王華星 趙 凱 高 雪 李榮欣 許筱穎

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京，102488； 2 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京，100069)

玉屏風(fēng)散和褪黑素的臨床使用在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中具有重要的意義。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)聯(lián)合的方法，以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)全面檢索褪黑素及玉屏風(fēng)散可能作用于機(jī)體的免疫相關(guān)靶點(diǎn)及通路，以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究氣溫驟升驟降條件下，玉屏風(fēng)散與褪黑素對老年小鼠白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)的預(yù)防性干預(yù)作用，以更好地指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)用藥及二者的聯(lián)合使用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 84只雄性8周齡無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級昆明小鼠，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK(京)2016-0011。實(shí)驗(yàn)在北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。購入動(dòng)物后，將昆明小鼠飼養(yǎng)在聚乙烯動(dòng)物飼養(yǎng)箱中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。小鼠均可自由攝食攝水。飼料為鼠全價(jià)維持飼料。動(dòng)物房溫度(20±2)℃，相對濕度50%，自然光照，動(dòng)物倫理批號：BUCM-4-2018091101-3049。

1.1.2 藥物 生黃芪、炒白術(shù)和防風(fēng)均購置于北京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診部。褪黑素(上海生工生物工程股份有限公司，批號：A600605-0005)。

1.1.3 試劑與儀器 D-半乳糖(上海麥克林生化科技有限公司，批號：D810319)；小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒(北京瑞格博科技發(fā)展有限公司，批號:20190629.60013M；20190629.60023M；20190629.60080H)；人工智能氣候模擬箱(寧波江南儀器廠，型號：RXZ-500D)；酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司，芬蘭，型號：Thermo Multiskan MK3)；全自動(dòng)生化分析儀(Beckmancoulter公司，美國，型號：UniCel DxC 600 Synchron)；洗板機(jī)(長春賽諾邁德醫(yī)學(xué)技術(shù)有限責(zé)任公司，型號：Sunostik Sar-520B);低溫高速離心機(jī)(Beckman公司，美國，型號：GS-15R)；搖床(上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司，型號：SKY-200B)；漩渦儀(無錫天力機(jī)械制造有限公司，型號：TL96-A)。

1.2 方法

1.2.1 玉屏風(fēng)散、褪黑素潛在靶點(diǎn)及共同潛在靶點(diǎn)的收集與篩選 依據(jù)《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價(jià)方法指南》[1]，在中醫(yī)藥生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫SymMap(https://www.symmap.org/)中檢索“黃芪”“白術(shù)”“防風(fēng)”，P值設(shè)置為0.05，獲得Targets列表。在韋恩圖計(jì)算繪制工具中合并并保留唯一值，即為玉屏風(fēng)散的潛在靶點(diǎn)。在比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫[2](Comparative Toxicogenomics Database，CTD,http://ctdbase.org/)選擇關(guān)鍵詞“化學(xué)成分”(Chemicals)，檢索“褪黑素”(Melatonin)，得到褪黑素的潛在作用靶點(diǎn)。將玉屏風(fēng)散和褪黑素的靶點(diǎn)在韋恩圖計(jì)算繪制工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)中取交集，獲得玉屏風(fēng)散-褪黑素的共同潛在靶點(diǎn)。

1.2.2 玉屏風(fēng)散、褪黑素潛在靶點(diǎn)的基因本體(Gene Ontology,GO)免疫系統(tǒng)過程富集分析 將玉屏風(fēng)散和褪黑素的潛在靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件及其中的cytoHubba插件、ClueGO插件[3-5]，使用GO分析中的免疫系統(tǒng)過程(Immune System Process，ISP)富集分析。

1.2.3 玉屏風(fēng)散、褪黑素潛在關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)篩選 提取各ISP通路所涉及的相關(guān)靶點(diǎn)，作為玉屏風(fēng)散、褪黑素的免疫通路相關(guān)靶點(diǎn)，并取其中ISP通路占比大于平均值者，分別作為玉屏風(fēng)散和褪黑素的關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)。選擇物種“Homo Sapiens”，設(shè)置P<0.05，Kappa值為默認(rèn)的0.4，分別得到玉屏風(fēng)散、褪黑素所涉及的免疫通路，和這些免疫通路中的相關(guān)靶點(diǎn)，進(jìn)行可視化處理和拓?fù)鋵W(xué)分析，并篩選出關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)。

