井中旭，劉雨薇，姜海波，劉焱南，秦國昭，馮宇飛*

星點設(shè)計效應(yīng)面法優(yōu)化趕山鞭總黃酮提取工藝及提取物指紋圖譜研究

井中旭1，劉雨薇2，姜海波2，劉焱南2，秦國昭2，馮宇飛2*

1. 黑龍江省中醫(yī)藥管理局，黑龍江 哈爾濱 150040 2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040

優(yōu)化趕山鞭總黃酮的提取工藝，建立趕山鞭總黃酮提取物的指紋圖譜。通過單因素實驗研究提取時間、提取次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比對趕山鞭中總黃酮含量及金絲桃苷的轉(zhuǎn)移率的影響；以此為基礎(chǔ)，采用Central- Composite試驗設(shè)計原理進行3因素5水平試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝。采用比色法，于500 nm處測定藥材中以蘆丁計總黃酮的含量，采用HPLC法測定總黃酮中金絲桃苷的含量，計算金絲桃苷的轉(zhuǎn)移率。采用HPLC法建立趕山鞭總黃酮提取物的指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012年版）》進行相似度評價，確定共有峰，并采用SPSS 22.0軟件進行聚類分析和主成分分析。趕山鞭總黃酮的最佳提取條件為以65%乙醇，料液比1∶10，提取120 min，提取2次。建立的趕山鞭藥材總黃酮提取物的HPLC指紋圖譜有15個共有指紋峰，指紋圖譜的相似度分析結(jié)果顯示相似度均大于0.61，表明10批樣品的化學(xué)成分一致性較好，但各成分含量存在差異，對部分色譜峰進行了歸屬指認(rèn)分別是金絲桃苷、槲皮素、蘆丁、山柰酚。聚類分析可知歐氏距離為25時，10批樣品可聚為2類，S1與S7為一類，其余聚為一類；歐氏距離為15時，可聚為5類，即S3、S5、S6、S8～S10聚為一類，S1、S2、S4、S7各為一類。經(jīng)主成分分析，4個主成分因子的累積方差貢獻(xiàn)率為88.659%，以S5樣品的主成分因子綜合得分最高。響應(yīng)面法優(yōu)化的趕山鞭總黃酮提取純化條件簡單可靠，建立的HPLC指紋圖譜能夠簡便、高效地反映趕山鞭總黃酮提取物中大部分化學(xué)成分信息，為趕山鞭藥材的質(zhì)量評價奠定基礎(chǔ)。

趕山鞭；總黃酮；提??；工藝優(yōu)化；星點設(shè)計效應(yīng)面法；指紋圖譜；金絲桃苷；槲皮素；蘆??；山柰酚

趕山鞭Choisy收載于《現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典》[1]、《全國中草藥匯編》[2]、《中國植物志》[3]，又名烏腺金絲桃，俗稱為穩(wěn)心草，為民間常用中草藥，民間常用全草代茶飲，治療心臟病，在我國植物資源廣泛，具有很大的藥用開發(fā)價值?，F(xiàn)代研究表明趕山鞭具有抗心律失常、抗心肌缺血、抗腫瘤、抗抑郁、抑菌等作用[4]。課題組前期藥效學(xué)研究結(jié)果表明，趕山鞭總黃酮類成分可拮抗CaCl2所致的大鼠心律失常；在離體大鼠心臟功能試驗中，總黃酮成分可提高離體心臟心肌收縮力，減慢離體心臟心率，使心律更加穩(wěn)定規(guī)整，該部位是趕山鞭抗心律失常的主要活性部位[5]。鑒于此，對趕山鞭總黃酮的最佳提取工藝進行優(yōu)化，建立趕山鞭總黃酮的指紋圖譜，對趕山鞭物質(zhì)基礎(chǔ)研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定，具有十分重要的意義。本研究首先采用星點設(shè)計效應(yīng)面法對不同來源的10批趕山鞭藥材中的總黃酮進行了提取，對獲得的10批趕山鞭藥材總黃酮提取物建立了HPLC指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析、主成分分析對其質(zhì)量進行評價，為趕山鞭藥材的質(zhì)量評價奠定基礎(chǔ)。

