王 旭，曹春振，楊志馨，潘 月，宋 剛,

（1.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150080）

酸菜是我國(guó)東北地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵的蔬菜制品，采用大白菜在低鹽濃度條件下，經(jīng)過乳酸發(fā)酵制成[1]。酸菜以酸香味醇、清脆爽口、清淡解膩的品質(zhì)贏得國(guó)內(nèi)外廣大消費(fèi)者的喜愛[2]。大白菜無需滅菌處理，發(fā)酵過程中的微生物種類極其復(fù)雜，所以無論是家居式還是工廠式腌制，在口感和風(fēng)味上都呈現(xiàn)出“一家一款、家家不同”的局面。傳統(tǒng)酸菜發(fā)酵過程中，乳桿菌屬（Lactobacillus）雖然占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，但變形桿菌屬（Proteus）、大腸桿菌（Escherichia coli）和沙門氏菌屬（Salmonella）等致病菌仍大量存在，食品安全存在風(fēng)險(xiǎn)[3]。

乳酸菌具有益生功能，用作發(fā)酵劑增強(qiáng)了碳水化合物降解和乳酸的生成[4]。王芮東等[5]通過高效液相色譜法，分析自然、老泡菜水和乳酸菌制劑三種方式發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化，結(jié)果表明，乳酸菌制劑發(fā)酵泡菜的有機(jī)酸總量始終高于其他兩種發(fā)酵方式。Yang 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，接種乳酸菌可以更快速地降低發(fā)酵系統(tǒng)的pH，縮短發(fā)酵時(shí)間。然而，發(fā)酵食品的風(fēng)味以及化學(xué)成分含量源自于微生物群落之間的代謝活動(dòng)[7]。Xiao 等[8]研究了四川泡菜中微生物區(qū)系與風(fēng)味的相關(guān)性，結(jié)果表明，細(xì)菌對(duì)風(fēng)味形成的貢獻(xiàn)高于真菌，而乳酸菌、明串珠菌、無色桿菌和片球菌與風(fēng)味密切相關(guān)。因此，有必要全面解析發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化，以便精確調(diào)控發(fā)酵工藝，從而形成風(fēng)味獨(dú)特且富含營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高質(zhì)量酸菜產(chǎn)品[9-10]。

目前，廣泛應(yīng)用在酸菜發(fā)酵生產(chǎn)的菌株主要包括腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）等[11-12]。不同乳酸菌具有不同的功能特性，廣泛應(yīng)用在不同的工業(yè)領(lǐng)域，開發(fā)新型發(fā)酵劑應(yīng)用在酸菜發(fā)酵中將會(huì)促進(jìn)酸菜產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）具有高效降血壓、降膽固醇，增強(qiáng)人體免疫及預(yù)防癌癥等益生保健作用[13]，在功能性食品開發(fā)的領(lǐng)域受到了越來越多的關(guān)注，但有關(guān)L.casei作為蔬菜發(fā)酵劑的研究報(bào)道較少。本研究以分離自酸菜發(fā)酵液的一種高產(chǎn)乳酸的L.caseiHDS-01[14]作為發(fā)酵劑，構(gòu)建酸菜發(fā)酵微生物生態(tài)體系，以自然發(fā)酵酸菜為對(duì)照，分析發(fā)酵過程中關(guān)鍵代謝產(chǎn)物的變化，分析乳酸代謝途徑關(guān)鍵酶活力、群體感應(yīng)基因LuxS表達(dá)以及細(xì)菌多樣性的差異。研究結(jié)果對(duì)酸菜工業(yè)化的穩(wěn)定性控制、發(fā)酵用菌種資源和功能菌的開發(fā)以及傳統(tǒng)酸菜工業(yè)菌種的選育具有重要的實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L.caseiHDS-01 分離自傳統(tǒng)酸菜發(fā)酵液，用于酸菜發(fā)酵，保藏于黑龍江大學(xué)微生物省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；白菜、食鹽 哈爾濱家得樂超市；50 L 發(fā)酵桶哈爾濱道外生活器具批發(fā)市場(chǎng)；磷酸果糖激酶（PFK）活性檢測(cè)試劑盒、丙酮酸激酶（PK）活性檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測(cè)試劑盒、食品中亞硝酸鹽測(cè)定試劑盒 蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