1.2.4 關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將2組關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)分別輸入PPI網(wǎng)絡(luò)功能富集分析數(shù)據(jù)庫STRING(Protein-Protein Interaction Networks Functional Enrichment Analysis，https://string-db.org/)[6]，在“生物體”(Organism)中選擇“人類”(Homo Sapiens)，得到2組關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)分別構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行可視化處理。并使用Cytoscape基于節(jié)點(diǎn)度(Degree)、介數(shù)中心性(Betweenness Centrality，BC)、接近中心性(Closeness Centrality，CC)對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。

1.2.5 京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析 將2組關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)分別輸入ClueGO并進(jìn)行KEGG信號通路富集分析。選擇物種“Homo Sapiens”，設(shè)置P<0.05，為了使結(jié)果分組顯示更為清晰，設(shè)置Kappa值為0.6。

1.2.6 玉屏風(fēng)散與褪黑素免疫功能分子機(jī)制的異同比較 將玉屏風(fēng)散與褪黑素的免疫關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行比較，得到二者之間的異同。將玉屏風(fēng)散與褪黑素的GO ISP通路、KEGG通路進(jìn)行比較，得到二者免疫相關(guān)通路的異同。

1.2.7 溶液制備 中藥復(fù)方參照出處《醫(yī)方類聚》及現(xiàn)代常用組方，玉屏風(fēng)散：生黃芪、炒白術(shù)、防風(fēng)[7]。將上述藥材經(jīng)過煎煮濃縮為含有生藥1 g/mL的藥液，分別灌裝后放4 ℃冰箱保存。

1.2.8 分組與模型制備 將適應(yīng)性飼養(yǎng)后的小鼠用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分組。按氣溫處理因素分為常溫對照、氣溫驟降、氣溫驟升3項(xiàng)。

對每種氣溫處理，均以藥物干預(yù)作為研究因素，即玉屏風(fēng)散(Y)、褪黑素(T)，每個(gè)因素各取2個(gè)水平，將2個(gè)因素交叉組合，使每個(gè)氣溫項(xiàng)下均得到4個(gè)觀察組。2種藥物均不用的組別以生理鹽水灌胃作為對照組。

共得到3×4=12組，每組7只。每組具體編號為：C、CY、CT、CYT；L、LY、LT、LYT；H、HY、HT、HYT。

按組別將相應(yīng)受試藥物給小鼠灌胃6周。將玉屏風(fēng)散煎劑分別給玉屏風(fēng)散組(編號CY、LY、HY組)的小鼠按每次0.1 mL/(10 g)，1次/d灌胃，每次灌胃0.4 mL；褪黑素用生理鹽水稀釋后給褪黑素組(編號CT、LT、HT組)按每次0.15 mg/(10 g)，1次/d小鼠灌胃，灌胃0.2 mL/次；將上述劑量的玉屏風(fēng)散煎劑與褪黑素混合給玉屏風(fēng)散+褪黑素組(編號CYT、LYT、HYT組)的小鼠灌胃，每次灌胃0.6 mL的混合藥液；對照組給予等量的生理鹽水灌胃。

受試藥物灌胃結(jié)束后，將小鼠按組別依次放入預(yù)先調(diào)試好的人工氣候模擬箱中進(jìn)行氣溫干預(yù)。氣溫驟降從30 ℃在30 min內(nèi)下降到8 ℃，氣溫驟升從8 ℃在30 min內(nèi)上升至30 ℃，相對濕度保持自然條件濕度，光照時(shí)間參照自然光照，持續(xù)10 h。

1.2.9 IL-1β、IL-6、TNF-α檢測 試驗(yàn)干預(yù)完成后，所有小鼠禁食禁水12 h后進(jìn)行摘眼球取血1 mL左右，將血液用低溫高速離心機(jī)以4 ℃，3 000 r/min，離心半徑10 cm的條件下離心15 min，分離上清液，保存于-80 ℃冰箱。小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α使用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測，經(jīng)過洗液配制、孵育、洗液洗孔、顯色等步驟，用酶標(biāo)儀讀取數(shù)值。

