王洋 盧長柱 曹國君 王濱 趙紅曄 李鵬輝 文麗波

心血管疾病嚴(yán)重威脅著人類健康，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率和死亡率位居第一位，且呈逐年上升趨勢。原發(fā)性高血壓（Essential hypertesion，EH）和冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是最常見的心血管疾病[1]。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心?。–oronary heart disease，CHD），是冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變而引起血管管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病[2]。目前認(rèn)為，性別、年齡、吸煙、肥胖、家族史、高血壓、糖尿病及血脂異常等多種危險(xiǎn)因素均可能導(dǎo)致冠心病發(fā)生，其中高血壓是其發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。長期高血壓是促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，二者聯(lián)系緊密[3]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IL-33/IL1RL1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在多種心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[4]。IL-33和IL1RL1基因中的遺傳變異與高血壓、冠心病的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[5]。本研究旨在探討我國北方高寒地區(qū)漢族人群中IL-33、IL1RL1基因單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性高血壓合并冠心病的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018年1月～2020年12月齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院心血管內(nèi)科住院的80例患者（病例組）。病例組患者納入標(biāo)準(zhǔn)為住院期間冠狀動脈造影結(jié)果顯示至少一支冠狀動脈血管狹窄程度大于50%，且伴隨原發(fā)性高血壓，符合《中國高血壓防治指南》中原發(fā)性高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即收縮壓≥140mmHg和（或）舒張壓≥90mmHg，在第1次診斷后的2個(gè)月內(nèi)3次偶測血壓值均符合上述標(biāo)準(zhǔn)。對照組選擇齊齊哈爾中醫(yī)醫(yī)院健康體檢中心的80例健康體檢者，無高血壓家族史、無原發(fā)性高血壓（血壓收縮壓≤140mmHg且舒張壓≤90mmHg）、冠狀動脈造影術(shù)后排除冠心病或者無冠心病史。兩組排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性高血壓患者，合并惡性腫瘤、嚴(yán)重心、肝、腎疾病患者，其他重大疾病患者。所有研究對象均為中國北方高寒地區(qū)漢族人群，研究個(gè)體之間無血緣關(guān)系。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料采集 通過問卷調(diào)查方式采集研究對象的一般情況，包括年齡、性別、職業(yè)、既往病史、吸煙史、飲酒史、糖尿病史等。記錄研究對象的血壓值。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測 研究對象入院后于清晨空腹靜脈采血3ml，置于含有EDTA抗凝采血管中，分裝保存于-80℃冰箱備用。對收集的血液樣本進(jìn)行血清總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglycerides，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（Highdensity lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）及空腹血糖（Fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）檢測。

1.2.3 DNA提取及檢測 對采集的靜脈血樣本使用全血基因組DNA提取試劑盒（愷碩RC1001）進(jìn)行全血DNA提取。引物均由上海天昊生物有限公司合成，采用改進(jìn)的imLDR（improved multiplex ligation detection reaction，iMLDR）技術(shù)進(jìn)行SNP檢測。rs70 25417的預(yù)期擴(kuò)增片段在417bp左右，其序列引物中正向引物5'-TGGGCACACTGATATTGCTGACTC-3'，反向引物5'-CCTCCACCCCACGCTTCA-3'。rs1041973的預(yù)期擴(kuò)增片段在295bp左右，其序列引物中正向引物5'-TAAACAATCATGGGGCCTGGAA-3'，反向引物5'-AATGAAAGCAAGGGCAGCTCAG-3'PCR反應(yīng)體系為2x GC-I buffer 10μl，dNTP（2.5mM）2.4ml，MgCl2（25mM）0.4μl，Probe Mix 1.0μl，HotStarTaq（5U/μl）0.2μl，ddH2O 5.0μl，模板DNA 1μl組成。在熒光PCR擴(kuò)增儀上按以下程序運(yùn)行：預(yù)變性95℃2min，變性94℃ 20s，退火65℃ 40s（-0.5℃/cycle），延伸72℃ 1.5min，循環(huán)11次，再次變性94℃ 20s，退火59℃ 30s，延伸72℃ 1.5min，循環(huán)24次，末次延伸72℃ 2.0min，待反應(yīng)管冷卻至4℃。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，多因素相關(guān)分析采用二元非條件Logistic回歸分析方法，計(jì)算各研究因素的比值比（Odds ratio，OR）。以雙側(cè)P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 病例組患者年齡高于對照組（P=0.007）。病例組患者血清TC、LDL-C、FPG明顯升高，同時(shí)病例組患者糖尿病患者比例明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組男性比例、吸煙史、飲酒史及TG、HDL-C水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組基因型和等位基因突變頻率分布比較 兩組IL-33基因rs7025417多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布、顯性模型（TT vs CT+CC）、隱性模型（CC vs CT+TT）、等位基因分布頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。兩組IL1RL1基因rs1041973多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布、顯性模型、隱性模型、相加模型及等位基因比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 IL-33及IL1RL1基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因的分布情況（n）