1 藥材、儀器與試藥

趕山鞭全草，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室王振月教授鑒定為藤黃科金絲桃屬植物趕山鞭Choisy[6]。S1～S10批次的產(chǎn)地及采收時間分別為黑龍江密山市（2015年7月）、黑龍江海林市（2015年7月）、黑龍江省哈爾濱市（2016年7月）、黑龍江海林市（2016年7月）、吉林省吉林市（2014年7月）、吉林省吉林市（2015年7月）、黑龍江密山市（2016年7月）、黑龍江省牡丹江市（2015年7月）、黑龍江省大興安嶺地區(qū)（2016年7月）、黑龍江省呼瑪縣（2016年7月）。

安捷倫1260型HPLC高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測器，美國安捷倫公司；Xbrige C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美國Waters公司。對照品金絲桃苷（批號111521-201507）、金絲桃素（批號10121-201403）、槲皮素（批號100081- 201610）、山柰酚（批號520-18-3）、蘆?。ㄅ?53-18-4），均購自中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98.0%；乙腈，色譜純，美國Fisher公司；甲酸，HPLC級，科密歐化學(xué)試劑有限公司；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團。

2 方法與結(jié)果

2.1 趕山鞭總黃酮含量測定方法的建立

2.1.1 趕山鞭藥材的處理及總黃酮提取液供試品溶液的制備 精密稱取藥材粉末約2.0 g（過24目篩）經(jīng)100 mL醋酸乙酯超聲提取后蒸干，甲醇復(fù)溶，取上清濾過，并定容至20 mL量瓶中，得藥材供試品溶液。精密稱取趕山鞭藥材粉末約15 g，過24目篩，以適宜體積分?jǐn)?shù)的乙醇、料液比、回流時間提取，提取液定容至50 mL，得到趕山鞭總黃酮提取液供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱定一定量蘆丁對照品置于100 mL量瓶中，用60%乙醇將其溶解后定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁對照品溶液。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密量取蘆丁對照品溶液0.2、0.8、1.0、1.6、1.8 mL，30%乙醇稀釋至2.6 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.2 mL，混勻后放置6 min，再加入10%亞硝酸鋁溶液0.2 mL，搖勻放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液2 mL，放置15 min。以試劑為空白，500 nm處測定吸光度（）值[7]。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為＝2.293 8＋0.180 8，＝0.999 6，結(jié)果表明蘆丁在0.008～0.072 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗 吸取0.20 mg/mL蘆丁對照品溶液1.0 mL，按照“2.1.3”項方法操作，連續(xù)6次重復(fù)，測得值的RSD為0.9%，結(jié)果表明檢測儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗 準(zhǔn)確稱取6份趕山鞭藥材粉末（S5）各15 g，按照“2.1.1”項下方法制備趕山鞭總黃酮提取液，按“2.1.3”項方法測定值的RSD為1.3%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 準(zhǔn)確稱取趕山鞭藥材粉末（S5）15 g，按照“2.1.1”項下方法制備趕山鞭總黃酮提取液，按“2.1.3”項方法每20 min測1次值，持續(xù)180 min，測得值的RSD為1.1%，表明供試品溶液在180 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率試驗 準(zhǔn)確稱取6份趕山鞭藥材粉末（S5）各15 g，按照“2.1.1”項下方法制備趕山鞭總黃酮提取液，分別準(zhǔn)確吸取1.0 mL置于加入了0.20 mg/mL蘆丁對照品溶液1 mL的25 mL比色管中，按“2.1.3”項方法測定樣品總黃酮含量，計算蘆丁加樣回收率，結(jié)果平均加樣回收率為98.08%，RSD為1.2%。

2.1.8 樣品測定 準(zhǔn)確吸取各待測的1.0 mL趕山鞭總黃酮提取液置于的25 mL比色管中，按“2.1.3”項方法測定樣品總黃酮含量。

2.2 金絲桃苷含量測定方法的建立

2.2.1 對照品溶液的制備 金絲桃苷對照10.57 mg，甲醇定容，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 同“2.1.1”項下。

2.2.3 色譜條件 色譜柱為Xbrige C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（68∶32）；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測波長360 nm；進樣量10 μL。該色譜條件下，金絲桃苷色譜峰無干擾，所得色譜圖見圖1。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取金絲桃苷對照品溶液適量，分別加甲醇稀釋，按“2.2.3”項下色譜條件測定，以進樣量為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），得金絲桃苷的線性回歸方程＝12 907＋165.2，2＝0.994 7，線性范圍為0.01～2.0 g/L。

