余紀(jì)會(huì),高 稅,王曉瓊 (.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院健康管理中心，重慶 40006;.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬長(zhǎng)壽人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 4000)

原發(fā)性支氣管肺癌簡(jiǎn)稱肺癌，基于不同的組織病理學(xué)分型，肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC包括腺癌和鱗狀細(xì)胞癌兩種亞型[1-2]。目前，肺癌仍然是威脅人類生命和健康的惡性腫瘤之一，并且發(fā)病率呈現(xiàn)出上升之勢(shì)[3-5]。肺癌的早期診斷率不到20%，75%的肺癌患者確診時(shí)已處于中晚期[6]。早期肺癌的治療通常選擇手術(shù)切除，晚期肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)主要采用化療、靶向治療和化療聯(lián)合免疫治療[7-8]。盡管近年來肺癌的研究取得了很大的進(jìn)展，但是患者的5年生存率仍未見明顯提高[9-11]，因此，有必要對(duì)肺癌的機(jī)制進(jìn)行深入探討。

Rab相互作用溶酶體蛋白(Rab interacting lysosomal protein，RILP)是內(nèi)吞途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，在內(nèi)體—溶酶體運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[12-13]。既往研究顯示，RILP可通過影響癌細(xì)胞的侵襲和遷移促進(jìn)癌癥進(jìn)展，包括乳腺癌[14]、肝細(xì)胞癌[15]、宮頸癌[16]。然而RILP與NSCLC的關(guān)系既往少有報(bào)道。基因異常表達(dá)對(duì)癌癥病因?qū)W至關(guān)重要，遺傳和表觀遺傳變化的聯(lián)合作用促進(jìn)了人類癌癥的發(fā)展[17]?；蚣谆鳛楸碛^遺傳修飾的關(guān)鍵元素，在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和致癌過程中起著重要作用[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn)，RILP甲基化可能影響肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移[20]，但其具體機(jī)制尚未明確。本研究通過分析肺癌患者中RILP的表達(dá)水平和甲基化狀態(tài)，旨在探討其與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以及其作為肺癌早期診斷指標(biāo)的可能性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

納入2018年3月至2020年3月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬長(zhǎng)壽人民醫(yī)院收治的88例原發(fā)性肺癌患者，均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。其中男50例，女38例；年齡(65.09±6.24)歲；鱗狀細(xì)胞癌48例，腺癌40例；低分化38例，中分化38例，高分化12例；腫瘤分期Ⅰ期36例，Ⅱ期25例，Ⅲ期25例，Ⅳ期2例。術(shù)中留取肺癌組織及相應(yīng)的癌旁組織(距離肺癌組織≥5 cm)。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬長(zhǎng)壽人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2018003)，患者均簽署知情同意書。

1.2 肺癌細(xì)胞系及培養(yǎng)

選取5種肺癌細(xì)胞系(H1299、A549、H358、H1993和H460)和正常肺上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)，在含10%胎牛血清的RPMI 1640(Gibico，美國(guó))中培養(yǎng)。細(xì)胞在T75規(guī)格培養(yǎng)瓶中達(dá)到80%融合后以1∶3傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至3～5代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將10 μmol/L 5-氮雜-2脫氧胞苷添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，參照細(xì)胞去甲基化處理試劑盒(Sigma公司，美國(guó))對(duì)細(xì)胞進(jìn)行去甲基化處理。

1.3 免疫組化染色檢測(cè)RILP表達(dá)

肺癌組織及癌旁組織標(biāo)本以福爾馬林固定，石蠟包埋，采用切片機(jī)將包埋的組織蠟塊連續(xù)切成 4 μm厚的切片。石蠟切片采用二甲苯脫蠟，分級(jí)乙醇脫水，然后用3%過氧化氫使其內(nèi)源性過氧化物酶活性猝滅30 min，采用10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)2 min，隨后以磷酸鹽緩沖液沖洗切片，再用山羊血清封閉15 min，將載玻片與兔抗RILP一抗(Proteintech，美國(guó))以1∶200的稀釋度在4 ℃下孵育過夜，磷酸鹽緩沖液清洗后，在室溫下使用生物素化辣根過氧化物酶羊抗鼠/兔二抗孵育20 min。切片用3,3’-二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物孵育5 min，隨后在自來水下清洗并用蘇木精復(fù)染。最后，通過顯微鏡觀察切片組織中的RILP蛋白表達(dá)。每張切片隨機(jī)取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞比例判斷RILP表達(dá)情況。染色為陰性記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；陽性細(xì)胞數(shù)為0～10%記1分，11%～50%記2分，51%～80%記3分，81%～100%記4分，將二者評(píng)分相乘得出最終結(jié)果：0分為陰性，1～3分為弱陽性，4～8分為中等陽性，9～12分為強(qiáng)陽性。其中0～3分為低表達(dá)，4～12分為高表達(dá)。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)RILP mRNA表達(dá)

