xié)同作用而導致肝細胞損傷[20]。促分裂原活化的蛋白激酶可以調節(jié)肝臟組織的氧化還原反應、介導炎癥反應，間接對肝細胞損傷起到改善作用[21]。蛋白激酶Cα(Protein Kinase C alpha，PRKCA)能夠通過阻斷P53的誘導保護細胞免于凋亡，并且能通過誘導κB抑制物(Inhibitor of KappaB，IκB)來下調核因子κB介導的多種炎癥反應相關基因的表達[22]。B細胞淋巴瘤-2相關X(B-cell Lymphoma-2 Associated X，BAX)蛋白可以引起細胞線粒體膜的破壞，導致細胞色素C釋放，進而激活凋亡執(zhí)行蛋白胱天蛋白酶-3，引起細胞凋亡[23]。研究發(fā)現(xiàn)，梗阻性黃疸發(fā)生時磷酸化-蛋白激酶B(p-Protein Kinase B,p-AKT)蛋白表達水平會應激性增高，AKT能夠激活下游通路發(fā)揮抗氧化、保護腸黏膜屏障的作用[24]。轉化生長因子B1(Transforming Growth Factor Beta 1,TGFB1會影響正常肝細胞和受損肝細胞的纖連蛋白生成，導致肝細胞和導管再生并增加肝組織中的細胞外基質，對黃疸導致的肝損害起到保護作用[25]。以上研究表明，茵梔黃口服液可以通過多靶點對黃疸起到調治作用。

從富集分析結果可知，茵梔黃口服液可以通過多種途徑發(fā)揮對黃疸的治療作用：1)改變膽紅素代謝。主要與甲狀腺激素信號通路相關。甲狀腺激素具有調節(jié)物質代謝的作用，有研究發(fā)現(xiàn)，采用外源性甲狀腺激素能夠改善梗阻性黃疸大鼠的甲狀腺激素水平異常，調節(jié)梗阻性黃疸大鼠膽紅素的代謝，在減輕肝組織損傷的同時改善肝組織的合成功能，發(fā)揮對肝組織的保護作用[26]。2)減輕對肝組織的損傷。主要與PI3K-AKT信號通路、核因子κB信號通路、T細胞受體信號通路、IL-17信號通路等相關。PI3K-AKT信號通路在細胞中普遍存在，它參與體內炎癥反應、細胞代謝、增殖、分化、凋亡等多個重要的生理過程[27]。有研究顯示，由于梗阻性黃疸會導致肺通氣功能降低，PI3K-AKT信號通路可通過缺氧誘導因子-1上調Toll樣受體4的表達，從而增加炎癥反應和組織損傷[28-29]；同時有實驗表明，地塞米松可能通過激活PI3K-AKT信號通路改善梗阻性黃疸誘導的肝組織損傷，減少肝細胞凋亡，發(fā)揮對肝組織的保護作用[30]。核因子κB信號通路的活化與機體炎癥有密切關系，并會參與抗原遞呈、炎癥介質釋放、免疫激活等過程[31]。有研究表明，在梗阻性黃疸發(fā)生時，肝組織中核因子κB通路的關鍵蛋白表達增加，肝細胞凋亡指數(shù)上升，肝組織損傷加重[32]。T細胞受體(T Cell Receptor，TCR)能夠通過與共刺激分子CD226的信號轉導協(xié)同作用，使酪氨酸磷酸化觸發(fā)VAV1(vav鳥嘌呤核苷酸交換因子)的激活，來正向調節(jié)CD4+T細胞產生白細胞介素-7等細胞因子[33]，白細胞介素-17是由CD4+T細胞分泌的一種重要的炎癥介質，可誘導炎癥介質，如白細胞介素-6、腫瘤壞死因子、趨化因子等表達，并介導中性粒細胞在肝臟的浸潤，導致肝臟發(fā)生炎癥反應和組織損傷[34]，在膽汁淤積過程中，白細胞介素-17可能會增強肝細胞對膽汁酸誘導的炎癥介質的產生，進而在正反饋通路中誘導Th17細胞腫脹[35]。

綜上所述，膽紅素的代謝是一個復雜的生理過程，有多種酶、轉運體及細胞因子參與，當參與膽紅素生物轉化的因子出現(xiàn)異常時，可能會引起膽紅素代謝異常，導致黃疸等疾病的發(fā)生[36]。因此，在治療時應針對病因、機體內環(huán)境、代謝過程等，進行多系統(tǒng)、多靶點的干預，這正與中醫(yī)理論中整體觀念、辨證論治、根據(jù)標本緩急進行治療的理念相吻合。故應用網絡藥理學研究中藥復方“多成分、多靶點、多通路”的特點，既能在分子水平上理解疾病發(fā)生發(fā)展的機制，又能系統(tǒng)分析和預測作用機制，為后續(xù)的驗證和優(yōu)化實驗設計提供重要依據(jù)。