FE20 pH 計(jì) 梅特勒-托利多（上海）有限公司；A560 紫外可見分光光度計(jì) 上海翱藝儀器有限公司；LC20A 高效液相色譜 日本島津公司；ABI7500熒光定量PCR 儀 美國(guó)Life Technologies 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生態(tài)體系構(gòu)建 自然發(fā)酵：選取優(yōu)質(zhì)實(shí)心白菜，放置在陰涼處晾曬1～2 d 后去除壞葉，清洗干凈后整齊緊密放置于50 L 發(fā)酵罐中壓實(shí)，加入3%（w/v）的食鹽水浸泡，以1 kg 白菜加1 L 食鹽水的比例腌制，控制溫度在20～25 ℃之間，密封發(fā)酵，從第1 d起隔天取樣；人工發(fā)酵：挑取L.caseiHDS-01 單菌落，接入液體MRS 培養(yǎng)基[15]中，于37 ℃靜態(tài)培養(yǎng)18～24 h，離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌菌體并調(diào)整細(xì)胞濃度為108個(gè)/mL，即為種子液，按白菜質(zhì)量的10%（w/v）接種量接入與自然發(fā)酵相同的發(fā)酵體系，控制罐體溫度在20～25 ℃之間，從第1 d 起隔天取樣。

1.2.2 pH 及乳酸菌數(shù)測(cè)定 pH：取發(fā)酵罐中多處位置的發(fā)酵液混合均勻，用pH 計(jì)連續(xù)測(cè)定三次，取平均值作為最終結(jié)果；乳酸菌總數(shù)：平板菌落計(jì)數(shù)法，參考GB 4789.35-2016 測(cè)定[16]。

1.2.3 乳酸和總酸含量測(cè)定 乳酸：參考張慧娟等[17]的方法測(cè)定；總酸：參考GB/T 12456-2008 測(cè)定[18]。

1.2.4 乳酸代謝途徑關(guān)鍵酶活力測(cè)定 取發(fā)酵液2 mL，10000 r/min，在4 ℃下離心10 min，棄上清，收集菌體。加入2 mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌（功率200 W，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30 次），8000 ×g，于4 ℃離心10 min，取上清，置冰上待測(cè)。磷酸果糖激酶（Phosphofructo-kinase，PFK）、丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）和乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）活力測(cè)定方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 亞硝酸鹽和VC含量測(cè)定 亞硝酸鹽含量：稱取0.20 g 酸菜樣品研磨成勻漿，采用食品中亞硝酸鹽測(cè)試盒測(cè)定酸菜中亞硝酸鹽的含量，具體實(shí)驗(yàn)方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

VC含量：采用紫外分光光光度法測(cè)定[19]，準(zhǔn)確吸取VC標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.5、1.0、3.0、5.0 mL 定容至50 mL 的容量瓶中，以蒸餾水作空白試劑，在243.8 nm下測(cè)定吸光度值，以VC含量（μg）為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.0708x-0.0024，R2=0.9998。準(zhǔn)確稱取5.00 g 酸菜于研缽中，加入10 mL 體積分?jǐn)?shù)為0.01 的鹽酸，快速搗成勻漿，10000 r/min，離心10 min，取2 mL 上清液于50 mL容量瓶中，加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)為0.1 鹽酸，用蒸餾水定容。取定容后的樣液2 mL，依次加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)為0.1 的鹽酸，0.3 mL Cu（NO3）2溶液，置于70 ℃恒溫水浴13 min 后，冷卻至室溫，以蒸餾水作空白，243.8 nm 下測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出樣品中VC的含量。

式中：C 表示標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得還原型VC的含量（μg/g）；V2表示樣液定容后的體積（mL）；V1表示測(cè)定用樣液的體積（mL）；W 表示樣品重（g）。