根據(jù)產(chǎn)品說明書，使用TRIZOL試劑(Invitrogen，美國(guó))從肺癌組織及癌旁組織中提取總RNA；從肺癌細(xì)胞系(H1299、A549、H358、H1993和H460)和正常肺上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)中提取細(xì)胞總RNA。采用iScript-cDNA合成試劑盒(Bio-Rad公司，美國(guó))合成單鏈cDNA。用SYBR-Green PCR試劑盒(Bio-Rad公司，美國(guó))進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并使用CFX96實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 35 s，39個(gè)循環(huán)。40 ℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào)，PCR產(chǎn)物經(jīng)熔融曲線分析驗(yàn)證。使用2-ΔΔct法，通過管家基因β-actin值計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 擴(kuò)增引物序列表

1.5 甲基化特異性PCR檢測(cè)RILP基因的甲基化

為了驗(yàn)證RILP基因水平是否受DNA甲基化調(diào)控，通過甲基化特異性PCR對(duì)肺癌細(xì)胞系(H1299、A549、H358、H1993和H460)、肺癌組織以及癌旁組織進(jìn)行甲基化檢測(cè)。采用DNA提取試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)提取肺癌組織、癌旁組織和肺癌細(xì)胞系DNA，并以瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的DNA進(jìn)行驗(yàn)證。利用EpiMethy DNA甲基化檢測(cè)試劑盒(銳賽生物醫(yī)藥科技有限公司，上海)對(duì)產(chǎn)物修飾處理后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物序列見表2。分析肺癌患者臨床資料與RILP甲基化的關(guān)系。

表2 擴(kuò)增引物序列表

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

轉(zhuǎn)染前，A549細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)24 h。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒(賽默飛，美國(guó))說明書，用空載體或人源RILP表達(dá)載體(淼靈生物科技有限公司，武漢)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。取轉(zhuǎn)染后對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以每孔800個(gè)細(xì)胞接種到6孔板中，以含500 μg/mL G418的生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每24 h換液。14 d后用75%乙醇固定細(xì)胞30 min，并用0.2%結(jié)晶紫染色進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RILP在肺癌組織及肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示，肺癌組織RILP高表達(dá)率為13.64%(12/88)，癌旁組織RILP高表達(dá)率為76.14%(67/88)，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 RILP的免疫組化染色圖

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，癌旁組織RILP mRNA表達(dá)水平高于肺癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2a。正常肺上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)中RILP mRNA表達(dá)水平高于肺癌細(xì)胞系(H1299、A549、H358、H1993和H460)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2b。

a:癌旁組織和肺癌組織的RILP mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較；b:正常肺上皮細(xì)胞系和肺癌細(xì)胞系RILP mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 *：與癌旁組織比較，P<0.05；**：與BEAS-2B比較，P<0.01；***：與BEAS-2B比較，P<0.001

2.2 RILP基因甲基化檢測(cè)

與正常肺上皮細(xì)胞系(BEAS-2B)相比，RILP基因在肺癌細(xì)胞系(H1299、A549、H358、H1993和H460)中出現(xiàn)了明顯的甲基化，見圖3a；在肺癌組織中也出現(xiàn)了不同程度的RILP基因甲基化，而癌旁組織未發(fā)生RILP基因甲基化，肺癌組織與癌旁組織比較，出現(xiàn)較為明顯的基化條帶，見圖3b。為進(jìn)一步探討甲基化對(duì)RILP基因表達(dá)的調(diào)控，用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理肺癌細(xì)胞系(H1299、A549、H358、H1993和H460)，結(jié)果顯示去甲基化處理后RILP基因表達(dá)水平升高(圖3c)，說明RILP受甲基化調(diào)控。

a:正常肺上皮細(xì)胞系和肺癌細(xì)胞系中RILP基因甲基化檢測(cè)結(jié)果；b:肺癌組織及癌旁組織中RILP基因甲基化檢測(cè)結(jié)果；c:去甲基化處理后肺癌細(xì)胞系中RILP基因的表達(dá) U：非甲基化特異性引物；M：甲基化特異性引物；-：未甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理；+：甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理