2.3 EH合并CHD危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析 以分類變量有無EH及CHD為因變量，將年齡、性別、吸煙、飲酒、糖尿病史、血糖、血脂生化指標(biāo)等危險(xiǎn)因素作為自變量引入二元多因素Logistic回歸模型。分析后發(fā)現(xiàn)攜帶rs7025417位點(diǎn)CT型基因者發(fā)生EH合并CHD的風(fēng)險(xiǎn)是CC型者的4.116倍[OR=4.116，95%CI（1.188，14.252），P=0.026]，TT型者是CC型者的2.421倍[OR=2.421，95%CI（1.028，5.699），P=0.043]，見表3。

表3 EH合并CHD危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

3 討論

EH與CHD之間存在著重要的病理生理聯(lián)系，發(fā)病機(jī)制較多。合并高血壓的CHD患者死亡率是單純CHD患者的2.3倍[6]。其中，動脈內(nèi)生長因子及炎癥細(xì)胞因子表達(dá)增加是高血壓形成的機(jī)制之一，故高血壓也被認(rèn)為是一種低級別炎癥性疾病[7]。同時(shí)促炎細(xì)胞因子促進(jìn)動脈粥樣硬化病變的形成與發(fā)展，加重動脈粥樣硬化過程，使動脈粥樣硬化斑塊更加不穩(wěn)定[8]。因此，對EH合并CHD發(fā)病人群進(jìn)行基因檢測，可以為識別、評估具有危險(xiǎn)因素患者的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及靶向治療提供重要依據(jù)。

人類的IL-33基因位于染色體9q24.1，編碼的氨基酸有270個(gè)。IL1RL1基因位于染色體2q12.1，可編碼的氨基酸有556個(gè)[9]。IL-33基因編碼的蛋白質(zhì)是一類與IL1RL1/ST2受體結(jié)合的細(xì)胞因子，其參與Th2細(xì)胞的成熟和肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活化[10]。其中白細(xì)胞介素33（IL-33）是近年來發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素1（IL-1）細(xì)胞因子家族的新成員，是一種起到“警報(bào)”、“危險(xiǎn)信號”作用的核相關(guān)多功能細(xì)胞因子，主要由內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生[11]。其受體白介素1受體樣1（IL1RL1）也被稱為ST2，是IL-1/toll樣超家族的成員，它作為一種潛在的生物標(biāo)志物亦受到了廣泛關(guān)注[12]。IL-33具有生物學(xué)活性，一方面，當(dāng)細(xì)胞壞死或者細(xì)胞損傷時(shí)，從細(xì)胞中釋放出來后與IL1RL1結(jié)合，通過旁分泌途徑發(fā)揮抗炎作用；另一方面，細(xì)胞凋亡時(shí)，由于IL-33被Caspase滅活而不會被激活，因此不產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[13]。有報(bào)道抑制內(nèi)皮細(xì)胞IL-33可增加高血壓引起的心肌肥厚和心肌纖維化發(fā)病率，而給予IL-33相關(guān)治療可逆轉(zhuǎn)這些影響，從而提高存活率，動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IL-33可減輕Apoe-/-小鼠的動脈粥樣硬化，可加重sST2[14]。關(guān)于IL-33、IL1RL1基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓及冠心病的研究甚少，為此展開了本研究。

本研究通過IL-33基因rs7025417基因型分布頻率發(fā)現(xiàn)，疾病組rs7025417的TT基因型和T型等位基因分布頻率顯著高于對照組。通過對EH合并CHD發(fā)病危險(xiǎn)因素包括年齡、性別、吸煙、飲酒、糖尿病史、各項(xiàng)血脂指標(biāo)等進(jìn)行調(diào)整后，通過二元多因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)rs7025417位點(diǎn)的TT基因型仍然是EH合并CHD患者發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示IL-33基因中rs7025417位點(diǎn)的T等位基因與中國北方高寒地區(qū)漢族人群EH合并CHD的發(fā)生密切相關(guān)，可以作為疾病發(fā)生的危險(xiǎn)遺傳標(biāo)記，可能是一個(gè)有希望的預(yù)測EH合并CHD的新標(biāo)志物。而IL1RL1基因rs1041973單核苷酸多態(tài)性在本研究中并未表達(dá)出相關(guān)性。本研究尚存在一定的局限性：第一，樣本量較少，加上基因表達(dá)具有個(gè)體差異，在后續(xù)的研究中還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證，或者進(jìn)行前瞻性隊(duì)列研究深入探討。第二，飲食因素與EH合并CHD發(fā)病具有一定的相關(guān)性，如高鹽飲食促進(jìn)高血壓發(fā)病，高脂飲食是粥樣硬化性疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在研究中未納入飲食因素分析。

綜上所述，本研究選擇中國北方高寒地區(qū)漢族人群EH合并CHD患者及健康體檢人群作為研究對象，比較分析了IL-33基因rs7025417多態(tài)性及IL1RL1基因rs1041973多態(tài)性在兩組人群中的分布情況，明確了中國北方高寒地區(qū)漢族人群rs7025417位點(diǎn)的T等位基因攜帶者，尤其是TT基因型，容易罹患EH合并CHD。然而IL-33基因、IL1RL1基因多態(tài)性與EH及CHD的發(fā)病機(jī)制并不十分明確，還需要進(jìn)一步探究。