1.2.6 酸菜感官評(píng)價(jià) 依據(jù)陳功[20]的方法并做相應(yīng)調(diào)整，對(duì)發(fā)酵第21 d 酸菜樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。邀請(qǐng)10 名感官評(píng)價(jià)員，從發(fā)酵液狀態(tài)、酸菜成品的顏色、氣味、味道和脆度這5 方面評(píng)價(jià)酸菜質(zhì)量，見表1。

表1 酸菜感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of sauerkraut

1.2.7 16S rDNA 提取與檢測(cè) 按照QIAamp DNA Mini kit（Qiagen）說明書提取酸菜發(fā)酵液細(xì)菌DNA，選擇細(xì)菌16S rDNA V3～V4 區(qū)特異性引物338F（5'-barcode+ACTCCTACGGGAG GCAGCA-3'），806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。通過Tru-Seq Nano DNA LT Library Prep Kit（Illumina）進(jìn)行建庫，利用MiSeq Reagent Kit V3（600cycles）進(jìn)行2×300 bp 的雙端測(cè)序，測(cè)序獲得的下機(jī)數(shù)據(jù)通過fastqjoin 軟件拼接，對(duì)拼接后的tag 進(jìn)行質(zhì)控和過濾，得到有效數(shù)據(jù)[21]。

1.2.8 群體感應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) 提取兩種酸菜發(fā)酵樣品不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液細(xì)菌的總RNA 進(jìn)行純度和濃度測(cè)定。分別以luxS-down 為特異性下游引物合成cDNA 第一條鏈，每組取2 μL cDNA 作為模板，與各個(gè)基因的qRT-PCR 特異引物（表2）和熒光染料混合后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系。獲得各樣品的CT 值以相對(duì)定量2-△△CT法進(jìn)行分析，以內(nèi)參基因16S rDNA 校正[22]。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)都重復(fù)3 次，運(yùn)用SPSS Statistic 26 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，SD）表示，P＜0.05代表均值間存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 與乳酸菌數(shù)的變化

pH 對(duì)發(fā)酵食品的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用，是決定發(fā)酵程度的關(guān)鍵變量。如圖1 所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，兩個(gè)發(fā)酵體系的pH 均先迅速下降后趨于平緩。人工發(fā)酵體系的pH 在發(fā)酵第3 d 就迅速下降至（3.15±0.08），而自然發(fā)酵體系的pH 則是在第7 d才下降至（3.56±0.07），且在整個(gè)發(fā)酵過程中，人工發(fā)酵酸菜的pH 始終低于自然發(fā)酵酸菜。到了發(fā)酵末期兩個(gè)體系的pH 分別為（3.46±0.07）和（3.79±0.10）。Yang 等[23]研究表明，添加乳酸菌發(fā)酵的酸菜的pH在第3 d 即可降至4 以下，而自然發(fā)酵酸菜則需要5 d，這與本研究結(jié)果類似。趙丹等[15]研究發(fā)現(xiàn)，添加乳酸菌發(fā)酵酸菜的pH 下降速率快于自然發(fā)酵，且當(dāng)發(fā)酵液的pH 達(dá)到3.5～3.8 時(shí)食用酸菜，風(fēng)味口感最佳，這與本研究結(jié)果一致。

圖1 酸菜發(fā)酵過程中pH 和乳酸菌數(shù)量的變化Fig.1 Changes in pH and lactic acid bacteria during fermentation of sauerkraut

