梁成孔，孫鵬亮，李蓮瑞*

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團南疆動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

溶血性曼氏桿菌（Manniella hemolyticus）又稱溶血巴氏桿菌，屬巴氏桿菌科曼氏桿菌屬，為革蘭氏陰性且兼性厭氧菌，是一種條件性致病菌。溶血性曼氏桿菌在牛羊鼻咽和扁桃體中屬于正常菌群，當(dāng)機體防御受到各種應(yīng)激因素（如運輸、營養(yǎng)不良、不利的物理、環(huán)境或氣候條件以及之前或同時感染某些呼吸道病毒、支原體或其他類型的細菌）損害時均可致病[1-2]。肺炎性巴氏桿菌病是世界范圍內(nèi)分布的牛、綿羊和山羊的重要呼吸道疾病之一，被認為是一種人畜共患疾病，可導(dǎo)致支氣管擴張、支氣管炎、肺炎、尿路感染、腦膿腫、敗血癥，通常由甲型溶血性曼氏桿菌引起[3-4]。近年來羊群感染溶血曼氏桿菌引起呼吸道疾病時有發(fā)生，對養(yǎng)羊業(yè)造成了一定的威脅[5-9]。目前市場上缺乏規(guī)范的商品化疫苗預(yù)防該病，且該病原菌存在多個抗原，商品化疫苗具有局限性，只能保護部分免疫作用[10]。

2021年5月，新疆阿克蘇市某養(yǎng)羊場發(fā)生疫情，30日齡的羔羊病死率達到20%以上。發(fā)病羊主要表現(xiàn)為呼吸困難、流鼻涕、咳嗽、拉稀、體溫升高至42℃。本研究剖解發(fā)病羊，取肺、肝、腸、腸系膜淋巴結(jié)等組織，從病原中分離出毒株，通過PCR、16SrRNA鑒定，以期為今后該病的防控工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病料來自新疆阿克蘇市某養(yǎng)羊場30日齡羔羊的肺、肝、腸、腸系膜淋巴結(jié)。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：DNA純化試劑盒、瓊脂糖、Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker（北京全氏金生物技術(shù)有限公司）。

主要儀器：干式恒溫箱（杭州奧盛儀器有限公司）、DK-8D電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、伯樂T100梯度PCR儀（北京智杰方遠有限公司）、凝膠成像分析系統(tǒng)（ChemiDoc XRS）。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA提取

精確稱取1 g病料加入1 mL PBS溶液放入打碎機打碎5 min，取200~300μL。按照DNA提取試劑盒說明書提取DNA。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3.2 巴氏桿菌PCR擴增

以提取的DNA為模板進行PCR擴增。

反應(yīng)體系為：premix Taq(10×Ex Taq Version 2.0)0.5μL、10μmol/L上游引物1μL、10μmol/L下游引物1μL、DNA模板5μL、buffer 2.5μL、dNTP 1μL、RNasefree H2O 14μL。

PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，32個循環(huán)；72℃退火10 min。擴增產(chǎn)物跑電泳觀察結(jié)果。

1.3.3 16SrRNA擴增

以提取的DNA為模板進行PCR擴增。

反應(yīng)體系為：2×Pro Taq Master Mix 25μL、10μmol/L 27F 1μL、10μmol/L 1492R 1μL、DNA模板5μL、ddH2O 10μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 s；98℃變性20 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，33個循環(huán)；72℃延伸2 min。擴增產(chǎn)物跑電泳觀察結(jié)果。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

使 用 程 序ProtParam、ProtScale、SignalP 4.1Server、NetPhos 3.1 Server和TMHMM Serverv2.0分析溶血曼氏桿菌蛋白的理化性質(zhì)、疏水性、信號肽、磷酸化位點與跨膜結(jié)構(gòu)域及溶血曼氏桿菌蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀及病理變化結(jié)果（見圖1、圖2）

圖1 肺臟組織病變Fig.1 Pathological changes of lung tissue

圖2 腸系膜淋巴結(jié)腫大Fig.2 Enlarged mesenteric lymph nodes

患病綿羊體溫升高42℃，流漿液性、黏液性鼻液，呼吸困難、咳嗽、運動量減少，經(jīng)常躲在墻角，被毛粗亂，角膜潮紅、濕潤。

由圖1、圖2可知，發(fā)病羊肺臟充血、出血、實變，肝臟瘀血、出血，腸道出血、膽囊充盈、腸系膜淋巴結(jié)腫大、出血，胃內(nèi)含有未消化的乳凝塊。

2.2 巴氏桿菌PCR檢測結(jié)果（見圖3）

由圖3可知，陽性對照和肺臟在750 bp處出現(xiàn)明亮的條帶，與預(yù)期相符；肝臟、腸、腸系膜淋巴結(jié)均未出現(xiàn)明亮的條帶，初步說明該病羊感染了巴氏桿菌。

圖3 巴氏桿菌PCR檢測結(jié)果Fig.3 PCRtest results for Pasteurella

2.3 16SrRNA檢測結(jié)果（見圖4）

自瓊脂平板上挑取一個單個菌落作純培養(yǎng)測序。由圖4可知，發(fā)病羊感染溶血性曼氏桿菌。

圖4 16S rRNA檢測結(jié)果Fig.4 16SrRNA test result

2.4 溶血性曼氏桿菌蛋白親疏水性分析（見圖5）

圖5 溶血性曼氏桿菌蛋白親疏水性分析Fig.5 Hydrophilicity and hydrophobicity analysis of proteinsof M.haemolyticus

