安紅梅,王麗娟,李春揚(yáng),何蕙園,謝精精

(1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京 100015; 2.中輕檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司,北京 100015)

二苯胺是一種常見的殺菌劑、保鮮劑,其能引起變性血紅素癥,為可疑致癌物[1]。歐盟嚴(yán)格規(guī)定了各類食品中二苯胺的限量,其中乳制品中二苯胺的限量為0.05 mg·kg-1[2]。GB 2763-2021[3]《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》僅規(guī)定了生乳中二苯胺的殘留限量(0.01 mg·kg-1),并無(wú)乳粉中殘留限量的規(guī)定。為全面評(píng)估乳粉進(jìn)出口風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)持續(xù)有效監(jiān)控乳粉中二苯胺的殘留量。

目前,乳制品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法(GC)[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[5-6]、氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[7-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[9-10]等。雖然文獻(xiàn)報(bào)道的乳制品中的檢測(cè)對(duì)象種類繁多,但均未涉及二苯胺[1]。國(guó)內(nèi)乳粉中二苯胺的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有GB/T 23210-2008《牛奶和奶粉中511種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法》[11]和GB/T 23211-2008《牛奶和奶粉中493種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[12]。受制于試驗(yàn)成本等因素,GB/T 23210-2008所采用的GC-MS的應(yīng)用較為廣泛,但是該標(biāo)準(zhǔn)存在一定局限性,比如易受基質(zhì)干擾,容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果等問(wèn)題,故標(biāo)準(zhǔn)要求采用空白基質(zhì)匹配法補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng),但通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法很難得到二苯胺空白基質(zhì)。鑒于此,本工作對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 23210-2008的前處理方法進(jìn)行改進(jìn),以乙腈作提取溶劑,以石墨化碳黑-氨基復(fù)合固相萃取柱(Carb/NH2小柱)凈化,以GC-MS檢測(cè),外標(biāo)法定量。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高,避免了GB/T 23210-2008易出現(xiàn)的假陽(yáng)性現(xiàn)象,能夠滿足乳粉中二苯胺殘留量日常監(jiān)控的需求。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-QP2020 型氣相色譜-質(zhì)譜儀;GCMSTQ8040型氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀;DC-12型氮?dú)獯蹈蓛x;RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;R-104 型均質(zhì)器;十八烷基鍵合硅膠固相萃取柱(C18小柱,2 000 mg/12 mL);弗羅里硅土(Florisil)固相萃取柱(Florisil小柱,1 000 mg/6 mL);Carb/NH2小柱(500 mg/6 mL)。

二苯胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100 mg·L-1,于4 ℃條件下儲(chǔ)存。

二苯胺標(biāo)準(zhǔn)中間使用液:10.0 mg·L-1,以正己烷稀釋二苯胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制而成,于4 ℃條件下儲(chǔ)存。

二苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量二苯胺標(biāo)準(zhǔn)中間使用液,用正己烷逐級(jí)稀釋,配制成0.01,0.02,0.05,0.10,0.50,1.00 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,于4 ℃條件下儲(chǔ)存。

乙腈、正己烷、丙酮、乙酸乙酯均為色譜純;10種乳粉樣品(包含6 種國(guó)產(chǎn)乳粉和4 種進(jìn)口乳粉)均購(gòu)自當(dāng)?shù)厮幍?、超市?/p>

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

DB-17MS 石英毛細(xì)管色譜柱(30 m ×0.25 mm,0.25μm);載氣為氦氣,純度為99.999%;恒線速率模式,線速率39.8 cm·s-1;進(jìn)樣口溫度290 ℃;不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣量1μL。柱升溫程序:初始溫度55 ℃;以30 ℃·min-1升溫至130 ℃;以10 ℃·min-1升溫至290 ℃,保持8 min;總運(yùn)行時(shí)間為26.5 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源;電離能量70 e V;離子源溫度230 ℃;接口溫度280℃;溶劑延遲時(shí)間5 min;選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式;掃描離子質(zhì)荷比(m/z)169,168,167,第一個(gè)離子為定量離子。