2 結(jié)果

2.1 玉屏風(fēng)散、褪黑素潛在靶點(diǎn)及共同潛在靶點(diǎn) 從SymMap數(shù)據(jù)庫中共檢索到黃芪、白術(shù)、防風(fēng)可能的作用靶點(diǎn)240個(gè)、46個(gè)、137個(gè)，將此三味中藥的靶點(diǎn)去重后得到玉屏風(fēng)散的潛在作用靶點(diǎn)共計(jì)339個(gè)。從CTD數(shù)據(jù)庫中檢索到的褪黑素的潛在靶點(diǎn)325個(gè)。將玉屏風(fēng)散和褪黑素的靶點(diǎn)用韋恩圖處理并取交集之后，得到二者共同的潛在作用靶點(diǎn)85個(gè)。見圖1。

圖1 玉屏風(fēng)散和褪黑素的共同潛在靶點(diǎn)預(yù)測

2.2 玉屏風(fēng)散、褪黑素潛在靶點(diǎn)的GO免疫系統(tǒng)過程富集分析 將玉屏風(fēng)散的339個(gè)潛在靶點(diǎn)和褪黑素的325個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示，玉屏風(fēng)散涉及免疫過程11條(P<0.05)，共分為了6類(Kappa=0.4)。見圖2～3。其中白細(xì)胞分化(Leukocyte Differentiation)、T細(xì)胞活化(T Cell Activation)、淋巴細(xì)胞增殖(Lymphocyte Proliferation)、淋巴細(xì)胞增殖的調(diào)控(Regulation of Lymphocyte Proliferation)、T細(xì)胞增殖(T Cell Proliferation)等通路的基因占比位居前列；而白細(xì)胞遷移的正向調(diào)控(Positive Regulation of Leukocyte Migration)、未成熟T細(xì)胞的增殖(Immature T Cell Proliferation)、未成熟T細(xì)胞增殖的調(diào)控(Regulation of Immature T Cell Proliferation)、抗原刺激下慢性炎癥反應(yīng)的調(diào)控(Regulation of Chronic Inflammatory Response to Antigenic Stimulus)是其相對于褪黑素而言獨(dú)有的免疫系統(tǒng)過程。褪黑素涉及免疫過程32條(P<0.05)，共分為了11類(Kappa=0.4)。見圖4～5。其中造血功能(Hemopoiesis)、白細(xì)胞分化(Leukocyte Differentiation)、T細(xì)胞活化(T Cell Activation)、骨髓細(xì)胞分化(Myeloid Cell Differentiation)、骨髓白細(xì)胞分化(Myeloid Leukocyte Differentiation)等通路的基因占比位居前列；而造血功能(Hemopoiesis)、骨髓細(xì)胞分化(Myeloid Cell Differentiation)、骨髓白細(xì)胞分化(Myeloid Leukocyte Differentiation)、T細(xì)胞活化的調(diào)控(Regulation of T Cell Activation)等通路是其相對于玉屏風(fēng)散而言特有的免疫系統(tǒng)過程。

圖2 玉屏風(fēng)散GO免疫系統(tǒng)過程富集分析結(jié)果

圖3 玉屏風(fēng)散GO免疫系統(tǒng)過程富集分析的分類

圖4 褪黑素GO免疫系統(tǒng)過程富集分析結(jié)果

圖5 褪黑素GO免疫系統(tǒng)過程富集的分類

2.3 玉屏風(fēng)散、褪黑素的關(guān)鍵免疫靶點(diǎn) 提取上述ISP通路所涉及全部靶點(diǎn)，得到玉屏風(fēng)散、褪黑素的免疫通路相關(guān)靶點(diǎn)分別有62個(gè)、84個(gè)，靶點(diǎn)涉及的ISP通路數(shù)目(通路數(shù))平均值分別為3.097/11條、7.143/32條。將ISP通路占比高于平均值的靶點(diǎn)分別作為玉屏風(fēng)散、褪黑素的關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)，得到關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)20個(gè)、32個(gè)。其中玉屏風(fēng)散的免疫靶點(diǎn)中通路占比最高的依次為BMP4、TGFB1、IL1B、CDKN2A、ERBB2等，褪黑素中通路占比最高的依次為IL4、TGFB1、IFNG、HMGB1、RORA等，二者共有的關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)包括TGFB1、IL1B、IL4、IL6、IL10、CASP3和BCL2。