由圖5可知，溶血性曼氏桿菌蛋白由450個氨基酸組成，正負電氨基酸分別為59和47；不穩(wěn)定系數(shù)是46.39，當(dāng)不穩(wěn)定系數(shù)大于40時，說明該蛋白為不穩(wěn)定性蛋白。平均親水值（CRAVY）為-0.580，脂肪族系數(shù)為46.14。PoatScale程序?qū)θ苎月蠗U菌蛋白的親疏水性分析和平均親水值判斷，該蛋白為親水性蛋白。

2.5 溶血性曼氏桿菌信號肽、磷酸化位點及跨膜域結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析（見圖6、圖7）

由圖6、圖7可知，溶血曼氏桿菌無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，有54個磷酸化位點，其中33個絲氨酸、17個蘇氨酸和4個酪氨酸磷酸化位點。

圖6 溶血性曼氏桿菌蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域Fig.6 Transmembrane domain of proteins of M.haemolyticus

圖7 溶血性曼氏桿菌蛋白的磷酸化位點Fig.7 Phosphorylation sitesof proteinsof M.haemolyticus

2.6 溶血性曼氏桿菌二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（見圖8）

圖8 溶血性曼氏桿菌二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 Prediction of thesecondary structureof M.haemolyticus

由圖8可知，利用SOPMA分析溶血性曼氏桿菌蛋白由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲以及延伸鏈4種結(jié)構(gòu)組成二級結(jié)構(gòu)。無規(guī)則卷曲蛋白表結(jié)構(gòu)松散容易與抗體結(jié)合，可作為抗原表位，優(yōu)勢區(qū)段為：22~24、32~35、60~64、71~75、83~90、108~113、121~131、140~159、164~167、174~180、186~189、196~200、215~217、229~241、249~259、265~273、275~283、288~291、296~300、307~312、325~333、342~358、262~364、378~386、408~436、440~446、448~450。

3 討論

溶血性曼氏桿菌是一種球狀短桿菌，菌體兩端鈍圓，周圍可見明顯的莢膜，為無鞭毛、無芽孢的革蘭氏陰性菌，通常以單一、成對散在排列；瑞氏染色、革蘭氏染色或美藍染色后呈兩極濃染。溶血性曼氏桿菌形態(tài)與巴氏桿菌相似[1,11-13]，只在反芻動物體內(nèi)才能夠分離到，牛在運輸過程中更易發(fā)生該病[14]。因此，可推斷在應(yīng)激環(huán)境的刺激下可誘發(fā)溶血性曼氏桿菌病。溶血曼氏桿菌具有大量的血清型，A1和A2是最優(yōu)勢菌株。A2是導(dǎo)致綿羊發(fā)病的最為常見的血清型，A7血清型也可引起綿羊中急性暴發(fā)。此次引起羔羊死亡的是血清型A2還是A7，或是其他未被發(fā)現(xiàn)的致病性血清型仍需進一步研究。

溶血曼氏桿菌在免疫系統(tǒng)中可與其他微生物合作，強化機體的防御功能。當(dāng)外界環(huán)境由于各種原因發(fā)生變化，機體的防御系統(tǒng)下降，導(dǎo)致維持機體與共生菌的平衡能力失去平衡，溶血性曼氏桿菌感染機體導(dǎo)致發(fā)病[11]。溶血性曼氏桿菌大量繁殖的過程中產(chǎn)生毒力因子，如莢膜、脂多糖、白細胞毒素外膜蛋白等，形成肺靜脈、毛細血管和淋巴管血栓，導(dǎo)致肺缺血性壞死和纖維素性滲出物沉積的炎癥反應(yīng)，引發(fā)纖維素性肺炎，發(fā)病羊出現(xiàn)呼吸困難、流鼻涕和咳嗽等癥狀，與本研究中患病羊的臨床癥狀相符。

本試驗利用PCR技術(shù)成功擴增出目的基因，得到目的基因片段大小為750 bp，與預(yù)期大小相符；通過16SrRNA進行進一步確定，測序結(jié)果顯示為溶血性曼氏桿菌。從生物信息學(xué)分析，溶血曼氏桿菌蛋白揭示，該蛋白無信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域。信號肽標記蛋白質(zhì)分泌途徑和蛋白質(zhì)目標位置，溶血曼氏桿菌蛋白無信號肽，說明此蛋白無分泌功能。該蛋白為混合性蛋白，穩(wěn)定性差，發(fā)生盤旋和扭曲概率高，和抗體分子結(jié)合比例大。因此，該區(qū)域可能存在B細胞抗原表位[15-18]。但其他區(qū)域或許還存在更多的抗原表位，仍需進一步試驗加以確認。

4 結(jié)論

本研究通過分子生物學(xué)診斷技術(shù)和臨床癥狀觀察，確定阿克蘇某羊場羊可能感染溶血性曼氏桿菌，并利用生物信息學(xué)分析該蛋白的特性，為進一步研究該病提供參考。