劉江華 臧博倫 劉煒 李彥格

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（Neuroblastoma，NB）起源于腎上腺髓質(zhì)或椎旁交感神經(jīng)節(jié)，發(fā)病率約為1.01/10萬(wàn)，是兒童期最常見(jiàn)的顱外實(shí)體腫瘤，占相關(guān)兒童腫瘤死亡的15%[1]。NB起病隱匿，超過(guò)50%的患兒診斷時(shí)即為高危，其長(zhǎng)期生存率不足50%[2]，因此探討影響高危NB療效的危險(xiǎn)因素具有重要意義。配對(duì)同源異型盒蛋白2B（paired-like homebox 2B，PHOX2B）是一種在外周交感神經(jīng)系統(tǒng)中具有高度特異性的轉(zhuǎn)錄因子，最初在NB細(xì)胞株中被發(fā)現(xiàn)，研究表明PHOX2B參與了NB的發(fā)生發(fā)展[3]。雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂（disialoganglioside，GD2）是NB細(xì)胞上廣泛表達(dá)的高度特異性抗原，可作為NB診斷的敏感特異標(biāo)志物[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)高危NB患兒骨髓中PHOX2B及GD2的表達(dá)，分析其與臨床指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系，探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取我院2019年1月～2021年12月收治的新診高危NB患兒為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合NB診斷標(biāo)準(zhǔn)，危險(xiǎn)度分組符合美國(guó)兒童腫瘤協(xié)作組（COG）高危標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：外院接受過(guò)治療者。共60例患兒納入本研究。收集患兒的臨床資料，包括初診年齡、性別、NSE、LDH、24h尿VMA、原發(fā)部位、轉(zhuǎn)移部位、骨髓轉(zhuǎn)移情況（常規(guī)骨髓涂片或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性）、MYCN基因、1p36缺失、11q23缺失、分期、危險(xiǎn)度等。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患兒家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 PHOX2B基因檢測(cè) 采用定量RT-PCR（qPCR）法檢測(cè)患兒骨髓中PHOX2B基因的表達(dá)水平。PHOX2B基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司，按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作及結(jié)果判定。PCR擴(kuò)增條件：反應(yīng)體系為30μl，第一步：42℃，30min；94℃，5min。第二步：94℃，15s；60℃，1min，40個(gè)循環(huán)。在PCR循環(huán)第二步60℃時(shí)收集熒光信號(hào)。結(jié)果判定：將PHOX2B CT值≤34，21≤內(nèi)參CT值≤36判定為PHOX2B基因陽(yáng)性。

1.2.2 GD2蛋白檢測(cè) 采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)患兒骨髓標(biāo)本中GD2蛋白表達(dá)水平。采集患兒EDTA～K2抗凝骨髓液3～5ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞層，通過(guò)制片機(jī)甩片獲得4～6張細(xì)胞涂片，每張玻片約含細(xì)胞5×105個(gè)，采用兩步法進(jìn)行GD2染色[6]。陽(yáng)性細(xì)胞判定及計(jì)數(shù)：抗GD2抗體結(jié)合位點(diǎn)主要在細(xì)胞膜上，故將圍繞細(xì)胞膜出現(xiàn)紅色顆粒樣沉淀（胞質(zhì)或可染色）判為陽(yáng)性，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3 治療及療效評(píng)估 參照兒童NB診療專家共識(shí)進(jìn)行治療和療效評(píng)估[5]。高?；純合然?約4個(gè)療程)后擇期手術(shù)，術(shù)后化療至VGPR后4個(gè)療程，總療程不超過(guò)8個(gè)，常規(guī)化療結(jié)束后行自體干細(xì)胞移植和瘤床放療?；熃Y(jié)束后口服13-順式-維甲酸維持治療6個(gè)月。

