李中源 曾忠秀 李夢(mèng)霜 姜夢(mèng)柯 楊林美 杜 欣 李淑英

（玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南玉溪 653100）

無(wú)花果（Ficus carica Linn.）又名奶漿果、映日果、蜜果等，為桑科榕屬落葉灌木或小喬木，現(xiàn)全國(guó)各地均有栽培，新疆南部尤多[1]。無(wú)花果具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和食用價(jià)值，可作食用，亦可作藥用[2-3]。植物內(nèi)生菌因具有作為新型抗菌藥物篩選源的巨大潛力而備受關(guān)注，關(guān)于內(nèi)生菌的研究也成為近年來(lái)的熱點(diǎn)。內(nèi)生細(xì)菌在與宿主長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中，逐漸形成了對(duì)抗、互惠等多種關(guān)系，能夠直接或間接調(diào)節(jié)宿主的生長(zhǎng)發(fā)育、協(xié)助宿主抵抗病蟲(chóng)害及環(huán)境脅迫等。內(nèi)生細(xì)菌在與宿主互作的過(guò)程中能夠產(chǎn)生豐富多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，逐漸成為新型天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)研究的資源庫(kù)。近年來(lái)，內(nèi)生細(xì)菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物廣泛應(yīng)用于新藥研發(fā)、生物防治等領(lǐng)域，展現(xiàn)出巨大的研究與開(kāi)發(fā)價(jià)值[4-5]。

本試驗(yàn)從無(wú)花果汁中分離出內(nèi)生細(xì)菌19株，用金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、變形桿菌（Proteus vulgaris）采用平板對(duì)峙法篩選到4株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌，活性檢測(cè)后選擇活性最強(qiáng)的2株觀察其形態(tài)，研究生長(zhǎng)條件及Cr6+對(duì)其生長(zhǎng)的影響，以期為無(wú)花果活性?xún)?nèi)生細(xì)菌的深入開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為無(wú)花果（Ficus carica Linn.），于超市購(gòu)買(mǎi)。

供試菌種為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），于湖北省工業(yè)微生物菌種保藏與研究中心購(gòu)買(mǎi)；大腸桿菌（Escherichia coli）和變形桿菌（Proteus vulgaris），為我校微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

供試培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL；發(fā)酵培養(yǎng)基配方為黃豆粉10g，甘露醇10g，蒸餾水1000mL，pH值7.0～7.5。2種培養(yǎng)基均于121℃條件下滅菌30 min備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)花果內(nèi)生細(xì)菌的分離及純化。取新鮮無(wú)花果用無(wú)菌水沖洗后用75%乙醇浸泡2 min，然后用無(wú)菌水沖洗3次，再用3%NaClO浸泡3 min，之后用無(wú)菌水沖洗3次。沖洗消毒后的無(wú)花果用無(wú)菌刀切為小塊后轉(zhuǎn)入研缽，加100 mL無(wú)菌水與滅菌石英砂充分研磨。取0.5 mL菌液加入有4.5 mL無(wú)菌水的試管中，稀釋10倍，吹打均勻。同樣方法制成稀釋1 000倍的菌懸液，靜置15 min。取這兩種菌懸液的上清液各0.5 mL涂布LB平板，每個(gè)濃度涂3個(gè)LB平板，35℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，挑選生長(zhǎng)良好的單菌落純化2～3次保存于4℃冰箱備用。同時(shí)，將最后一遍沖洗無(wú)花果的無(wú)菌水涂布于LB培養(yǎng)基上作對(duì)照，35℃培養(yǎng)24～48 h。

1.2.2 無(wú)花果活性?xún)?nèi)生細(xì)菌的篩選。用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變形桿菌和分離純化得到的內(nèi)生細(xì)菌于LB固體培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn)（平板對(duì)峙法），于35℃下培養(yǎng)24～48 h后觀察抑菌線(xiàn)，篩選出活性?xún)?nèi)生細(xì)菌。

1.2.3 活性?xún)?nèi)生細(xì)菌細(xì)胞DAN提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序。采用改良的CTAB法[6-7]提取DNA，經(jīng)電泳檢測(cè)后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

（1）PCR 擴(kuò)增。 采用 30 μL 體系：提取所得 DNA 1 μL、前引物和后引物各 1 μL（細(xì)菌通用引物：前引物 27F5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和后引物1525R5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）、Taq 酶5.5 μL（Ex Taq 0.1 μL、10×Ex Taq Buffer 3 μL、dNTP mixture 2.4 μL）。

擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性 4 min，94℃變性 30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，33個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

（2）堿基序列測(cè)序。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行堿基測(cè)序，將測(cè)序得到的16S rDNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行同源性比較。

1.2.4 活性?xún)?nèi)生細(xì)菌革蘭氏染色及芽孢染色。革蘭氏染色及芽孢染色參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行?；钚?xún)?nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)至24 h進(jìn)行革蘭氏染色；培養(yǎng)至16 h開(kāi)始進(jìn)行芽孢染色[9]，時(shí)間間隔為2 h，培養(yǎng)至24 h后每隔0.5 h進(jìn)行一次芽孢染色，最初出現(xiàn)芽孢的時(shí)間即為產(chǎn)芽孢時(shí)間。

1.2.5 無(wú)花果活性?xún)?nèi)生細(xì)菌活性檢測(cè)。采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法來(lái)檢測(cè)內(nèi)生菌抑菌效果，取活化的3株檢測(cè)指示菌分別制成菌懸液（5 mL無(wú)菌水洗脫3次），分別取0.5 mL傾注法接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)24 h；篩選出的內(nèi)生細(xì)菌分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃恒溫120 r/min搖床培養(yǎng)48 h，取發(fā)酵培養(yǎng)液置于無(wú)菌離心管中，在轉(zhuǎn)速4 000 r/min下離心30 min，得到無(wú)細(xì)胞上清液；將接種了檢測(cè)指示菌的平板等分為3份，用口徑與牛津杯接近的打孔器在培養(yǎng)基上打孔后放入無(wú)菌牛津杯中，加無(wú)細(xì)胞上清液20 μL于牛津杯中，37℃培養(yǎng)48 h后測(cè)量其抑菌圈大小。

1.2.6 無(wú)花果活性?xún)?nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)條件優(yōu)化。將2株有活性的無(wú)花果內(nèi)生細(xì)菌斜面轉(zhuǎn)接2～3次，35℃下培養(yǎng)24 h備用；用5 mL無(wú)菌水洗脫斜面，重復(fù)3次，轉(zhuǎn)入無(wú)菌試管中備用?；罨N及制備菌懸液后測(cè)定培養(yǎng)時(shí)間、初始pH值、溫度和重金屬離子（Cr6+）對(duì)活性?xún)?nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。

（1）培養(yǎng)時(shí)間對(duì)2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。取LB液體培養(yǎng)基100 mL，加入1 mL菌懸液，每株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌設(shè)3個(gè)平行，置于35℃、轉(zhuǎn)速120 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)，選用光電比濁法[8]制作細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)。培養(yǎng)過(guò)程（96 h）中每隔12 h取樣1次，于可見(jiàn)分光光度計(jì)600 nm下測(cè)其吸光度，繪制2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

（2）初始pH值對(duì)2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。將LB液體培養(yǎng)基pH值分別調(diào)節(jié)為5、6、7、8，每種pH值分別接入不同菌株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌，100 mL培養(yǎng)基接入1 mL菌懸液，不同菌株各pH值均設(shè)3個(gè)平行，置于35℃、轉(zhuǎn)速120 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，于可見(jiàn)分光光度計(jì)600 nm下測(cè)其吸光度。

（3）溫度對(duì)2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。取LB液體培養(yǎng)基，分別加入不同菌株菌懸液，100 mL培養(yǎng)基加 1 mL菌懸液，分別置于 16、30、37、45℃，轉(zhuǎn)速120 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，不同菌株同一溫度下各設(shè)3個(gè)平行，于可見(jiàn)分光光度計(jì)600 nm下測(cè)其吸光度。

（4）重金屬離子（Cr6+）對(duì)2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。取LB液體培養(yǎng)基配成Cr6+濃度分別為5、10、20、40、60、80 mg/L 的培養(yǎng)基，100 mL 培養(yǎng)基接入1 mL菌懸液，不同菌株同一Cr6+濃度各設(shè)3個(gè)平行，置于35℃、轉(zhuǎn)速120 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，于可見(jiàn)分光光度計(jì)600 nm下測(cè)其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)花果活性?xún)?nèi)生細(xì)菌篩選結(jié)果及其形態(tài)學(xué)特征

根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、濕潤(rùn)度等特征從無(wú)花果汁中分離得到19株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和變形桿菌篩選后得到2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌，編號(hào)分別為3251、3252。其中：3251單菌落為圓形，表面潤(rùn)滑，菌落隆起，呈乳白色不透明狀；3252單菌落為圓形，表面潤(rùn)滑，菌落隆起，呈淡黃色不透明狀。二者均為典型的細(xì)菌菌落特征。革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)，2株內(nèi)生菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀。

