羅福龍李文舉吳小會(huì)鐘 武范 蓓貫東艷王鳳忠?王 瓊?

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診科,四川 瀘州 646000;3.四川省康復(fù)醫(yī)院,成都 611139;4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,重慶 400016)

炎癥的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)時(shí)刻變化的過(guò)程,主要通過(guò)自身免疫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的自我保護(hù)作用[1]。炎癥反應(yīng)在人體內(nèi)普遍存在,不僅可以減輕和消除有害因子對(duì)人體的損傷,還可以促進(jìn)后期的組織修復(fù),但免疫系統(tǒng)的過(guò)度激活,會(huì)促使炎癥因子的大量釋放,形成“細(xì)胞因子風(fēng)暴”[2],發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng),甚至危及生命。

巨噬細(xì)胞作為炎癥性疾病最主要的免疫防御細(xì)胞,可以釋放促炎介質(zhì)促進(jìn)炎癥因子的形成[3]。巨噬細(xì)胞的可塑性和功能極化作用在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[4],巨噬細(xì)胞在特定微環(huán)境下,可以發(fā)生M1 和M2 表型的轉(zhuǎn)化,在炎癥反應(yīng)的早期,M1 型巨噬細(xì)胞可以分泌多種促炎因子,如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、IL-6、IL-1β 等,通過(guò)增強(qiáng)其自身的抗原提呈能力來(lái)激活I(lǐng) 型免疫反應(yīng),引起組織細(xì)胞損傷阻止炎癥反應(yīng)進(jìn)程。 與之相反,M2 型巨噬細(xì)胞可以分泌多種炎癥抑制因子,如IL-10、IL-4、精氨酸激酶-1(Arginase-1)、CD206 等,通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)展,促進(jìn)組織損傷的自我修復(fù)過(guò)程[5-6]。脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS) 可以模擬炎癥反應(yīng)的早期階段,通過(guò)誘導(dǎo)M1 型巨噬細(xì)胞的分化[7-8],促進(jìn)炎癥的發(fā)生。

中藥免疫調(diào)節(jié)在炎癥過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,其內(nèi)在機(jī)制可能與巨噬細(xì)胞M1 和M2 表型的平衡有關(guān)。 連翹Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl.是木犀科連翹屬植物,連翹果實(shí)作為中藥在我國(guó)被廣泛應(yīng)用[9],但連翹對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡和極化的研究鮮有報(bào)道。 因此,本研究采用LPS 誘導(dǎo)體外培養(yǎng)RAW264.7 巨噬細(xì)胞的極化模型,探討了連翹提取物(FSE)對(duì)LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞ROS 和細(xì)胞凋亡,以及M1/M2 型相關(guān)標(biāo)志基因的影響,初步探討FSE 在巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞來(lái)自于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部。

1.2 主要試劑與儀器

連翹產(chǎn)自山西,購(gòu)自北京太洋樹康藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號(hào)2012054),經(jīng)水提、濃縮、噴霧干燥、粉碎而成;DMEM 培養(yǎng)基(Thermo Scientific,批號(hào)11965092) ;胎牛血清(Gibco,批號(hào):10099141);LPS (Sigma 公司,批號(hào)12880) ;一氧化氮檢測(cè)試劑盒(碧云天,批號(hào):S0021);Hoechst33342(碧云天,批號(hào):C1022);DCFH-DA 活性氧ROS 熒光探針(索萊寶,批號(hào):D6470);MTT 試劑盒(索萊寶,批號(hào):M1020);EASYspinPlus 組織/細(xì)胞RNA 快速提取試劑盒(艾德萊,批號(hào):RN28);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(普洛麥格,批號(hào):A5000);NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus(novoprotein,批號(hào):E096-01B);Real-time PCR引物(北京擎科生物科技有限公司)。

細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó),Thermo 公司,型號(hào):Thermo 371);酶標(biāo)儀(美國(guó),Molecular Devices 公司,型號(hào):spectra MAX190);熒光倒置顯微鏡(日本,Olympus公司,型號(hào):IX71);RT-PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI 公司,型號(hào):ABI 7500);可見紫外分光光度計(jì)(上海尤尼柯公司,型號(hào):WFZ UV-2100);低溫高速離心機(jī)(德國(guó),Eppendorf 公司,型號(hào):5430R)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RAW264.7 的培養(yǎng)與分組

