麥曉勇，蔣 魁，洪敏娜，劉曦瑤，楊 鏗，文國樑

(1.廣州市欣海利生生物科技有限公司，廣東 廣州 510300；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東 廣州 510300)

近年來，牛蛙已成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖重要的名特水產(chǎn)品之一。在我國廣東、廣西、江西、湖南、浙江等地區(qū)均有較大規(guī)模養(yǎng)殖，養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年遞增，牛蛙年產(chǎn)量已超60 萬噸。目前牛蛙養(yǎng)殖比較混亂，沒有集成一套科學(xué)、無污染、可持續(xù)的養(yǎng)殖技術(shù)，且部分養(yǎng)殖戶大量使用抗生素，造成食品安全問題。丁酸梭菌已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中，但在牛蛙養(yǎng)殖中還未見報道。筆者將丁酸梭菌應(yīng)用于拌料投喂牛蛙，旨在探究丁酸梭菌對牛蛙腸道結(jié)構(gòu)及菌群的影響。

一、材料與方法

1.材料

丁酸梭菌菌種來自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，丁酸梭菌菌劑產(chǎn)品由廣州市欣海利生生物科技有限公司提供，產(chǎn)品為發(fā)酵原液直接灌裝的液體菌劑，丁酸梭菌菌量≥8×108CFU/毫升。

2.試驗方法

在廣東省汕頭市澄海區(qū)牛蛙養(yǎng)殖場，選取A、B、C 組牛蛙養(yǎng)殖戶3 個同批次四腳小牛蛙苗進行試驗。

A 組：進四腳小牛蛙后，定期使用丁酸梭菌，每瓶500毫升拌料40千克，飼喂3天后停3天菌劑拌料，以此為1個周期。

B 組：進四腳小牛蛙后，不定期使用丁酸梭菌拌料投喂，察覺到牛蛙腸道較差而使用35天。

C 組：進四腳小牛蛙后，全程不使用丁酸梭菌。

3.檢測與分析

(1)腸道組織上皮細胞切片分析。試驗第90天，餐后1小時，在健康牛蛙飽食狀態(tài)下隨機網(wǎng)捕牛蛙。每口池隨機取5只牛蛙解剖觀察腸道、肝臟等。再取其腸道，置于10 毫升4%多聚甲醛中保存。取腸道組織上皮細胞，由武漢塞維爾生物科技有限公司進行組織切片分析。

(2)牛蛙腸道菌群結(jié)構(gòu)分析。試驗第90天，餐后1 小時，在健康牛蛙飽食狀態(tài)下隨機網(wǎng)捕牛蛙。每口池隨機取5 只牛蛙，再取其腸道置于10 毫升菌群測序保存液中保存，進行牛蛙腸道細菌群落結(jié)構(gòu)分析。選擇16S rDNA 的V4 區(qū)為擴增區(qū)間，擴增引物為515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCT AAT-3')，由明科生物技術(shù)(杭州)有限公司使用Illumina MiSeq 平臺進行高通量測序分析。

二、結(jié)果

1.牛蛙個體大小及解剖腸道觀察

試驗90 天后結(jié)果顯示，定期使用丁酸梭菌拌料投喂的A組牛蛙個體顯著比不定期使用的B組和未使用的C組大，且其肝臟紅潤，腸道更粗(圖1)。

圖1 牛蛙解剖腸道觀察

2.丁酸梭菌對腸道結(jié)構(gòu)的影響

試驗90 天后，使用顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，定期使用丁酸梭菌拌料投喂的A組牛蛙的腸道壁厚度比不定期使用的B組和未使用的C組明顯增厚，腸黏膜更多；而不定期使用的B組牛蛙腸道比C組腸黏膜更多，腸道壁更厚；C組牛蛙腸道壁薄，內(nèi)腸道黏膜很少(圖2)。

圖2 牛蛙腸道切片對比

3.丁酸梭菌對牛蛙腸道菌群的影響

試驗結(jié)果顯示，定期使用丁酸梭菌的A組牛蛙腸道菌群各菌所占比例分布均勻，且有益菌梭狀芽孢桿菌高達24.8%，高于B 組的8.40%和C 組的1.8%；而A 組變形菌門所占比例為17.77%，低于B組的46.70%和C組的71.35%。

三、討論

傳統(tǒng)的高密度養(yǎng)殖牛蛙模式，牛蛙每畝產(chǎn)量高達3萬千克，由于密度高、投料量大，養(yǎng)殖過程中經(jīng)常出現(xiàn)腸道問題，養(yǎng)殖戶通常使用抗生素處理腸炎，對食品安全帶來很大的隱患。為了牛蛙養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展，養(yǎng)殖戶必須改變觀念，合理控制養(yǎng)殖密度，定時使用有益菌調(diào)理腸道，預(yù)防腸道疾病，保證食品安全。

牛蛙作為一種特種養(yǎng)殖品類，多數(shù)人在研究高密度養(yǎng)殖技術(shù)及病害的防治(如愛德華氏菌病、白內(nèi)障病、溫和氣單胞菌病和嗜水氣單胞菌病等)。丁酸梭菌作為腸道內(nèi)定植能力強的有益菌，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖中，能夠有效地提高雞、仔豬、對蝦等的生長速率，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高腸道消化吸收能力。本文通過定期使用丁酸梭菌拌牛蛙飼料投喂發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌能顯著提高牛蛙的生長速率，增厚腸道壁，有效提升腸道內(nèi)有益菌群的比例。

四、小結(jié)

丁酸梭菌應(yīng)用于牛蛙養(yǎng)殖，通過定期拌料、飼喂3天停3天的方法，可在牛蛙腸道內(nèi)形成有益菌優(yōu)勢，改善腸道結(jié)構(gòu)，提高牛蛙生長速率和養(yǎng)殖成功率。