2.2.5 精密度試驗 取趕山鞭（S5）總黃酮提取液供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣6次，計算金絲桃苷峰面積的RSD為0.4%。

圖1 金絲桃苷對照品(A)和趕山鞭總黃酮樣品(B)的HPLC圖

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取趕山鞭（S5）總黃酮提取液供試品溶液適量，分別于放置0、8、10、16、20、24 h后按“2.2.3”項下色譜條件測定，計算金絲桃苷峰面積的RSD為0.5%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取趕山鞭藥材（S5），按“2.1.1”項下方法平行制備6份趕山鞭總黃酮提取液供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定，結(jié)果金絲桃苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%，RSD為1.4%，說明建立的方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已測定金絲桃苷含量的趕山鞭（S5）6份，精密加入0.4 mg/mL金絲桃苷對照品溶液1 mL，按“2.1.1”項下方法制備總黃酮供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定，結(jié)果平均加樣回收率為97.19%，RSD為1.7%。

2.2.9 樣品測定 取各待測的趕山鞭藥材及提取物供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定并計算各趕山鞭總黃酮提取物中金絲桃苷的轉(zhuǎn)移率。

2.3 單因素實驗考察趕山鞭總黃酮提取工藝參數(shù)

2.3.1 提取溫度的影響 準(zhǔn)確稱取15 g趕山鞭藥材粉末，在固定提取時間、提取次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)及料液比的前提下，改變?nèi)軇┨崛囟龋?0、40、50、60、70、80 ℃）進行單因素實驗，按照“2.1”“2.2”項操作方法測定，計算提取物中總黃酮的含量（以蘆丁計）及金絲桃苷的轉(zhuǎn)移率，考察提取溫度對趕山鞭總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率的影響。每個實驗重復(fù)3次。提取溫度對總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率的影響見表1，隨著溫度的增加，提取物中總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率大體呈現(xiàn)上升趨勢，在70 ℃時達(dá)到峰值。

2.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 準(zhǔn)確稱取15 g趕山鞭藥材粉末，在固定其他考察因素的條件下，改變乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、50%、60%、80%、90%）進行單因素試驗，按照“2.1”“2.2”項操作方法測定，計算提取物中總黃酮的含量（以蘆丁計）及金絲桃苷的轉(zhuǎn)移率，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對趕山鞭總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率的影響，每個實驗重復(fù)3次。乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率的影響見表2，因此，選用30%～90%的范圍進行乙醇體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)選。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，提取物中總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率大體呈現(xiàn)上升趨勢，在80%乙醇時達(dá)到峰值。

表1 提取溫度對趕山鞭總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率的影響

Table 1 Effect of extraction temperature on total flavone content of flavone and transfer rate of hyperoside

提取溫度/℃總黃酮/%金絲桃苷轉(zhuǎn)移率/% 303.4529.67 404.5635.76 505.6042.48 608.9953.97 7010.8862.54 809.0958.67

表2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對趕山鞭總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率的影響

Table 2 Effect of ethanol concentration on total flavone content of flavone and transfer rate of hyperoside

乙醇/%總黃酮/%金絲桃苷轉(zhuǎn)移率/% 302.5430.54 504.3240.67 6011.0263.49 8010.0758.58 909.7145.34

2.3.3 提取時間的影響 準(zhǔn)確稱取15 g趕山鞭藥材粉末，在固定其他考察因素的條件下，改變提取時間（30、60、90、120、180 min）進行單因素實驗，按照“2.1”“2.2”項操作方法測定，計算提取物中總黃酮的含量（以蘆丁計）及金絲桃苷的轉(zhuǎn)移率，考察提取時間對趕山鞭總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率的影響，每個實驗重復(fù)3次。提取時間對總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率的影響見表3，隨著回流提取時間的延長，在120 min時達(dá)到峰值。

2.3.4 料液比的影響 準(zhǔn)確稱取15 g的趕山鞭藥材粉末，在固定其他考察因素的條件下，改變料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）進行單因素實驗，按照“2.1”“2.2”項操作方法測定，計算提取物中總黃酮的含量（以蘆丁計）及金絲桃苷的轉(zhuǎn)移率，考察料液比對趕山鞭總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率的影響，每個實驗重復(fù)3次。料液比對總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率的影響見表4，隨著料液比的增加，總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，其中料液比1∶10達(dá)到峰值。