RAW264.7 細(xì)胞復(fù)蘇后,以含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基,5%的CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞,每隔24 h 觀察細(xì)胞狀態(tài)并換液和傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以每毫升1×104個(gè)的細(xì)胞密度接種于96 孔板,每孔100 μL;或以每毫升1×106個(gè)細(xì)胞密度接種于6 孔板,每孔2 mL。 接種24 h 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組,LPS 組(500 ng/mL),加藥組(6.25、12.5、25、50 μg/mL),首先加入不同劑量連翹提取物作用2 h,再每孔加入500 ng/mL 的LPS 溶液共同刺激36 h。

1.3.2 MTT 法檢測(cè)FSE 和LPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的毒性作用

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞接種于96 孔板,加入不同濃度的FSE 和LPS 作用36 h,每孔加入10%的MTT 溶液100 μL,培養(yǎng)4 h 后,吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。 每孔加入110 μL 二甲基亞砜,置搖床上低速震蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。 490 nm 檢測(cè)各孔的吸光度。

1.3.3 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞接種于96 孔板,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。 然后加入LPS 以及不同濃度FSE 作用36 h,用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.4 細(xì)胞上清液一氧化氮(NO)生成量測(cè)定

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞密度接種于96 孔板。 藥物處理36 h 后,取各組細(xì)胞上清液50 μL 分別加入Griess Reagent I 和Griess Reagent II 液各50 μL,酶標(biāo)儀540 nm 檢測(cè)各組的吸光度。

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)和細(xì)胞凋亡測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞,接種于6 孔板中,藥物處理完成后,加入1 mL 稀釋好的DCFHDA 或Hoechst33342 溶液,稀釋比例為1 ∶1000,使其終濃度為10 μmol/L,置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min,用無(wú)血清培養(yǎng)基洗3 次,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照,用Image-Pro Plus 分析熒光強(qiáng)度。

1.3.6 總RNA 的提取、mRNA 的逆轉(zhuǎn)錄及Realtime PCR

提取RNA 方法參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,得到RNA 溶液。 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,以逆轉(zhuǎn)錄cDNA 第一鏈合成,然后以cDNA 為模板擴(kuò)增目標(biāo)基因的基因編碼段,以鼠GAPDH 為內(nèi)參照,應(yīng)用2-△△Ct法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。 擴(kuò)增條件如下:95℃預(yù)變性1 min;95℃變性20 s,60℃延伸1 min,40 個(gè)循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)所用引物由北京擎科生物科技有限公司從NCBI 中獲得,引物用 Primer 6 和 Oligo 7 設(shè)計(jì),并由北京擎科生物科技有限公司合成(表1)。

表1 Real-time PCR 引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s) 表示,2 組間差異比較采用t檢驗(yàn),多組間差異比較采用單因素方差分析,P<0.05 為具有顯著性差異,P<0.01 為具有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 FSE 和LPS 對(duì)細(xì)胞活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組細(xì)胞,100、200 μg/mL 濃度的FSE 細(xì)胞活力分別為(67.13 ±3.25)%、(41.49±2.78)%,FSE 濃度依賴性的抑制細(xì)胞增殖,在 FSE 低于50 μg/mL 的濃度處理下,FSE 對(duì)細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯的抑制作用,細(xì)胞存活率沒(méi)有顯著性變化,故選用低于50 μg/mL 濃度范圍進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1A)。 相比于對(duì)照組細(xì)胞,LPS濃度在100~1500 ng/mL 均對(duì)細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯的抑制作用(圖1B)。

2.2 FSE 降低LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NO產(chǎn)生

為研究FSE 對(duì)LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞后的NO 生成的影響,用不同濃度的LPS 刺激細(xì)胞36 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,在500 ng/mL 的LPS 刺激細(xì)胞時(shí),NO 生成量最大,隨著LPS 濃度的增高,NO 生成量逐漸下降(圖2A),故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用500 ng/mL 的LPS 作為誘導(dǎo)濃度。 在500 ng/mL 的LPS刺激下,研究了FSE 對(duì)細(xì)胞NO 生成量的作用。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)6.25、12.5、25、50 μg/mL 濃度的FSE 可以降低LPS 刺激后細(xì)胞內(nèi)NO 生成量(圖2B)。