1.4 隨訪 通過(guò)門(mén)診、電話或再入院方式隨訪，隨訪終點(diǎn)截至發(fā)生事件的時(shí)間或末次隨訪時(shí)間。事件包括疾病進(jìn)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡，超過(guò)6個(gè)月未隨訪定義為失訪。隨訪時(shí)間截至2022年3月31日。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（P25，P75）表示，計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，樣本率的比較用卡方檢驗(yàn)。生存率計(jì)算采用Kaplan Meier法，各組生存率比較應(yīng)用Log-Rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共60例高危NB患兒納入本研究，其中男32例，女28例，男女之比為1.14：1；中位年齡29個(gè)月（10～120個(gè)月），患兒的臨床特征見(jiàn)表1。

表1 60例高危NB患兒的臨床特征

續(xù)表1

2.2 PHOX2B、GD2與臨床指標(biāo)的關(guān)系 PHOX2B基因陽(yáng)性組原發(fā)部位為腹部者（33/38，86.8%）比例顯著高于PHOX2B基因陰性組（14/22，63.6%），PHOX2B基因陽(yáng)性組腫瘤轉(zhuǎn)移部位數(shù)＞2個(gè)（30/38，78.9%）患兒比例顯著高于PHOX2B基因陰性組（8/22，36.4%），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GD2蛋白陽(yáng)性組原發(fā)部位為腹部者（28/31，90.3%）比例顯著高于GD2蛋白陰性組（19/29，65.5%），GD2蛋白陽(yáng)性組腫瘤轉(zhuǎn)移部位數(shù)＞2個(gè)（24/31，77.4%）患兒比例顯著高于GD2蛋白陰性組（14/29，48.3%），GD2蛋白陽(yáng)性組24h尿VMA升高患兒比例（15/31，48.4%）顯著高于GD2蛋白陰性組（6/29，20.7%），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PHOX2B基因陽(yáng)性組與PHOX2B基因陰性組在年齡、性別、LDH、NSE、24h尿VMA、INSS分期、MYCN基因擴(kuò)增方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。GD2陽(yáng)性與陰性標(biāo)本免疫細(xì)胞化學(xué)染色見(jiàn)圖1。GD2蛋白陽(yáng)性組與GD2蛋白陰性組在年齡、性別、LDH、NSE、INSS分期、MYCN基因擴(kuò)增方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

圖1 GD2免疫細(xì)胞染色圖（×400）

表2 PHOX2B及GD2的表達(dá)與高危NB臨床特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 PHOX2B及GD2與高危NB預(yù)后的關(guān)系PHOX2B基因陽(yáng)性組2年無(wú)事件生存率（EFS）顯著低于基因陰性組（χ2=6.208，P=0.013），GD2蛋白陽(yáng)性組2年EFS顯著低于蛋白陰性組（χ2=4.012，P=0.045），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組患兒的生存曲線見(jiàn)圖2。

圖2 不同組別患兒的生存曲線

3 討論

NB占嬰幼兒惡性腫瘤的8%～10%，具有很強(qiáng)的異質(zhì)性，可自行消退，也可迅速進(jìn)展至多發(fā)轉(zhuǎn)移甚至死亡。目前經(jīng)過(guò)以危險(xiǎn)度分層為依據(jù)的個(gè)體化治療，低危至中危NB患兒生存率可達(dá)85%，但高危患兒即使經(jīng)過(guò)化療、手術(shù)、放療、自體造血干細(xì)胞移植、免疫治療等綜合治療，仍有60%的復(fù)發(fā)率[7]，復(fù)發(fā)后患兒的中位生存期僅為11個(gè)月[8]。骨髓微小殘留病（MRD）的存在及初診時(shí)不精準(zhǔn)的危險(xiǎn)度分層是NB復(fù)發(fā)的重要原因，因此盡早發(fā)現(xiàn)骨髓MRD并依此調(diào)整危險(xiǎn)度分層指導(dǎo)治療至關(guān)重要。

