傅純潔，葛紅星，趙士力，李前方

(1.東?？h水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 東海 222300；2.江蘇海洋大學(xué)，江蘇 連云港 222005；3.東?？h黃川鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)站，江蘇 東海 222322；4.江蘇瑞沃農(nóng)業(yè)發(fā)展集團(tuán)有限公司，江蘇 連云港 222300)

目前的研究已經(jīng)證實(shí)，維生素、中草藥制劑能提高水產(chǎn)動物的免疫能力，但在克氏原螯蝦方面的研究相對較少。本研究通過篩選可能具有免疫強(qiáng)化性能的中草藥作為免疫增強(qiáng)劑，評估其不同添加比例對克氏原螯蝦非特異性免疫和生長性能的影響，以期篩選適宜克氏原螯蝦用免疫增強(qiáng)劑。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)材料

蝦苗在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)1周后選取健康、肢體健全、平均規(guī)格為(5.5±2)克/只的克氏原螯蝦開始試驗(yàn)。

2.試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)將維生素C、維生素E按1∶1的比例混合成維生素制劑后以0.01%、0.02%、0.04%的濃度，選取甘草、金銀花、黃芪為試驗(yàn)原料，按1∶1∶1的比例混合成中草藥制劑后以1%、2%、4%的濃度添加至飼料中(N1、N2、N3、N4、N5、N6)，并設(shè)置對照組N0，每個處理3個平行。試驗(yàn)分組以及兩種免疫增強(qiáng)劑添加濃度見表1。飼料配方參考徐維娜等(2011)，主要成分為1.50%的磷酸二氫鈣、0.30%的氯化膽堿、14.70%的玉米粉、20.00%的魚粉、40.00%的黃豆粉、2.00%的魚油，按照添加制劑的濃度不同添加21.50%、21.49%、21.48%、21.46%、20.50%、19.50%、17.50%的小麥粉。

表1 各組飼料成分 %

3.試驗(yàn)管理

試驗(yàn)場地選擇21 個1 米2的水池，在每個水池中放500 克的水草。每個水池中放入3 個氣石充氧，保證溶氧充足。每個水池中放入20 只蝦，分別投喂經(jīng)不同處理的飼料，日投喂量為克氏原螯蝦體重的5%左右，每天投喂3 次，飼養(yǎng)40 天。水池的水位保持在15～20 厘米，確保在試驗(yàn)期間溶氧≥6.0 毫克/升、pH (7.5±1.5)、氨氮＜0.5 毫克/升。試驗(yàn)水溫為自然水溫，溫度保持10～20℃。每天觀察蝦死亡情況，及時(shí)撈出死蝦并進(jìn)行數(shù)量記錄，同時(shí)檢查死亡原因。

4.生長指標(biāo)測定

選取增重率、特定生長率、存活率和飼料系數(shù)4個指標(biāo)用以評估生長性能，計(jì)算公式為：

增重率(%)＝(Wt-W0)/W0×100；

特定生長率(%/天)＝(lnWt-lnW0)/t×100；

存活率(%)＝X1/X0×100；

飼料系數(shù)＝F/(W1-W0)；

式中：W0為小龍蝦平均初始體質(zhì)量(克)，Wt為小龍蝦的平均最終體質(zhì)量(克)，t 為養(yǎng)殖天數(shù)，F(xiàn)表示投餌量(克)，X1為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)克氏原螯蝦的成活數(shù)量，X0為試驗(yàn)開始時(shí)克氏原螯蝦的初始數(shù)量。飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束，試驗(yàn)蝦饑餓8小時(shí)后稱重。

采用Excel 和SPSS Statistics 26 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。單因子方差分析(one-way ANOVA)分析差異，P＜0.05作為差異顯著水平。

5.非特異性免疫指標(biāo)測定

試驗(yàn)結(jié)束后，從每個試驗(yàn)組中抽取3只克氏原螯蝦用于樣本的收集。用無菌注射器從蝦體圍心腔中取血，得到的血清用于堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)等測定。酶活采用南京建成生物研究所試劑盒進(jìn)行測定，具體操作按說明書進(jìn)行。

二、結(jié)果

1.飼料中添加不同免疫增強(qiáng)劑對克氏原螯蝦生長情況和餌料系數(shù)的影響

使用不同的飼料投喂40 天，克氏原螯蝦的生長情況見表2。各組特定生長率與對照組沒有顯著差異(P＞0.05)。N1、N3、N4組增重率與對照組有顯著 差 異(P＜0.05)， 其 中N3組 增 重 率 僅 為432.14%，相較其他各組增重率最低，N1、N4組的增重率分別為546.34%、552.62%，明顯高于對照組N0(P＜0.05)。同時(shí)存活率中N1、N4組與對照組差異顯著，N4組存活率在試驗(yàn)各組中最高，達(dá)到95.00%，而N6組存活率最低，僅為73.33%。試驗(yàn)各組的飼料系數(shù)均顯著低于對照組N0(P＜0.05)，其中N4組的飼料系數(shù)最低，為2.22。