2.3 FSE 對(duì)LPS 誘導(dǎo)后RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),正常組的細(xì)胞是不規(guī)則的圓形;LPS 組的細(xì)胞形態(tài)相對(duì)于正常細(xì)胞較大,長(zhǎng)出不規(guī)則觸角,變成梭形,細(xì)胞明顯誘導(dǎo)貼壁;各給藥組細(xì)胞形態(tài)均趨于正常,有部分細(xì)胞恢復(fù)為半貼壁的圓形細(xì)胞(圖3)。

圖3 FSE 對(duì)LPS 誘導(dǎo)后RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)的影響Figure 3 Effect of FSE on the morphology of RAW264.7 cells induced by LPS

2.4 FSE 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS 的影響

首先,在熒光顯微鏡下分別測(cè)得在3、6、12、24 h的綠色熒光強(qiáng)度。 在500 ng/mL 的LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞3~6 h 時(shí),熒光強(qiáng)度與對(duì)照組比明顯升高,但LPS 刺激細(xì)胞24 h 時(shí),熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比明顯減少(圖4A)。 再用12.5、25、50 μg/mL的FSE 作用細(xì)胞24 h,與LPS 組相比,FSE 組熒光強(qiáng)度明顯升高(圖4B、4C)。

2.5 FSE 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

為得到LPS 刺激之后RAW264.7 細(xì)胞的凋亡情況,在Hoechst33342 染色的3、6、12、24 h 分別在熒光顯微鏡下的藍(lán)色熒光強(qiáng)度。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),在24 h熒光強(qiáng)度差異最為明顯(圖5A)。 接下來(lái),用12.5、25、50 μg/mL 的FSE 作用24 h,與模型組相比,FSE組熒光強(qiáng)度明顯下降(圖5B、5C)。

注:A:FSE 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活性的影響;B:LPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活性的影響。 與對(duì)照組相比, ###P<0.001。圖1 FSE 和LPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活性的影響Note.A, Effect of FSE on the activity of RAW 264.7 cells.B, Effect of LPS on the activity of RAW 264.7 cells.Compared with the control group, ###P<0.001Figure 1 Effects of FSE and LPS on the activity of RAW 264.7 cells

注:A:不同濃度的LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞后NO 生成量;B:不同濃度的FSE 對(duì)LPS 刺激后細(xì)胞NO 生成量的影響。 與對(duì)照組相比, ###P<0.001;與LPS 組相比,???P<0.001。圖2 FSE 降低LPS 刺激后NO 的產(chǎn)生Note.A, NO production of RAW264.7 cells stimulated by different concentrations of LPS.B, Effects of different concentrations of FSE on cell NO production stimulated by LPS.Compared with the control group, # ##P<0.001.Compared with the LPS group, ???P<0.001.Figure 2 FSE reduces NO production after LPS stimulation

注:A:不同濃度LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞后ROS 產(chǎn)生的作用時(shí)間;B、C:不同濃度的FSE 降低LPS 刺激后ROS 的產(chǎn)生。 與對(duì)照組相比, ###P<0.001;與LPS 組相比,???P<0.001。圖4 FSE 升高LPS 刺激后ROS 的產(chǎn)生Note.A, Time of ROS production after different concentrations of LPS stimulated RAW264.7 cells.B, C, Different concentrations of FSE reduce the production of ROS stimulated by LPS.Compared with the control group, ###P<0.001.Compared with the LPS group, ???P<0.001.Figure 4 FSE reduces ROS production after LPS stimulation

注:A:不同濃度LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞凋亡的作用時(shí)間;B、C:不同濃度的FSE 減少LPS 刺激后的細(xì)胞凋亡。 與對(duì)照組相比, ###P<0.001;與LPS 組相比,???P<0.001。圖5 FSE 減少LPS 刺激后的細(xì)胞凋亡Note.A, Time of apoptosis of RAW264.7 cells stimulated by different concentrations of LPS.B, C, Different concentrations of FSE reduce apoptosis stimulated by LPS.Compared with the control group, ###P<0.001.Compared with the LPS group,???P<0.001.Figure 5 FSE reduces apoptosis stimulated by LPS