表3 提取時間對趕山鞭總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率的影響

Table 3 Effect of extraction time on total flavone content of flavone and transfer rate of hyperoside

提取時間/min總黃酮/%金絲桃苷轉(zhuǎn)移率/% 301.3420.49 604.4527.65 907.3440.88 12011.2064.78 18010.0255.08

2.3.5 提取次數(shù)的影響 準(zhǔn)確稱取15 g趕山鞭藥材粉末，在固定其他考查因素的條件下，改變提取次數(shù)（1、2、3次）進行單因素實驗，按照“2.1”“2.2”項操作方法測定，計算提取物中總黃酮含量（以蘆丁計）及金絲桃苷的轉(zhuǎn)移率，考察提取次數(shù)對趕山鞭總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率的影響，每個實驗重復(fù)3次。提取次數(shù)對總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率無顯著影響，選擇提取次數(shù)為2次。

綜上分析，選擇80%乙醇，料液比1∶10，回流提取120 min，為中心點進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。

表4 料液比對趕山鞭總黃酮含量及金絲桃苷轉(zhuǎn)移率的影響

Table 4 Effect of ratio of material to liquid on total flavone content of flavone and transfer rate of hyperoside

料液比總黃酮/%金絲桃苷轉(zhuǎn)移率/% 1∶56.8940.57 1∶1011.0369.65 1∶159.9852.58 1∶208.7649.79 1∶258.0543.32

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化趕山鞭總黃酮最佳提取工藝

2.4.1 響應(yīng)面試驗 在單因素考察的基礎(chǔ)上，利用Central-Composite試驗設(shè)計原理，以提取溫度為70 ℃，總黃酮含量（1）和金絲桃苷的轉(zhuǎn)移率（2）為考察指標(biāo)，設(shè)計甲醇體積分?jǐn)?shù)（1）、料液比（2）和回流時間（3）3因素5水平中心組合試驗，上、下區(qū)域各取1水平值以（?1.682、?1、0、+1、+1.682）進行編碼，作為響應(yīng)曲面試驗設(shè)計水平，應(yīng)用Design-Expert 11統(tǒng)計軟件設(shè)計3因素5水平的響應(yīng)面試驗對提取工藝進行尋優(yōu)，以確定最優(yōu)的提取方法，試驗安排及結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

Table 5 Central composite design arrangement and result

試驗號X1/%X2X3/hY1/%Y2/%試驗號X1/%X2X3/hY1/%Y2/% 156.08 (?1)0.09 (?1)1.41 (?1)6.0335.451165 (0)0.08 (?1.682)23.0430.65 273.92 (+1)0.091.416.2136.7812650.12 (+1.682)23.0832.11 356.080.11 (+1)1.412.8929.6213650.101 (?1.682)2.2319.87 456.080.112.59 (+1)6.3435.0214650.103 (+1.682)2.8920.61 573.920.112.595.8840.3215650.10 211.2072.57 673.920.092.596.4341.2016650.10 211.0772.01 756.080.092.595.9941.2117650.10211.3173.89 873.920.111.416.0937.9018650.10211.1971.32 950 (?1.682)0.10 (0)2 (0)2.9519.4519650.10211.3273.72 1080 (+1.682)0.1023.1233.2120650.10211.3773.96

2.4.2 模型擬合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件，以1、2為響應(yīng)參數(shù)對因素1、2、3進行2次多項式回歸方程擬合，得擬合方程分別為1＝11.14＋0.271－0.252＋0.333＋0.2712＋0.3823－2.1912－2.1922－2.3632（2＝0.828 2，＜0.000 1），2＝72.46＋2.791－0.682＋1.413＋1.5312－0.5413－0.3023－13.512－11.7222－15.6632（2＝0.911 4，＜0.000 1），從擬合方程的2與可知，2次多項式擬合較好，可用此模型對總黃酮提取工藝進行預(yù)測和分析。1、2回歸方程的方差分析見表6。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1、2模型項均＜0.000 1，說明回歸方程的關(guān)系是極顯著的。對于1、2模型方程，1、2、3、12、13、23、12、22、32都是顯著項，是1、2的顯著影響因素，交互影響因素3D效果圖與等高線圖見圖2。