乳酸菌數(shù)量的增加與pH 的降低直接相關(guān)，由于接種了發(fā)酵劑L.caseiHDS-01，人工發(fā)酵體系的初始乳酸菌數(shù)量（7.63±0.19）lg CFU/mL 高于自然發(fā)酵體系（2.50±0.15）lg CFU/mL。自然發(fā)酵體系中乳酸菌數(shù)量在發(fā)酵初始階段（1～7 d）呈指數(shù)上升，第7 d達(dá)到最高為（8.45±0.01）lg CFU/mL，到了發(fā)酵中期略有下降。原因是乳酸菌的大量繁殖抑制了部分不耐酸乳酸菌的生長(zhǎng)，另一方面，微生物生長(zhǎng)繁殖所需的碳源氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，使發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量逐漸減少。但無論接種與否，在發(fā)酵17 d 后，兩體系最終的乳酸菌數(shù)都達(dá)到了幾乎相似的值，但人工發(fā)酵過程中的乳酸菌數(shù)始終高于自然發(fā)酵，說明人工發(fā)酵比自然發(fā)酵更早進(jìn)入酸性環(huán)境。此外，在使用其他乳酸菌發(fā)酵酸菜樣品中也得到類似結(jié)果[4,24]。酸性環(huán)境會(huì)抑制不耐酸致病菌繁殖，促進(jìn)耐酸細(xì)菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致總酸含量增加，提高酸菜質(zhì)量安全[25]。

2.2 乳酸含量和總酸含量變化

酸味是酸菜的主體風(fēng)味，而總酸是表征酸菜酸味的理化指標(biāo)。從如圖2A 可以看出，兩個(gè)發(fā)酵體系總酸含量均隨發(fā)酵進(jìn)行呈上升趨勢(shì)，但整個(gè)發(fā)酵過程中人工發(fā)酵酸菜總酸含量始終高于自然發(fā)酵。到了發(fā)酵末期，兩體系總酸含量均達(dá)到最高值，分別為（8.45±0.38）和（6.56±0.30）g/L。各發(fā)酵系統(tǒng)中的乳酸含量變化趨勢(shì)與總酸一致，如圖2B，人工發(fā)酵酸菜的乳酸含量始終高于自然發(fā)酵，在發(fā)酵末期含量達(dá)到最高，分別為（7.88±0.38）和（4.95±0.25）g/L。發(fā)酵中期，當(dāng)酸性環(huán)境形成后，絕大部分細(xì)菌都不耐酸，因此生長(zhǎng)受到抑制。耐酸性較強(qiáng)的乳酸菌成為優(yōu)勢(shì)菌群，開始生長(zhǎng)繁殖，代謝產(chǎn)酸的同時(shí)，更穩(wěn)固了其在發(fā)酵環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)地位。馬藝熒等[26]研究有機(jī)酸在東北酸菜發(fā)酵過程中的變化，結(jié)果表明，乳酸含量隨發(fā)酵的進(jìn)行不斷增高，在發(fā)酵120 d 時(shí)達(dá)到（15.25±0.11）mg/g，與傳統(tǒng)發(fā)酵相比，篩選的乳酸菌直投發(fā)酵20 d 就達(dá)到相當(dāng)?shù)娜樗岷?，大大縮短了發(fā)酵時(shí)間。

圖2 酸菜發(fā)酵過程中總酸（A）和乳酸（B）含量的變化Fig.2 Changes in acidity (A) and lactic acid (B) content during fermentation of sauerkraut

2.3 乳酸代謝途徑關(guān)鍵酶活力變化

酸菜腌制過程中的乳酸發(fā)酵主要借助于乳酸菌來實(shí)現(xiàn)，根據(jù)代謝產(chǎn)物的不同，可以將乳酸發(fā)酵分為同型乳酸發(fā)酵和異型乳酸發(fā)酵。異型乳酸發(fā)酵的產(chǎn)物有乳酸（約50%）、乙醇和CO2[27]。而同型乳酸發(fā)酵比異型乳酸發(fā)酵的乳酸菌耐酸性強(qiáng)，在糖酵途徑經(jīng)PFK 和PK 等酶的作用下，將底物葡萄糖降解為丙酮酸，丙酮酸在LDH 的催化下還原為乳酸（可達(dá)80%），沒有乙醇和CO2生成，這一過程主要集中在酸菜發(fā)酵的中后期[28]。