2.6 LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞極化的濃度和時(shí)間研究

為了研究不同LPS 濃度對(duì)RAW264.7 細(xì)胞極化的影響,分別用100、250、500、750 ng/mL 的LPS作用細(xì)胞24 h,與對(duì)照組相比,TNF-α、iNOS mRMA表達(dá)水平在不同LPS 濃度下均顯著增高;IL-6 mRMA 表達(dá)水平在100 ng/mL 和250 ng/mL 的LPS 作用下降低,在500 ng/mL 和750 ng/mL 的LPS 作用下顯著增高;IL-1β mRMA 表達(dá)水平在250 ng/mL 的LPS 下逐漸增高;IL-10 mRMA 表達(dá)水平在100 ng/mL 和250 ng/mL 的LPS 作用下顯著降低;CD206 mRMA、Arginase-1 表達(dá)水平在不同LPS 濃度下顯著降低(圖6A~6G)。

為了研究LPS 作用不同時(shí)間對(duì)RAW264.7 細(xì)胞極化的影響,在500 ng/mL 的LPS 作用細(xì)胞后,分別得到M1 表型基因(TNF-α、IL-1β、iNOS、IL-6)和M2 表型基因(IL-10、CD206、Arginase-1)不同時(shí)間點(diǎn)的mRNA 表達(dá)水平。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),TNF-α 和IL-1β mRMA 表達(dá)水平在6 h 時(shí)顯著增高,iNOS 和IL-6 mRMA 表達(dá)水平在36 h 時(shí)顯著增高,IL-10、CD206 mRMA 表達(dá)水平在36 h 時(shí)顯著降低,Arginase-1 mRMA 表達(dá)水平在24 h 時(shí)顯著降低(圖6H~6N)。

2.7 FSE 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞極化的影響

為了進(jìn)一步研究FSE 對(duì)細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用,將FSE 加入500 ng/mL 的LPS 刺激細(xì)胞36 h。 結(jié)果顯示,FSE 可以降低LPS 誘導(dǎo)上調(diào)的基因(IL-1β、IL-6、iNOS) mRNA 表達(dá)水平,同時(shí)可以升高LPS 誘導(dǎo)下調(diào)基因(CD206、IL-10)mRNA 表達(dá)水平(圖7)。

注:A~C:不同濃度的FSE 對(duì)LPS 刺激后的RAW264.7 細(xì)胞M1 表型的極化調(diào)節(jié);D~E:不同濃度的FSE 對(duì)LPS 刺激后的RAW264.7細(xì)胞M2 表型的極化調(diào)節(jié)。 與對(duì)照組相比, # ##P<0.001;與LPS 組相比, ??P<0.01, ???P<0.001。圖7 不同濃度的FSE 對(duì)LPS 刺激后的細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)Note.A~ C, Polarization regulation of FSE at different concentrations on M1 phenotype of RAW264.7 cells stimulated by LPS.D~ E, Polarization regulation of FSE at different concentrations on M2 phenotype of RAW264.7 cells stimulated by LPS.Compared with the control group, ###P<0.001.Compared with the LPS group, ??P<0.01,???P<0.001.Figure 7 Regulation of FSE at different concentrations on cell polarization stimulated by LPS

注:A~G:500 ng/mL 的LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞極化的作用時(shí)間;H~N:不同濃度的LPS 刺激24 h 后RAW264.7 的細(xì)胞極化。 與對(duì)照組相比, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001。圖6 LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞極化的時(shí)間和濃度Note.A~G, Polarization time of RAW264.7 cells stimulated by 500 ng/mL LPS.H~N, Cell polarization of RAW264.7 after 24 hours stimulated by different concentrations of LPS.Compared with the control group, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 6 Time and concentration of LPS stimulated RAW264.7 cell polarization

3 討論

炎癥反應(yīng)在人體內(nèi)普遍存在,參與了慢性阻塞性肺病、炎癥性腸病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、消化性疾病以及糖尿病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[9-10]。 這些炎癥性疾病給社會(huì)帶來(lái)了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),縮短了患者的平均預(yù)期壽命[11-12], 目前,非甾體抗炎藥作為抑制炎癥癥狀的常用藥物,長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生胃腸道等各種副作用[13],因此,迫切需要研究可靠、有效的替代藥物來(lái)預(yù)防和治療各種疾病。