表2 兩種免疫增強(qiáng)劑對克氏原螯蝦生長情況和餌料系數(shù)的影響

綜合試驗(yàn)各組的生長情況，隨著兩種免疫增強(qiáng)劑的添加濃度上升，存活率都呈下降趨勢，N1、N4為同種添加制劑中存活率最高組別，同時(shí)兩種免疫增強(qiáng)劑添加濃度達(dá)最大時(shí)，存活率均小于對照組。對于增重率、特定生長率兩項(xiàng)生長指標(biāo)，隨添加濃度的上升，呈下降趨勢。

2.飼料中添加不同免疫增強(qiáng)劑對克氏原螯蝦SOD、AKP和ACP酶活性的影響

飼料中添加不同免疫增強(qiáng)劑對克氏原螯蝦SOD、AKP 和ACP 酶活性的影響如圖1～圖3 所示，其中SOD 酶活性N1組最高、N6組最低，且N1組顯著高于N0組(P＜0.05)。在維生素制劑添加中N1組SOD酶活性最高，且高于中草藥制劑組中活性最高的N5組；N1、N2、N3組隨著維生素制劑添加濃度提高，SOD酶活性呈下降趨勢，而添加中草藥制劑的N4、N5、N6組則呈現(xiàn)先升高、再下降的趨勢。試驗(yàn)各組AKP酶活性均隨著兩種免疫增強(qiáng)劑濃度的提高而上升，其中N6組AKP 酶活性最高，N4組活性最低，且試驗(yàn)各組均與N0組有顯著性差異(P＜0.05)。而ACP 酶活性中N6組最高、N4組最低。N1、N2、N3組隨著維生素制劑添加濃度提高，ACP 酶活性呈現(xiàn)先升高、再下降的趨勢，而N4、N5、N6組則隨著中草藥制劑添加濃度的提高而呈上升趨勢。其 中ACP 酶活性中N6組≈N2組，且 顯 著高于N0組(P＜0.05)。

圖1 兩種免疫增強(qiáng)劑對克氏原螯蝦SOD酶活性的影響

圖2 兩種免疫增強(qiáng)劑對克氏原螯蝦AKP酶活性的影響

圖3 兩種免疫增強(qiáng)劑對克氏原螯蝦ACP酶活性的影響

三、討論

在飼料中加入維生素可以提高甲殼動物的抗應(yīng)激能力，然而筆者研究中顯示在較低濃度維生素添加時(shí)，克氏原螯蝦的存活率、增重率較高，而過多的維生素添加會產(chǎn)生負(fù)面影響。對其他水產(chǎn)動物的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象(吳桂玲等，2008)。這可能是維生素制劑中過多的維生素E 會抑制克氏原螯蝦對其他維生素如維生素A、維生素K的吸收導(dǎo)致。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加兩種免疫增強(qiáng)劑相對于對照組，克氏原螯蝦的生長發(fā)育存在差異。

克氏原螯蝦飼料中添加免疫增強(qiáng)劑的研究還較少。在本研究中，與N0組相比，添加免疫增強(qiáng)劑的飼料可提高克氏原螯蝦的生長性能和存活率。飼料中添加維生素制劑和中草藥制劑可顯著提高南美白對蝦的生長率，同時(shí)降低死亡率(Linan-Cabello 等，2015)。本試驗(yàn)中N1和N4組克氏原螯蝦的特定生長率較高，達(dá)到了4.24%和4.27%。同時(shí)本試驗(yàn)顯示，兩種免疫增強(qiáng)劑在克氏原螯蝦的生長中起重要作用，存活率的提高與免疫增強(qiáng)劑的添加有實(shí)質(zhì)性的關(guān)聯(lián)(王蕓等，2012)，可能是免疫增強(qiáng)劑提高了克氏原螯蝦的環(huán)境適應(yīng)能力，減少機(jī)體消耗，從而促進(jìn)了物質(zhì)能量的積累導(dǎo)致(Wang 等，2012)。其中N4組的克氏原螯蝦存活率達(dá)到了最高，說明添加劑量過高或過低都可能影響克氏原螯蝦的存活率。本試驗(yàn)中，隨著兩種免疫增強(qiáng)劑濃度的提高，AKP酶活性隨之上升，均在最高濃度組達(dá)到最高，而隨著維生素制劑濃度的提高，ACP酶活性呈現(xiàn)先上升、再下降的趨勢，并在0.02%添加濃度時(shí)達(dá)到最高；SOD 酶活性則在0.01%濃度的維生素制劑添加中達(dá)到最大值。研究表明，在N1組，0.01%濃度的維生素添加量是克氏原螯蝦生長和免疫的最佳條件。同時(shí)這一結(jié)果也表明，在免疫力強(qiáng)的條件下，特定生長率也最高。

四、小結(jié)

本研究表明，飼料中添加兩種免疫增強(qiáng)劑能夠促進(jìn)克氏原螯蝦存活、生長，同時(shí)提高其免疫力。將克氏原螯蝦的存活率和特定生長率作為主要考慮因素，綜合考慮免疫能力，建議在本次試驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件中，選擇N1組作為免疫增強(qiáng)劑的最佳濃度，即維生素制劑添加量為0.01%。