2.2 無(wú)花果活性?xún)?nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列測(cè)定及同源性比對(duì)結(jié)果

2株無(wú)花果活性?xún)?nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列片段大小均為1 500 bp左右（圖1），獲得序列號(hào)分別為KJ499776和KJ499777，經(jīng)過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，二者均為芽孢桿菌屬細(xì)菌，16S rDNA同源性比對(duì)結(jié)果如表1所示。經(jīng)過(guò)生理生化特征試驗(yàn)，依據(jù)芽孢桿菌命名規(guī)則，分別命名為Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252。

表1 16S rDNA同源性比對(duì)結(jié)果

2.3 無(wú)花果活性?xún)?nèi)生細(xì)菌芽孢染色結(jié)果

芽孢染色發(fā)現(xiàn)，Bacillus WHG3251芽孢形成時(shí)間為25 h，Bacillus WHG3252芽孢形成時(shí)間為26 h。譚麗雪等[9]研究發(fā)現(xiàn)，1株簡(jiǎn)單芽孢桿菌芽孢形成時(shí)間為16 h，1株枯草芽孢桿菌芽孢形成時(shí)間為43 h。很多因素都會(huì)影響芽孢形成，比如營(yíng)養(yǎng)缺乏、高濃度礦物元素、高細(xì)胞密度和輻射等都可引發(fā)營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞的分化并形成芽孢。對(duì)特定的微生物而言，需要探索其合適的條件控制其芽孢的形成。本試驗(yàn)2株來(lái)自無(wú)花果汁的芽孢桿菌產(chǎn)芽孢時(shí)間有一定差異，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

2.4 無(wú)花果活性?xún)?nèi)生細(xì)菌活性成分檢測(cè)結(jié)果

由表2可知，從無(wú)花果汁中分離篩選到的2株內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)過(guò)48 h發(fā)酵培養(yǎng)后都能產(chǎn)生活性物質(zhì)，確定2株芽孢桿菌是有活性的內(nèi)生細(xì)菌。根據(jù)抑菌圈直徑大小，Bacillus WHG3251對(duì)3株檢測(cè)菌種的抑菌效果明顯強(qiáng)于Bacillus WHG3252。說(shuō)明無(wú)花果汁內(nèi)存在可產(chǎn)生豐富多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物的活性?xún)?nèi)生細(xì)菌，可考慮作為新型天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)研究的菌種來(lái)源，為新藥研發(fā)提供依據(jù)，本試驗(yàn)篩選到的Bacillus WHG3251更具有藥物開(kāi)發(fā)價(jià)值。

表2 無(wú)花果活性菌株發(fā)酵液活性成分抑菌效果 單位：cm

2.5 培養(yǎng)條件對(duì)無(wú)花果活性?xún)?nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

2.5.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響。如圖2所示，2株無(wú)花果活性?xún)?nèi)生細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，并且生長(zhǎng)變化有一定差異。其中：Bacillus WHG3251在0～60 h生長(zhǎng)緩慢，表現(xiàn)為生長(zhǎng)環(huán)境適應(yīng)調(diào)整期，60 h后增長(zhǎng)迅速，96 h時(shí)生長(zhǎng)達(dá)到較高水平；Bacillus WHG3252對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)、衰亡時(shí)間較早，72 h后生長(zhǎng)迅速，84 h時(shí)達(dá)到生長(zhǎng)最高水平，96 h時(shí)已經(jīng)進(jìn)入衰亡狀態(tài)。細(xì)菌生長(zhǎng)與細(xì)菌類(lèi)型有關(guān)[10-11]，同時(shí)受生長(zhǎng)環(huán)境的影響。盡管細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)沒(méi)有明顯的衰亡期，但這并不影響生長(zhǎng)曲線(xiàn)的趨勢(shì)以及對(duì)菌株對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的判斷[12]。

2.5.2 pH值對(duì)2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。培養(yǎng)基初始pH值是影響細(xì)菌生長(zhǎng)及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素，不同細(xì)菌適宜初始pH值有差異。研究發(fā)現(xiàn)，大部分植物內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)最適pH值為7.0[13-14]。陳正培等[15]從百香果果漿中分離得到的3株內(nèi)生細(xì)菌最適pH值均為5.5，認(rèn)為與它們的存在環(huán)境有關(guān)。由圖3可知：初始pH值分別為7和6時(shí)，Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252這2株無(wú)花果內(nèi)生細(xì)菌菌液吸光度最高，生長(zhǎng)最旺盛；而pH值為8時(shí)，2株內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)受到明顯影響。說(shuō)明Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252這2株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)堿性環(huán)境比較敏感，弱酸條件也不利于其生長(zhǎng)，初始pH值分別以7和6最利于其生長(zhǎng)。