本研究對(duì)同型乳酸發(fā)酵途徑中的關(guān)鍵酶PFK、PK 和LDH 進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如圖3A 所示，兩個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)中PFK 活力變化趨勢(shì)相同，均為先上升再下降最后趨于平緩，但變化速度卻不同。在人工發(fā)酵體系中，PFK 活力在發(fā)酵初期迅速上升，在第5 d 達(dá)到峰值（678.89±54.76）U/mg，而自然發(fā)酵體系中PFK 活力緩慢升高，直至第7 d 才達(dá)到峰值（275.43±34.43）U/mg。原因是接種了L.caseiHDS-01，人工發(fā)酵系統(tǒng)中乳酸菌數(shù)量遠(yuǎn)高于自然發(fā)酵，乳酸菌繁殖代謝活躍，故而PFK 活力驟升。達(dá)到峰值后，活性均迅速降低，分別在第7 d（人工發(fā)酵）和第11 d（自然發(fā)酵）后保持穩(wěn)定。原因是到了發(fā)酵中期，不耐酸的乳酸菌生長(zhǎng)受到抑制導(dǎo)致PFK 活性下降；如圖3B 和圖3C 所示，兩個(gè)發(fā)酵體系中PK 和LDH 活力與PFK 大概一致，均在1～3 d 顯著（P＜0.05）上升，第3 d 達(dá)到峰值后呈下降趨勢(shì)，最終趨于平緩。結(jié)果表明，發(fā)酵初期（1～7 d）兩體系中的三個(gè)關(guān)鍵酶活力均顯著（P＜0.05）高于發(fā)酵中期和末期，且活性峰值總是為人工發(fā)酵＞自然發(fā)酵。因此，人工發(fā)酵酸菜的乳酸含量總是高于自然發(fā)酵酸菜，這一結(jié)果再次證明，人工發(fā)酵早期就有大量乳酸生成，進(jìn)入實(shí)質(zhì)性乳酸發(fā)酵階段要早于自然發(fā)酵。

圖3 酸菜發(fā)酵過程中果糖-6-磷酸激酶活力（A）、丙酮酸激酶活力（B）和乳酸脫氫酶活力（C）的變化Fig.3 Changes of PKF activity (A),PK activity (B) and LDH activity (C) during fermentation of sauerkraut

2.4 亞硝酸鹽含量和VC 含量變化

亞硝酸鹽被認(rèn)為是食品安全評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)。如圖4 所示，在發(fā)酵前期，自然發(fā)酵酸菜中亞硝酸鹽含量迅速上升，在第7 d 達(dá)到峰值（31.88±1.60）mg/kg 后急劇下降，最終達(dá)到約（2.01±0.09）mg/kg 的穩(wěn)定值。原因是酸菜發(fā)酵體系中存在大量含有硝酸鹽還原酶的雜菌，它們把白菜組織中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。隨著乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶和形成的酸性環(huán)境（pH＜4.0）均能抑制了硝酸鹽還原菌的生長(zhǎng)[21,29]。而人工發(fā)酵體系進(jìn)入酸性環(huán)境要早于自然發(fā)酵體系，因此，整個(gè)發(fā)酵過程中亞硝酸鹽的含量也始終低于自然發(fā)酵，發(fā)酵末期為（1.55±0.86）mg/kg。結(jié)果表明，L.caseiHDS-01 能抑制亞硝酸鹽的產(chǎn)生，提高了酸菜在發(fā)酵期間的安全性。

圖4 酸菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量和VC 含量的變化Fig.4 Changes in nitrite and VC content during fermentation of sauerkraut

VC含量隨著發(fā)酵進(jìn)行呈下降趨勢(shì)，且人工發(fā)酵中VC含量一直高于自然發(fā)酵，這與Du 等[11]研究結(jié)果一致。因?yàn)閂C是一種己糖醛基酸，能穩(wěn)定地保存于酸性環(huán)境[6]。人工發(fā)酵酸菜中L.caseiHDS-01 大量生長(zhǎng)繁殖，代謝產(chǎn)酸，快速形成了酸性環(huán)境，減少VC的降解，到了發(fā)酵末期含量為（445.02±10.53）mg/kg。自然發(fā)酵初期，微生物種類繁多且乳酸菌不是優(yōu)勢(shì)菌群，各類細(xì)菌大量生長(zhǎng)繁殖，大量利用VC，使VC含量下降速率快，最終為（280.33±3.12）mg/kg。由此可見，L.caseiHDS-01 作為發(fā)酵劑能夠減緩VC的降解，提高了酸菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.5 酸菜感官評(píng)價(jià)