2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 結(jié)合試驗要求，公共區(qū)域中響應(yīng)面值較高部分為最佳的區(qū)域，并選擇最佳范圍，確定最佳范圍是50≤1≤80，1∶8≤2≤1∶12，1≤3≤3。采用Design-Expert 11.0軟件優(yōu)化考察因素范圍。最終確定趕山鞭總黃酮的最優(yōu)提取工藝為1＝65%，2＝1∶10，3＝2 h，此時1＝（11.24±0.11）%，2＝（64.23±6.05）%。

2.4.4 優(yōu)化后的處方驗證 分別精密吸取10批樣品的供試品溶液適量，按“2.2.3”項下色譜條件測定，結(jié)果見表7。綜上所述，確定趕山鞭總黃酮的最優(yōu)處方工藝為乙醇濃度為65%，料液比為1∶10，提取時間為120 min。按該工藝條件提取3批趕山鞭總黃酮樣品，將檢測結(jié)果與擬合方程的預(yù)測值進行對比，按公式［相對偏差＝(預(yù)測值－實測值)/預(yù)測值］計算相對偏差，以評估模型方程的可靠性。各批樣品總黃酮含量預(yù)測值為11.14%，實測值11.17%、11.21%、11.25%、11.24%、11.38%、11.30%、11.21%、11.19%、11.22%、11.27%，實測平均值11.25%，實測值與預(yù)測值之間的相對偏差＜5%，各批樣品金絲桃苷轉(zhuǎn)移率預(yù)測值為64.80%，實測值65.85%、65.78%、74.41%、68.18%、55.56%、59.10%、54.76%、67.44%、65.22%、65.96%，實測平均值64.23%，實測值與預(yù)測值之間的相對偏差＜5%，與總黃酮的含量結(jié)果是一致的。上述結(jié)果說明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行。

表6 回歸模型的方差分析

Table 6 Analysis of variance of regression model

方差來源自由度總黃酮含量金絲桃苷轉(zhuǎn)移率方差來源自由度總黃酮含量金絲桃苷轉(zhuǎn)移率 平方和F值P值平方和F值P值平方和F值P值平方和F值P值 模型9188.975.360.007 56 983.4811.420.000 4X2X311.170.300.596 80.696 20.010.921 4 X110.970.250.629 1105.971.560.240 1X12169.3817.700.001 82 628.0338.69＜0.000 1 X210.840.210.652 86.370.090.765 8X22168.8317.560.001 91 979.0429.140.000 3 X311.500.380.549 727.120.400.541 6X32180.4120.510.001 13 532.8952.02＜0.000 1 X1X210.560.140.712 918.790.280610 4殘差1039.20 67.92 X1X311.450.370.557 32.330.03 0.856 7

圖2 自變量X1、X2、X3與應(yīng)變量Y1、Y2的效應(yīng)面圖

2.5 趕山鞭總黃酮提取物HPLC指紋圖譜的建立

2.5.1 色譜條件 色譜柱為Xbrige C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫：0～3 min，15%乙腈；3～38 min，15%～90%乙腈；38～43 min，90%乙腈；43～46 min，90%～15%乙腈；46～50 min，15%乙腈；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測波長266 nm。

表7 趕山鞭總黃酮的理化特征參數(shù)

Table 7 Physiochemical parameters of total flavonoids extract of H. attenuatum

批次總黃酮/%金絲桃苷/%轉(zhuǎn)移率/% 總黃酮中藥材中 S111.170.270.4165.85 S211.210.250.3865.78 S311.250.320.4374.41 S411.240.300.4468.18 S511.380.250.4555.56 S611.300.260.4459.10 S711.210.230.4254.76 S811.190.290.4367.44 S911.220.300.4665.22 S1011.270.310.4765.96

2.5.2 對照品溶液配制 取金絲桃苷、金絲桃素、槲皮素、山柰酚、蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成分別含0.23、0.14、0.24、0.18、0.20 mg/mL的對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 取不同批次的趕山鞭樣品3 g粉碎，過4號篩，65%乙醇30 mL回流提取2 h，將提取液濃縮至10 mL并蒸干，用甲醇溶解，作為趕山鞭總黃酮供試品溶液。