2.4 玉屏風(fēng)散、褪黑素關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò) 由STRING分析得知，玉屏風(fēng)散的20個(gè)關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)共產(chǎn)生了82條邊，平均節(jié)點(diǎn)度8.2，平均局部聚類系數(shù)0.742，P<0.01。見圖6。褪黑素的32個(gè)關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)共產(chǎn)生了251條邊，平均節(jié)點(diǎn)度15.7，平均局部聚類系數(shù)0.778，P<0.01。二者均具有顯著的差異。見圖7。

圖6 玉屏風(fēng)散20個(gè)關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖7 褪黑素32個(gè)關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

由Cytoscape分析得知，玉屏風(fēng)散得到19個(gè)(其中一個(gè)靶點(diǎn)未與其他靶點(diǎn)產(chǎn)生聯(lián)系)關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)的Degree、BC、CC的平均值分別為8.63、0.032、0.67，最高者分別為TP53、IL6、TP53；褪黑素的31個(gè)(其中一個(gè)靶點(diǎn)未與其他靶點(diǎn)產(chǎn)生聯(lián)系)關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)的Degree、BC、CC的平均值分別為16.19、0.017、0.70，最高者分別為TNF、STAT3、TNF。見表1～2。

表1 玉屏風(fēng)散19關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治?/p>

表2 褪黑素31關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治?/p>

2.5 玉屏風(fēng)散、褪黑素關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析 玉屏風(fēng)散、褪黑素關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，玉屏風(fēng)散涉及KEGG通路33條(P<0.05)，共分為了7類(Kappa=0.6)。見圖8～9。其中結(jié)核病(Tuberculosis)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE通路(AGE-RAGE Signaling Pathway in Diabetic Complications)、瘧疾(Malaria)、炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)等通路的基因占比位居前列；而胰腺癌(Pancreatic Cancer)、非小細(xì)胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer)、小細(xì)胞肺癌(Small Cell Lung Cancer)、慢性粒細(xì)胞性白血病(Chronic Myeloid Leukemia)等是其相對于褪黑素所獨(dú)有的通路。褪黑素關(guān)鍵免疫靶點(diǎn)的KEGG通路61條(P<0.05)，共分為了11類(Kappa=0.4)。見圖10～11。其中沙門氏菌感染(Salmonella Infection)、結(jié)核病(Tuberculosis)、南美錐蟲病(美洲錐蟲病)(Chagas Disease，American Trypanosomiasis)、炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)等通路的基因占比位居前列；而沙門氏菌感染(Salmonella Infection)、南美錐蟲病(美洲錐蟲病)(Chagas Disease，American Trypanosomiasis)、Th17細(xì)胞分化(Th17 Cell Differentiation)、乙型肝炎(Hepatitis B)等則是其相對于玉屏風(fēng)散而言特有的通路。

圖8 玉屏風(fēng)散KEGG通路富集的通路及分類

圖9 玉屏風(fēng)散KEGG通路富集的分類

圖10 褪黑素KEGG通路富集的通路

圖11 褪黑素KEGG通路富集的分類

2.6 不同氣溫、藥物干預(yù)后對小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α的影響 在氣溫驟升和驟降條件下，玉屏風(fēng)散組、玉屏風(fēng)散+褪黑素組血清IL-6上升，褪黑素組血清IL-6含量下降，但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在常溫、氣溫驟升、氣溫驟降條件下，玉屏風(fēng)散組、玉屏風(fēng)散+褪黑素組可以使血清IL-1β升高，褪黑素組則顯示IL-1β含量下降，而且其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；在常溫條件下，與對照組比較，玉屏風(fēng)散組、褪黑素組、玉屏風(fēng)散+褪黑素組血清TNF-α均下降，其中褪黑素組下降最為明顯，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；氣溫驟降條件下，玉屏風(fēng)散組、玉屏風(fēng)散+褪黑素組小鼠血清TNF-α上升，但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。氣溫驟升條件下，玉屏風(fēng)散組血清TNF-α上升，玉屏風(fēng)散+褪黑素組小鼠血清TNF-α下降，與對照組比較，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在氣溫驟升時(shí)，褪黑素組小鼠血清TNF-α下降明顯，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