PHOX2B是一種特異表達(dá)于外周交感神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄因子，其編碼基因位于染色體4p13，有研究表明，NB小鼠模型中PHOX2B的高表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，這種作用是通過(guò)誘導(dǎo)酪氨酸羥化酶及多巴胺羥化酶的表達(dá)調(diào)控原始神經(jīng)嵴細(xì)胞向成熟神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育實(shí)現(xiàn)的[9]。PHOX2B在外周NB患者骨髓中高表達(dá)，在其它類型小圓藍(lán)細(xì)胞腫瘤及正常組織中無(wú)表達(dá)，可作為區(qū)分外周神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤和中樞神經(jīng)胚胎性腫瘤的指標(biāo)[10]。既往PHOX2B檢測(cè)多用于病理免疫組化中，體液標(biāo)本中應(yīng)用qPCR方法檢測(cè)少見(jiàn)。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)骨髓中PHOX2B的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高危NB患者骨髓中PHOX2B陽(yáng)性表達(dá)占63.3%，為研究PHOX2B在NB中的作用提供了不同的檢測(cè)方法，有望推廣應(yīng)用于臨床。另有研究表明[11]在高危NB中PHOX2B基因的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)80.8%，隨著原發(fā)瘤灶的減小，PHOX2B基因拷貝數(shù)也明顯降低。本研究發(fā)現(xiàn)PHOX2B基因陽(yáng)性表達(dá)組腫瘤轉(zhuǎn)移部位數(shù)＞2個(gè)者患兒比例顯著高于基因陰性組（χ2=10.880，P=0.001），EFS顯著低于基因陰性組（χ2=6.208，P=0.013），提示PHOX2B可能參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程并可作為評(píng)判預(yù)后的指標(biāo)，與上述報(bào)道一致，有望作為NB轉(zhuǎn)移防治的靶點(diǎn)。

GD2主要在神經(jīng)外胚層腫瘤中表達(dá)，在NB細(xì)胞中100%高表達(dá)，正常組織中幾乎不表達(dá)，檢測(cè)骨髓GD2的表達(dá)對(duì)診斷NB骨髓轉(zhuǎn)移有較高的敏感性和特異性[12]。目前國(guó)際NB危險(xiǎn)度分級(jí)協(xié)作組（International neuroblastoma risk group，INRG）推薦使用免疫細(xì)胞學(xué)檢測(cè)GD2抗原[13]。本研究利用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)高危NB患兒骨髓標(biāo)本中GD2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GD2陽(yáng)性表達(dá)組較陰性組原發(fā)灶為腹部者多，可能與腹部起病隱匿，診斷時(shí)即發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者多、腹部NB發(fā)病率高、本研究其它部位NB病例數(shù)較少等因素有關(guān)，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究證實(shí)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)GD2陽(yáng)性表達(dá)組腫瘤轉(zhuǎn)移部位數(shù)＞2個(gè)（χ2=5.480，P=0.019）、24h尿VMA升高（χ2=5.053，P=0.025）患兒比例顯著高于GD2蛋白陰性組，上述兩種指標(biāo)反映了腫瘤的惡性程度及負(fù)荷，提示骨髓GD2的表達(dá)量可作為評(píng)估NB增殖和轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。通過(guò)生存分析發(fā)現(xiàn)，GD2蛋白陽(yáng)性組較陰性組有更低的EFS，提示骨髓GD2檢測(cè)可作為NB預(yù)后監(jiān)測(cè)的指標(biāo)。

綜上，本研究檢測(cè)了高危NB患兒骨髓PHOX2B及GD2的表達(dá)，并分析其與NB臨床特征及療效的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PHOX2B及GD2陽(yáng)性組較陰性組有更低的EFS，提示骨髓PHOX2B及GD2檢測(cè)有望作為高危NB微小殘留病監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)。本研究的局限性在于骨髓穿刺為有創(chuàng)操作，建議在初診、評(píng)估及考慮復(fù)發(fā)時(shí)使用，如腫瘤負(fù)荷較高，可嘗試采用外周血標(biāo)本替代。