由表3 可知，自然發(fā)酵酸菜汁液渾濁、脆度低、沒有酸菜的香味，原因是發(fā)酵液酸度低，腐敗細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖破壞了白菜組織中的蛋白質(zhì)及含氮物質(zhì)，導(dǎo)致發(fā)酵液渾濁。同時(shí)，黃慧福等[30]研究發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵酸菜在發(fā)酵初期含有少量霉菌，霉菌中用來分泌分解果膠的酶導(dǎo)致蔬菜組織變軟、酸菜脆度降低。人工發(fā)酵酸菜湯汁清澈，具有酸菜的香氣，原因是人工接種的L.casei在發(fā)酵初期就產(chǎn)生大量乳酸，能夠抑制有害微生物的生長(zhǎng)。此外，總酸含量的升高，果膠含量的增加，導(dǎo)致酸菜的脆性更好，因此賦予酸菜酸度適中、醇香爽脆的獨(dú)特風(fēng)味[31]。從發(fā)酵液清澈度、酸菜的色澤、香氣、口味以及脆度等指標(biāo)對(duì)比評(píng)價(jià)兩種酸菜樣品，人工發(fā)酵樣品整體感官評(píng)分為（8.65±0.15）分，高于自然發(fā)酵酸菜（5.43±0.35）分。因此，接入L.caseiHDS-01 作為發(fā)酵劑可顯著改善酸菜的感官品質(zhì)，為酸菜帶來良好的口感，這一結(jié)果與趙丹等[15]的研究結(jié)果一致。

表3 酸菜樣品感官評(píng)分Table 3 Sensory evaluation scores of sauerkraut samples

2.6 細(xì)菌群落組成

在兩種酸菜發(fā)酵液樣本中共檢測(cè)到8 個(gè)菌門，分別為放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍(lán)藻細(xì)菌門（Cyanobacteria）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、髕骨細(xì)菌門（Patescibacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。如圖5A所示，在自然發(fā)酵微生物系統(tǒng)中優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（56.23%～99.05%），而人工發(fā)酵系統(tǒng)中優(yōu)勢(shì)菌門始終為厚壁菌門（63.37%～95.80%）。

圖5 發(fā)酵過程中門水平（A）和屬水平（B）細(xì)菌群落組成分析和屬水平細(xì)菌群落PCA 分析（C）Fig.5 Analysis of flora structure at gate (A) and genus (B) level and principal component analysis of bacterial communities at the genus level (C) during fermentation of sauerkraut

兩種發(fā)酵體系屬水平細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)如圖5B 所示，共檢測(cè)到99 種，主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、拉恩氏菌屬（Rahnella）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）和希瓦氏菌屬（Shewanella）。而在自然發(fā)酵系統(tǒng)中，初始階段乳桿菌屬的相對(duì)豐度僅為0.31%，在發(fā)酵第7 d 才上升至43.72%，到發(fā)酵第13 d 后基本趨于穩(wěn)定，直至發(fā)酵末期時(shí)降至20.03%。Enterobacter和Pseudomonas分別為（2.85%～26.93%）和（10.72%～30.75%）。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，一些Enterobacter和Pseudomonas可用作生可導(dǎo)致食物腐敗，影響酸菜安全品質(zhì)[32]。而在人工發(fā)酵系統(tǒng)中，發(fā)酵初始階段，Lactobacillus的相對(duì)豐度為95.79%，隨著發(fā)酵進(jìn)行而輕微波動(dòng)，到第19 d發(fā)酵末期時(shí)降至63.36%。整個(gè)發(fā)酵過程中，Enterobacter和Pseudomonas相對(duì)豐度分別為（0.04%～2.26%）和（0.28%～25.84%）和，含量遠(yuǎn)低于自然發(fā)酵酸菜。