2.3 RILP基因甲基化與肺癌患者臨床特征的相關(guān)性

60.23%(53/88)的肺癌患者發(fā)生RILP基因甲基化，39.77%(35/88)未發(fā)生甲基化。RILP甲基化與RILP非甲基化患者腫瘤分化程度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。提示RILP基因甲基化與肺癌惡性程度相關(guān)。

表3 肺癌患者一般臨床資料與RILP甲基化的關(guān)系(例)

2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)估RILP對(duì)肺癌細(xì)胞的影響

A549細(xì)胞過表達(dá)RILP基因后，其增殖能力明顯受到抑制(P<0.05)，見圖4。提示RILP有明顯的抑癌作用。

a:各組細(xì)胞菌落圖片;b:各組克隆細(xì)胞數(shù)比較 ***:與空載體比較，P<0.001

3 討論

臨床上，只有不到20%的肺癌患者獲得早期診斷[5]。盡管引入了低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描并實(shí)施了肺癌篩查計(jì)劃，但就發(fā)病率和病死率而言，肺癌仍然是全世界癌癥患者特異性死亡的主要原因[3]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在廣泛的遺傳變化和相關(guān)的基因功能及活動(dòng)失調(diào)，其中DNA甲基化是表征最好的表觀遺傳修飾元素之一，DNA甲基化可影響基因表達(dá)和基因組穩(wěn)定性，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要影響[18]。越來越多的研究顯示，組織、血液，甚至氣道脫落上皮細(xì)胞的甲基化狀態(tài)有望成為診斷肺癌的生物學(xué)標(biāo)志物[21-22]。

RILP作為囊泡運(yùn)輸?shù)姆肿娱_關(guān)，在囊泡形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、黏附和融合過程中起著重要作用[12]。RILP通過其羧基末端區(qū)域與活化的三磷酸鳥苷結(jié)合，進(jìn)一步與動(dòng)力蛋白—?jiǎng)恿Φ鞍走\(yùn)動(dòng)復(fù)合體的黏合亞單位相互作用，以調(diào)控細(xì)胞質(zhì)中的晚期內(nèi)體或溶酶體的分布[12-13]。細(xì)胞遷移是一個(gè)對(duì)細(xì)胞極為重要的過程，由幾個(gè)整合高度調(diào)節(jié)的事件組成，如細(xì)胞骨架重排、不對(duì)稱極化、細(xì)胞黏附和擴(kuò)散[23]。有研究表明，膜轉(zhuǎn)運(yùn)的改變可以影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，是人類癌癥發(fā)展的重要原因之一[24]。另有研究顯示，RILP在乳腺癌中能起到腫瘤抑制作用，RILP的缺失會(huì)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[14]。還有研究顯示，沉默RILP也能加速肺癌細(xì)胞H1299遷移，提示RILP可能作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用[25]。本研究結(jié)果顯示，RILP在肺癌組織和肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)均顯著下調(diào)，提示RILP可能作為腫瘤抑制因子參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。

腫瘤抑制基因啟動(dòng)子CpG島中的異常DNA甲基化被認(rèn)為是基因下調(diào)的主要機(jī)制，這會(huì)促使正常細(xì)胞發(fā)生癌變[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中RILP基因出現(xiàn)高甲基化，并且與腫瘤分化程度有關(guān)，提示RILP基因甲基化程度與肺癌惡性程度相關(guān)。本研究通過對(duì)肺癌細(xì)胞系甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理后，RILP基因在5種肺癌細(xì)胞系中表達(dá)增加，說明RILP受甲基化調(diào)控。以上結(jié)果提示，基因甲基化機(jī)制可能是肺癌細(xì)胞中RILP表達(dá)調(diào)控的主要分子機(jī)制。本研究中克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RILP可抑制肺癌細(xì)胞增殖，表明RILP在肺癌發(fā)生中具有抑制作用。提示RILP有望成為診斷肺癌的生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，RILP可能作為抑癌基因在肺癌中發(fā)揮作用，并且受甲基化調(diào)控。本研究初步證明了RILP是肺癌潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)肺癌早期診斷存在提示作用。然而本研究也存在一些局限性，如未分析RILP下游信號(hào)通路的變化，未對(duì)肺癌患者進(jìn)行隨訪，沒有分析RILP及其甲基化與患者生存預(yù)后的關(guān)系。未來需要開展細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，深入分析RILP的作用機(jī)制。