2.5.4 精密度試驗 取同一趕山鞭總黃酮供試品溶液，連續(xù)進樣6次，按“2.5.1”項色譜條件方法測定指紋圖譜。應(yīng)用相似度軟件分別對共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積進行統(tǒng)計。結(jié)果表明，各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積無明顯變化（RSD＜3%），精密度合格，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取同一趕山鞭總黃酮供試品溶液，按“2.5.1”項色譜條件方法，分別在0、4、8、12、16 h連續(xù)進樣6次，測定指紋圖譜。應(yīng)用相似度軟件分別對共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積進行統(tǒng)計。結(jié)果表明，各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積無明顯變化（RSD＜3%），供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.5.6 重現(xiàn)性試驗 取同一批次趕山鞭藥材樣品6份，按“2.1.1”項下方法制成6份趕山鞭總黃酮供試品溶液，再按選擇好的色譜條件方法測定各指紋圖譜。應(yīng)用相似度軟件分別對共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積進行統(tǒng)計。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積無明顯變化（RSD＜3%），方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.5.7 指紋圖譜的建立[8]及部分色譜峰的歸屬指認(rèn) 取10批趕山鞭總黃酮提取物，按“2.5.1”項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，生成疊加圖譜及對照圖譜，見圖3。以金絲桃苷、金絲桃素、槲皮素、山柰酚、蘆丁作對照，對指紋圖譜中部分共有指紋峰進行了確認(rèn)，通過保留時間和在線紫外光譜，確認(rèn)各指紋峰見圖4，選擇的對照品金絲桃苷的吸收峰（7號峰），其為趕山鞭的主要代表成分，且穩(wěn)定，因此選其為參照物峰。

2.5.8 指紋圖譜相似度計算 通過對10批趕山鞭提取物指紋圖譜進行了測定，各指紋圖譜中共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積見表8，相似度計算結(jié)果見表9，比較其色譜圖，發(fā)現(xiàn)有15個指紋峰為各色譜圖所共有，確定為共有指紋峰，不同批次趕山鞭提取物相似度大于0.61，相似度評價結(jié)果表明，各批藥材樣品間質(zhì)量存在差異。各共有峰相對峰面積的RSD相差較大，提示不同產(chǎn)地趕山鞭藥材的成分雖一致，但含量存在差異。

圖3 趕山鞭總黃酮提取物指紋圖譜

5-蘆丁 7-金絲桃苷 13-槲皮素 14-山柰酚 15-金絲桃素

2.6 聚類分析

以10批樣品的15個共有峰的相對峰面積為原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 21.0軟件，以系統(tǒng)聚類法結(jié)合歐氏距離（）為測度進行分析，結(jié)果見圖5。由圖5可知，＝25時，10批樣品可聚為2類，S1，S7為一類，其余聚為一類；＝15時，可聚為5類，即S3、S5、S6、S8、S9、S10聚為一類，S1、S2、S4、S7各為一類。

表8 10批趕山鞭提取物共有指紋峰保留時間及峰面積的RSD

Table 8 RSD of shared fingerprint peak retention time and peak area of 10 batches of total flavonoids extract in H. attenuatum

峰號t/min峰面積RSD/% S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10保留時間峰面積 13.55977.20895.80713.35829.09913.67885.64793.74721.32889.54769.543.738.55 25.74164.47151.29155.31170.22171.31164.32193.80190.21173.04168.774.818.01 38.28199.01189.76206.05207.37202.08207.68202.76188.65197.62193.891.702.62 48.35868.08972.64860.31830.98845.54889.56918.81840.32887.73894.430.054.92 512.311 046.951 141.261 230.351 194.291198.111 259.721 152.891 098.431 108.391 178.141.236.04 612.50815.36713.48737.80840.88802.73700.85763.80729.40805.56781.450.055.97 715.012 121.072 280.892 186.562 237.221 923.411 947.682 058.281 999.572 087.652 090.670.316.09 815.63727.43848.26739.78767.07803.88737.82720.95726.89759.67800.590.295.59 918.86383.66380.40424.69431.37449.47412.82414.73397.50404.67419.871.905.07 1020.39397.35362.62361.65311.86327.39319.26309.10323.98348.78318.670.658.26 1123.62554.92550.48565.97549.97589.47524.15568.41525.89548.98558.970.372.95 1228.90175.56177.85154.72159.92163.03203.56180.43168.76172.59196.781.268.43 1334.921 035.36989.371 162.901 111.211 063.941 251.801 069.471 074.871 092.901 046.690.366.81 1442.915 866.765 716.165 692.015 091.114 743.344 908.565 899.105 056.475 129.674 896.590.628.07 1543.621 617.611 621.371 895.061 862.641 771.801 856.341 938.951 699.071 832.451 730.010.176.42