1.3 試驗(yàn)方法

將3 g(精確至0.01 g)乳粉樣品置于50 mL 具塞離心管中,加入20 mL乙腈和5 g氯化鈉,用均質(zhì)器均質(zhì)2 min,以4 200 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min,上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 雞心瓶中。用20 mL 乙腈重復(fù)提取一次,合并上清液,于40℃旋蒸至1 mL。用體積比3∶1 乙腈-甲苯混合溶液5 mL 潤(rùn)洗Carb/NH2小柱,保持柱體濕潤(rùn),將上述溶液過(guò)柱,收集流出液。用體積比3∶1乙腈-甲苯混合溶液5 mL 洗滌雞心瓶,洗滌液過(guò)柱,再加入體積比3∶1乙腈-甲苯混合溶液20 mL洗脫柱子,收集流出液。凈化過(guò)程控制流出速率為1 mL·min-1,合并流出液,于40℃水浴中旋蒸至近干,氮?dú)獯蹈?用1 mL乙酸乙酯溶解后按照儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

按照儀器工作條件測(cè)定二苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,保留時(shí)間為10.0 min,其色譜圖見圖1。

圖1 二苯胺的色譜圖Fig.1 Chromatogram of diphenylamine

2.2 提取條件的選擇

試驗(yàn)比較了分別以丙酮、乙腈、體積比1∶1乙酸乙酯-正己烷混合溶液作為乳粉中二苯胺的提取溶劑時(shí)的提取效果。結(jié)果表明,除乙腈外,其他提取溶劑均會(huì)提取出大量脂肪,給后續(xù)凈化帶來(lái)較大負(fù)擔(dān),故試驗(yàn)選擇以乙腈作為提取溶劑。

另外,GB/T 23210-2008 在提取時(shí)會(huì)加入一定量的無(wú)水硫酸鎂用于除水,因此試驗(yàn)比較了加入無(wú)水硫酸鎂前后加標(biāo)樣品中二苯胺回收率的變化。結(jié)果表明,加入無(wú)水硫酸鎂前后,二苯胺的回收率無(wú)顯著差異,推測(cè)與乳粉屬于干性樣品且二苯胺在水中溶解度極低有關(guān)。因此,試驗(yàn)選擇在提取時(shí)不加無(wú)水硫酸鎂。

2.3 凈化柱的選擇

參照GB/T 23210-2008,以乙腈作提取溶劑,以C18小柱作凈化柱,在SIM 模式下(以m/z169作為定量離子,m/z167,168 作為定性離子)用GCMS測(cè)定10種市售乳粉中二苯胺的殘留量,以基質(zhì)匹配法定量。結(jié)果顯示,樣品中二苯胺的檢出率為100%,推測(cè)可能存在假陽(yáng)性現(xiàn)象。為驗(yàn)證這一推測(cè),參照GB/T 23210-2008,用GC-MS 對(duì)二苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和乳粉樣品溶液分別進(jìn)行質(zhì)譜全掃描。結(jié)果顯示,二苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜圖的基峰為m/z169,而樣品溶液質(zhì)譜圖中豐度比較高的峰分別在m/z73,169處,其中基峰為m/z73,提示有基質(zhì)干擾存在。進(jìn)一步用GC-MS/MS 進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜確認(rèn),所得二苯胺的定量離子對(duì)為m/z169.1/66.0,定性離子對(duì)為m/z167.1/139.1和m/z167.1/77.0,其中二苯胺標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖中3個(gè)離子對(duì)的豐度比為100∶99∶49,而樣品中的豐度比為100∶21∶16,說(shuō)明樣品中疑似二苯胺的物質(zhì)為干擾物質(zhì),即以GB/T 23210-2008檢出的二苯胺結(jié)果為假陽(yáng)性,可能原因?yàn)閲?guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法前處理過(guò)程凈化不完全,乳粉中的干擾物質(zhì)隨著待測(cè)物一起流出,造成基質(zhì)干擾。

Florisil小柱和Carb/NH2小柱均是農(nóng)殘分析常用的固相萃取凈化柱,其中前者成本較低,可用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析;后者上層是活性炭,脫色效果明顯,下層為富含氨基的物質(zhì),能和糖、蛋白質(zhì)、脂肪中的相關(guān)基團(tuán)形成氫鍵,從而去除基質(zhì)中大部分干擾物[13]。分別采用Florisil小柱和Carb/NH2小柱替代C18小柱凈化加標(biāo)樣品(加標(biāo)量為0.05 mg·kg-1)。其中,以Florisil小柱凈化時(shí),先分別用體積比1∶9 丙酮-正己烷混合溶液和正己烷各5 mL潤(rùn)洗Florisil小柱,保持柱體濕潤(rùn);將提取液氮吹至干,用2 mL正己烷復(fù)溶,過(guò)Florisil小柱,收集流出液,用體積比1∶9 丙酮-正己烷混合溶液5 mL洗滌雞心瓶,洗滌液過(guò)柱,加入體積比1∶9的丙酮-正己烷混合溶液5 mL 洗脫柱子;凈化過(guò)程控制流出速率為1 mL·min-1,合并流出液,于40 ℃旋蒸至近干,氮?dú)獯蹈?用1 mL 乙酸乙酯溶解,按照儀器工作條件測(cè)定。