2.5.3 培養(yǎng)溫度對(duì)2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響顯著，培養(yǎng)溫度通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)酶活力和細(xì)胞膜的通透性進(jìn)而影響細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。由圖4可知：Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252這2株無(wú)花果內(nèi)生細(xì)菌在30℃時(shí)生長(zhǎng)較好，說(shuō)明2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌屬于中溫型細(xì)菌；隨著培養(yǎng)溫度升高（37℃和45℃），2株無(wú)花果內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)受到一定影響，溫度越高影響程度越大；低溫（16℃）條件下，無(wú)花果內(nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)較緩慢。

2.5.4 重金屬離子（Cr6+）對(duì)2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。微生物能吸收和轉(zhuǎn)化重金屬及其化合物，但是當(dāng)環(huán)境中重金屬濃度增加到一定程度時(shí)，就會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)代謝作用甚至引起微生物死亡[16]。研究者一般認(rèn)為，微生物抗金屬的機(jī)制主要有生物吸附、胞外沉淀、生物轉(zhuǎn)化、生物累積和外排作用[17]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多微生物對(duì)金屬鉻尤其對(duì)六價(jià)鉻有抗性，其中有些微生物可以把鉻從高毒的六價(jià)還原成低毒的三價(jià)，具有巨大的應(yīng)用潛力[18]。由圖5可以看出：培養(yǎng)基Cr6+濃度為10 mg/L時(shí)，對(duì)Bacillus WHG3251、Bacillus WHG3252的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，且對(duì)Bacillus WHG3252的促進(jìn)作用較明顯；當(dāng)Cr6+濃度超過(guò)20 mg/L時(shí)，對(duì)2株無(wú)花果內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)都有抑制作用，高濃度Cr6+條件下2株無(wú)花果活性?xún)?nèi)生細(xì)菌有微弱生長(zhǎng)。重金屬促進(jìn)微生物生長(zhǎng)的能力稱(chēng)為毒物興奮效應(yīng)[19]。鉻誘導(dǎo)可使SOD等含量顯著增加，提高活性?xún)?nèi)生細(xì)菌抗氧化能力，降低鉻脅迫導(dǎo)致的活性氧傷害[20]，因而一定濃度的重金屬離子處理會(huì)表現(xiàn)出對(duì)活性?xún)?nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從無(wú)花果汁中篩選到2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌，通過(guò)提取DNA和PCR擴(kuò)增后堿基測(cè)序、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌均為芽孢桿菌屬細(xì)菌；經(jīng)生理生化驗(yàn)證后，將2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌分別命名為Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252；芽孢染色后發(fā)現(xiàn)，Bacillus WHG3251芽孢形成時(shí)間為25 h，Bacillus WHG3252芽孢形成時(shí)間為 26 h；革蘭氏染色結(jié)果表明，2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀；發(fā)酵培養(yǎng)后，2株無(wú)花果活性?xún)?nèi)生細(xì)菌均有活性物質(zhì)產(chǎn)生，可作為新藥物開(kāi)發(fā)研究的資源庫(kù)，其中Bacillus WHG3251產(chǎn)生的活性物質(zhì)的抑菌效果強(qiáng)于Bacillus WHG3252。對(duì)2株無(wú)花果活性?xún)?nèi)生細(xì)菌進(jìn)行生長(zhǎng)條件優(yōu)化研究發(fā)現(xiàn)：2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)間有一定差異，Bacillus WHG3251在96 h時(shí)生長(zhǎng)達(dá)到較高水平，Bacillus WHG3252在84h達(dá)到最高水平、96 h時(shí)已經(jīng)進(jìn)入衰亡期；Bacillus WHG3251和Bacillus WHG3252這2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)最適pH值分別為7和6；2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌均為中溫菌，最適生長(zhǎng)溫度為30℃；重金屬離子（Cr6+）對(duì)2株活性?xún)?nèi)生細(xì)菌生長(zhǎng)的影響較明顯，Cr6+濃度為10 mg/L時(shí)對(duì)其生長(zhǎng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的促進(jìn)作用，Cr6+濃度大于20 mg/L時(shí)表現(xiàn)為抑制作用。