表9 10批趕山鞭提取物指紋圖譜相似度評價結(jié)果

Table 9 Evaluation results of similarity of fingerprints of 10 batches of extracts of H. attenuatum

樣品相似度 S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10對照 S11.0000.7240.6540.7650.6700.7520.6210.6870.7540.6880.872 S20.7241.0000.6120.6310.7180.8270.8730.7010.7780.6710.886 S30.6540.6121.0000.7870.7760.8690.6340.7170.7690.7010.855 S40.7650.6310.7871.0000.6740.6690.7270.6890.7350.6960.793 S50.6700.7180.7760.6741.0000.8830.6390.6140.6890.7570.859 S60.7520.8270.8690.6690.8831.0000.6290.7120.7040.6820.811 S70.6210.8730.6340.7270.6390.6291.0000.6980.7200.6830.837 S80.6870.7010.7170.6890.6140.7120.6981.0000.6980.7260.798 S90.7540.7780.7690.7350.6890.7040.7200.6981.0000.6490.801 S100.6880.6710.7010.6960.7570.6820.6830.7260.6491.0000.845 對照0.8720.8860.8550.7930.8590.8110.8370.7980.8010.8451.000

圖5 10批樣品聚類分析樹狀圖

2.7 主成分分析

以各共有峰的相對峰面積為指標(biāo)，將10批樣本14個共有峰（除峰7外）的相對峰面積進行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用SPSS 21.0軟件進行主成分分析，計算其特征值和方差貢獻(xiàn)率，以特征值＞1，累積方差貢獻(xiàn)率85%左右為標(biāo)準(zhǔn)，得到4個主成分因子的特征值分別為7.639、1.958、1.473、1.342，作為樣本質(zhì)量評價的主要因子；4個主成分因子的累積方差貢獻(xiàn)率為88.659%，結(jié)果見表10。

選擇提取該4個主成分因子對10批樣品進行評分，以方差貢獻(xiàn)率為分配系數(shù)，線性組合4個主成分因子，計算各批樣品的主成分因子得分及綜合得分，并對綜合得分［綜合得分＝相應(yīng)的因子得分×(相應(yīng)主成分的特征值)1/2］進行排序，綜合得分越高表明對樣品中有效成分的統(tǒng)計質(zhì)量越好[9-10]，結(jié)果見表11。可見，綜合得分由高到低依次為S5、S6、S10、S7、S9、S8、S1、S3、S4、S2。

表10 趕山鞭總黃酮中4個主成分因子的特征值和方差貢獻(xiàn)率

Table 10 Eigenvalues and variance contributions of four principal component factors of total flavonoids of H. attenuatum

主成分因子特征值方差貢獻(xiàn)率/%累積方差貢獻(xiàn)率/% 17.63954.56154.561 21.95813.98968.550 31.47310.52079.070 41.3429.58988.659

表11 10批趕山鞭總黃酮主成分因子得分及排序

Table 11 Factor scores and ranking of main components of 10 batches of total flavonoids of H. attenuatum

編號主成分因子得分綜合得分排序 因子1因子2因子3因子4 S1?1.622.74?0.720.43?0.547 S2?4.480.790.45?2.11?2.4910 S3?2.38?1.210.321.03?1.348 S4?2.89?2.48?1.410.28?2.049 S54.01?0.18?1.56?0.731.931 S63.33?0.761.99?1.601.772 S70.800.121.681.550.784 S80.58?0.22?0.20?0.130.256 S90.961.09?0.350.730.715 S101.700.10?0.210.550.973

3 討論

響應(yīng)面法是以3水平2階實驗設(shè)計和數(shù)學(xué)建模為基礎(chǔ)的優(yōu)化方法，該方法能夠克服正交設(shè)計無法找出整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值的缺陷，彌補均勻設(shè)計等線性模型精密度低的不足，能更好地揭示自變量和非自變量之間的關(guān)系，故具有較高的科學(xué)性和準(zhǔn)確性[11-12]，相較于正交實驗設(shè)計更加簡化，與均勻設(shè)計相比更全面，可顯著減少試驗的次數(shù)，該方法的精密度高，預(yù)測性較好[13-15]。課題組前期研究表明趕山鞭抗心律失常的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為總黃酮類成分[16]，本研究以總黃酮總提取率及金絲桃苷的轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，通過單因素實驗和Central- Composite響應(yīng)面設(shè)計并利用3D響應(yīng)面和2D等高線圖分析，確定了回流提取趕山鞭總黃酮3個因素的主次關(guān)系并得到了提取效果最優(yōu)的理論工藝條件：乙醇為65%，料液比為1∶10，回流時間120 min，提取2次。通過驗證試驗表明趕山鞭總黃酮含量實測值與理論值相近，證明響應(yīng)面法所構(gòu)建的模型準(zhǔn)確可靠，優(yōu)化后的總黃酮含量較高。在此基礎(chǔ)上，建立了趕山鞭總黃酮含量的HPLC指紋圖譜。