3 討論

免疫系統(tǒng)是人體維持內(nèi)環(huán)境平衡與應(yīng)對外界刺激的重要組分之一，當(dāng)免疫系統(tǒng)在內(nèi)因或外因的作用下失去平衡時(shí)，相關(guān)疾病將涉及感染、自身免疫性疾病、腫瘤、其他免疫異常、繼發(fā)的其他系統(tǒng)紊亂等問題[8-13]。玉屏風(fēng)散和褪黑素調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能已被大量的臨床和實(shí)驗(yàn)室研究所證實(shí)，但二者均涉及復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這也為二者在臨床不同情境下的取舍，乃至聯(lián)合應(yīng)用帶來了相當(dāng)多的困難[14-18]。

相對于玉屏風(fēng)散而言，褪黑素的相關(guān)研究主要集中在國外，這些研究的起步更早，數(shù)量也更多，這意味著我們所知的相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也更為復(fù)雜[19]。故本研究中，在同一網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)檢索參數(shù)的條件下，檢索到的褪黑素相關(guān)通路和靶點(diǎn)遠(yuǎn)多于玉屏風(fēng)散的重要原因。此外，褪黑素相關(guān)靶點(diǎn)、通路的多元性，一方面意味著它具有更廣泛的潛在臨床使用價(jià)值，另一方面，也意味著在使用它治療特定的疾病如哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化時(shí)，可能產(chǎn)生更多的不良反應(yīng)，任何炎癥都可能是它的禁忌證[20-23]。

表3 不同氣溫、藥物干預(yù)后小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量

相對于褪黑素而言，玉屏風(fēng)散作用機(jī)制的理解則有其特殊的麻煩。因?yàn)閷τ谟衿溜L(fēng)散這樣的中藥復(fù)方而言，相當(dāng)多的研究都是按照“臨床發(fā)現(xiàn)療效→動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床試驗(yàn)的指標(biāo)觀察→相應(yīng)分子機(jī)制的研究”的順序進(jìn)行的，其復(fù)方內(nèi)部的邏輯關(guān)系并不清晰。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一能夠快速、系統(tǒng)地檢索藥物作用的靶點(diǎn)、相關(guān)通路，并進(jìn)行系統(tǒng)分析的方法，為理清上述機(jī)制開辟了一條可行的科研思路。

綜上所述，玉屏風(fēng)散和褪黑素均可通過復(fù)雜的通路及靶點(diǎn)調(diào)控免疫系統(tǒng)的運(yùn)行，二者針對的通路較為一致，而靶點(diǎn)卻不同。玉屏風(fēng)散在常溫和氣溫驟降時(shí)對IL-1β表現(xiàn)出促炎作用，而褪黑素則在常溫和氣溫驟升時(shí)對TNF-α表現(xiàn)出抗炎作用。本研究提示了氣溫變化對免疫干預(yù)的影響的可能性；結(jié)合文獻(xiàn)檢索、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和中醫(yī)理論，建議在氣溫驟變時(shí)，對免疫功能低下的人群，可以應(yīng)用玉屏風(fēng)散聯(lián)合褪黑素預(yù)防疾病的發(fā)生。此外，考慮到玉屏風(fēng)散和褪黑素在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中檢索到的免疫通路較為一致，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻表明它們對IL-1β和TNF-α的調(diào)節(jié)不同，建議各網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫，可以考慮在從一手文獻(xiàn)中提取資料時(shí)，不僅提取有效成分、靶點(diǎn)、通路之間的相關(guān)關(guān)系，而且同時(shí)保留這種關(guān)系的作用方向(正調(diào)控、負(fù)調(diào)控、雙向調(diào)控等)，以便為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析提供更精確的支持。