結(jié)果顯示:Florisil小柱和Carb/NH2小柱所得二苯胺的回收率分別為129%和89.6%,前者所得回收率超出GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[14]關(guān)于回收率范圍的規(guī)定(加標(biāo)量小于0.1 mg·kg-1時(shí),回收率為60%～120%),說(shuō)明采用Carb/NH2小柱所得測(cè)定值的準(zhǔn)確度更高。

分別采用Florisil小柱和Carb/NH2小柱凈化空白樣品,比較了兩種凈化柱的雜質(zhì)去除效果,結(jié)果見圖2。

圖2 Florisil小柱和Carb/NH2 小柱凈化后空白樣品溶液的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of blank sample solutions purified by Florisil cartridge and Carb/NH2 cartridge

由圖2可知:經(jīng)Florisil小柱凈化后,空白樣品溶液分別在9.4,11.5 min處出現(xiàn)兩處峰展寬較大的雜質(zhì)峰,對(duì)色譜系統(tǒng)有潛在污染,儀器的維護(hù)成本高;而Carb/NH2小柱的凈化效果較好,并未出現(xiàn)峰展寬較大的雜質(zhì)峰。

乳粉基質(zhì)復(fù)雜,含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪和糖等[15],基質(zhì)干擾較大。參考文獻(xiàn)[16-19],進(jìn)一步比較了分別采用Florisil小柱和Carb/NH2小柱凈化時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)。分別用空白樣品溶液和正己烷配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液系列和標(biāo)準(zhǔn)溶液系列(濃度點(diǎn)均為0.01,0.02,0.05,0.10,0.50,1.00 mg·L-1),按 照儀器工作條件測(cè)定并進(jìn)行線性回歸。以前者標(biāo)準(zhǔn)曲線和后者標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的差值與后者標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(ME)值[20]。結(jié)果表明:Florisil小柱所得ME值為53.3%,顯示出強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)(ME值絕對(duì)值大于50%),應(yīng)通過(guò)一定補(bǔ)償措施來(lái)降低或消除,比如加入同位素標(biāo)記的目標(biāo)物、采用基質(zhì)匹配法、加入目標(biāo)物保護(hù)劑、增加凈化步驟或進(jìn)樣前稀釋等[15,20];Carb/NH2小柱所得ME 值為-5.3%,顯示出弱基質(zhì)效應(yīng)(ME 值絕對(duì)值不大于20%),可直接采用正己烷配制的二苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液系列定量[19]。

綜上,采用Carb/NH2小柱凈化時(shí),測(cè)定值準(zhǔn)確度高、樣品溶液中干擾物少且基質(zhì)效應(yīng)較弱,因此試驗(yàn)選擇以Carb/NH2小柱凈化樣品。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照儀器工作條件測(cè)定二苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以二苯胺質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.01～1.00 mg·L-1,線性回歸方程為y＝4.855×105x+1.350×103,相關(guān)系數(shù)為0.998 8。

以不小于3倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度計(jì)算檢出限,所得結(jié)果為3.4μg·kg-1。

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

對(duì)空白乳粉樣品進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)量分別為0.01,0.05,0.20 mg·kg-1,加標(biāo)后混勻并靜置2 h,按照試驗(yàn)方法分析,每個(gè)濃度水平均分析6個(gè)平行樣,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示,3個(gè)濃度水平下二苯胺的回收率分別為84.6%,88.1%,93.1%,測(cè)定值的RSD 分別為7.5%,5.5%,4.2%,精密度和準(zhǔn)確度均符合檢測(cè)要求[14]。

2.6 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析10種市售乳粉樣品,若為陽(yáng)性樣品,則用GC-MS/MS 進(jìn)行進(jìn)一步確證。結(jié)果顯示,10種乳粉樣品中均未檢出二苯胺,在一定程度上說(shuō)明市售乳粉中二苯胺殘留風(fēng)險(xiǎn)較低。

針對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 23210-2008假陽(yáng)性率高的現(xiàn)象,本工作改進(jìn)了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法,以Carb/NH2小柱代替C18小柱凈化樣品,用GC-MS測(cè)定,以普通外標(biāo)法代替基質(zhì)匹配法進(jìn)行定量。本方法簡(jiǎn)單、快速、精密度高、準(zhǔn)確度好,可用于乳粉中二苯胺殘留量的測(cè)定。