進(jìn)一步采用PCA 分析比較了兩種發(fā)酵液樣本在屬水平上的相似性和差異程度。樣本物種組成越相似，反映在PCA 圖中的距離則越近。從圖5C 可知，隨著發(fā)酵進(jìn)行，不同體系、不同時(shí)間點(diǎn)樣本細(xì)菌群落特征存在顯著差異（PC1 和PC2 的貢獻(xiàn)率分別為66.84%和19.49%）。對(duì)比兩個(gè)發(fā)酵體系，人工發(fā)酵系統(tǒng)中腐敗菌的相對(duì)豐度不斷減小且始終低于自然發(fā)酵。除了因?yàn)榇罅慨a(chǎn)生乳酸進(jìn)入酸性，也可能是由于L.casei產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)抑制其他革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)[33]。由此可以看出，乳酸菌數(shù)量的增加不僅可以降低微生物生態(tài)系統(tǒng)的物種多樣性，還能有效抑制腐敗菌的生長(zhǎng)。

2.7 發(fā)酵體系激活群體感應(yīng)評(píng)測(cè)

群體感應(yīng)（Quorum Sensing，QS）是細(xì)胞之間的通信過程，這是一種可以共同調(diào)節(jié)細(xì)菌之間細(xì)菌行為和調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制[34-35]。張琦等[36]認(rèn)為乳酸菌存在LuxS介導(dǎo)的種間QS 系統(tǒng)，調(diào)控細(xì)菌素和有機(jī)酸的生成，維持自身的優(yōu)勢(shì)地位。本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)，監(jiān)測(cè)群體感應(yīng)基因LuxS表達(dá)水平的變化，以自然發(fā)酵每個(gè)時(shí)間點(diǎn)luxS的表達(dá)量為對(duì)照，檢測(cè)人工發(fā)酵各階段LuxS相對(duì)表達(dá)水平。如圖6所示，隨著發(fā)酵進(jìn)行，人工發(fā)酵系統(tǒng)的luxS表達(dá)量與對(duì)照組相比始終顯著上調(diào)。在發(fā)酵7 和11 d 時(shí)最為顯著，分別上調(diào)了（5.71±0.33）和（6.72±0.41）倍，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，差異極顯著（P＜0.01）。由此可以看出，人工發(fā)酵酸菜系統(tǒng)中存在群體感應(yīng)調(diào)控機(jī)制，但群體感應(yīng)現(xiàn)象如何通過LuxS表達(dá)量上升而促進(jìn)整個(gè)酸菜發(fā)酵進(jìn)程需要進(jìn)一步研究。

圖6 L.casei HDS-01 酸菜發(fā)酵過程中l(wèi)uxS 相對(duì)表達(dá)水平Fig.6 Change in the relative expression level of luxS during L.casei HDS-01 fermentation of sauerkraut

3 結(jié)論

將高產(chǎn)乳酸的L.caseiHDS-01 接入酸菜發(fā)酵生態(tài)體系中，Lactobacillus迅速成為優(yōu)勢(shì)菌屬，菌體密度增強(qiáng)，群體感應(yīng)的信號(hào)因子達(dá)到閾值被激活，產(chǎn)生了大量乳酸，導(dǎo)致pH 迅速降低，優(yōu)先進(jìn)入酸性環(huán)境。酸性環(huán)境有利于VC的保留和亞硝酸鹽的降解，維持了Lactobacillus的優(yōu)勢(shì)地位，抑制了腸桿菌屬等致病菌的繁殖。綜上所述，從感官品質(zhì)上，接種L.caseiHDS-01 發(fā)酵的酸菜樣品湯汁清亮，色澤黃嫩，口味濃郁，口感清脆。從發(fā)酵工藝上，L.caseiHDS-01 發(fā)酵酸菜產(chǎn)品中VC含量和乳酸含量均比自然發(fā)酵酸菜更高，亞硝酸鹽含量和致病菌豐度更低，改善了酸菜的產(chǎn)品品質(zhì)，提高了發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，提高了酸菜食用的安全性。