連翹作為傳統(tǒng)中藥,具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)等諸多作用。 具有較大的臨床藥用價(jià)值,現(xiàn)已分離出300 多種化學(xué)成分,包括苯乙醇苷類、木脂素類、酚酸類、黃酮類、萜類及揮發(fā)油、C6-C2天然醇及其苷類等[14],其中主要化學(xué)成分為苯乙醇苷類和木脂素類[15],目前分離得到苯乙醇苷類成分包括連翹酯苷A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、毛柳苷、車前草苷A、木通苯乙醇苷A、B 等[16-17]。木脂素類成分主要包括連翹苷、連翹脂素、牛蒡子苷元、松脂素、表松脂素、落葉松脂素、異落葉松脂素、Cedrusin、連翹蘭A、連翹蘭B、異橄欖脂素[18],其中連翹酯苷A 和連翹苷為2020 版《中國(guó)藥典》連翹含量測(cè)定的指標(biāo)性成分[19]。 連翹提取物均有抑制炎癥反應(yīng)的作用,其水提物、甲醇提取物、乙醇提取物以及揮發(fā)油等可以抑制多種炎癥模型[20-23],連翹各極性部位提取物的含量差別較大,其中水提取物提取率最高[24],連翹提取物主要通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路、JAK/STAT 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路,調(diào)控炎癥過(guò)程中的多種酶及炎性介質(zhì)的產(chǎn)生[25],從而抑制炎癥反應(yīng)。

活性氧(ROS)作為體內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要活性成分,主要由NADPH 氧化酶(Nox)產(chǎn)生,通過(guò)激活下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)擴(kuò)大炎癥的二級(jí)信使[26-27],ROS 也可以過(guò)激活非特異性免疫系統(tǒng)消除病原體和修復(fù)損傷組織[28],研究發(fā)現(xiàn)LPS 可以促進(jìn)ROS的產(chǎn)生[29],本研究中,LPS 在刺激RAW264.7 細(xì)胞后3~6 h 時(shí),細(xì)胞內(nèi)ROS 大量產(chǎn)生,但是在LPS 刺激細(xì)胞24 h 時(shí),細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生減少,而FSE 可以增加LPS 刺激24 h 時(shí)的ROS 產(chǎn)生。

此外,ROS 通過(guò)磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT途徑觸發(fā)多種細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)[29],調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡過(guò)程[30]。 ROS 對(duì)巨噬細(xì)胞發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用,ROS 既可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡,又可以抑制巨噬細(xì)胞的凋亡,這可能與cAMP 激活 cAMP 依賴性蛋白激酶有關(guān)[31]。 在LPS 誘導(dǎo)24 h 時(shí),ROS 的產(chǎn)生量顯著減少,RAW264.7 細(xì)胞凋亡顯著增加。 FSE 可以增加LPS 刺激24 h 時(shí)的ROS 產(chǎn)生量,并且減少LPS刺激24 h 時(shí)的細(xì)胞凋亡,FSE 發(fā)揮抗炎作用可能是通過(guò)增加巨噬細(xì)胞內(nèi)的ROS,抑制其自身細(xì)胞的凋亡,進(jìn)而發(fā)揮巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能。

近年來(lái),巨噬細(xì)胞的極化參與多種疾病過(guò)程的調(diào)節(jié),如免疫性神經(jīng)炎[32]、炎癥性腸病[33]、糖尿病和肥胖癥[34]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[35]等,巨噬細(xì)胞的極化可以通過(guò)LPS 誘導(dǎo)為M1 型或者通過(guò)IL-4 誘導(dǎo)為M2 型巨噬細(xì)胞[36-37],本文研究了LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞極化的模型,在不同濃度的LPS 以及LPS 作用不同時(shí)間中,M1 和M2 表型的基因表達(dá)水平存在差異,為RAW264.7 細(xì)胞極化的模型提供了新思路。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FSE 可顯著降低LPS誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞M1 表型IL-1β、iNOS、IL-6 mRNA 表達(dá)水平,FSE 同時(shí)明顯升高M(jìn)2 表型CD206、IL-10 mRNA 表達(dá)水平,以發(fā)揮抗炎的作用。

綜上所述,FSE 可通過(guò)抑制RAW264.7 細(xì)胞的凋亡以及促進(jìn)M2 型巨噬細(xì)胞的表達(dá),從而抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥反應(yīng),從細(xì)胞凋亡和巨噬細(xì)胞極化功能角度進(jìn)一步闡明連翹發(fā)揮抗炎作用的內(nèi)在機(jī)制,對(duì)其臨床應(yīng)用提供了很好的參考。