HPLC在中藥成分研究等方面都是重要的分析手段，它給出的是高分辨的輪廓圖譜，具有適用范圍廣、重現(xiàn)性較好，操作容易，外界影響因素小，所得色譜的穩(wěn)定性好等優(yōu)點，HPLC指紋圖譜能夠較好地從“整體”視角來反映中藥材的化學(xué)成分，被廣泛應(yīng)用于中藥材的質(zhì)量評價中[17-20]。因此，本研究采用HPLC技術(shù)構(gòu)建10批趕山鞭藥材總黃酮提取物的指紋圖譜，指紋圖譜的相似度為大于0.61，可能因為不同地域的光照、降水、土壤條件不同，對藥材質(zhì)量差異性影響較大。實驗中獲得相應(yīng)的指紋圖譜信息數(shù)據(jù)，為趕山鞭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及趕山鞭抗心律失常的“譜效關(guān)系”提供實驗基礎(chǔ)。

本實驗中所建立的趕山鞭總黃酮的HPLC指紋圖譜，實驗方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，且操作簡便可行，符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。共識別了15個共有峰，但各成分含量存在差異，經(jīng)對照品指認(rèn)，對部分色譜峰進行了歸屬指認(rèn)分別是金絲桃苷、槲皮素、蘆丁、山柰酚。聚類分析可對趕山鞭藥材進行較好地分類，分析結(jié)果為當(dāng)歐式距離為25時，10批趕山鞭可分為2類：趕山鞭總黃酮含量低的S1、S7，即產(chǎn)地為黑龍江密山市聚為一類；當(dāng)歐式距離為15時，除黑龍江省海林市和密山市以外產(chǎn)地的S3、S5、S6、S8～S10聚為一類，總黃酮總含量相對較高，表明基于總黃酮含量差異評價趕山鞭質(zhì)量的差異與其產(chǎn)地有關(guān)。

對趕山鞭總黃酮的特征圖譜進行主成分分析，共選擇了4個主成分，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到85%以上，得到4個主成分因子的特征值分別為7.639、1.958、1.473、1.342，選擇提取該4個主成分因子對10批樣品進行評分，對綜合得分進行排序，綜合得分由前3位依次為S5、S6、S10。表明主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果部分相近，2種分析結(jié)果存在一致性和科學(xué)性。綜上所述，本研究基于聚類分析和主成分分析研究趕山鞭總黃酮HPLC特征圖譜可作為趕山鞭藥材質(zhì)量評價的方法和依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Optimization of extraction process of total flavonoids fromby central composite design response surface method and fingerprint research

JING Zhong-xu1, LIU Yu-wei2, JIANG Hai-bo2, LIU Yan-nan2, QIN Guo-zhao2, FENG Yu-fei2

1. Heilongjiang Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China 2. School of Pharmacy, Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China

To optimize the extraction process of the total flavonoids of Ganshanbian () and to establish the fingerprint profile of the total flavonoids of.Single-factor experiments were conducted to study the effects of solvent extraction time, extraction times, extraction concentration, and material-to-liquid ratio on the extraction rate and transfer rate of hyperoside of total flavonoids in, on this basis, the central- composite design experimental design principle is used to carry out a three-factor five-level experimental design and response surface analysis to optimize the extraction process; on the basis of obtaining the best extraction method, on the basis of the best extraction method, the purification method of the total flavonoids extract ofwas optimized by using the type of resin, the loading concentration of the extract, the loading volume of the extract, the elution concentration and the elution volume as the investigating indexes. After that, the fingerprints of the total flavonoids extract ofwere established by HPLC, and SPSS 22.0 software was used for cluster analysis and principal component analysis.The best extraction conditions were 80% ethanol, 1:10 ratio, 2 h per extraction, extract 2 times. The HPLC fingerprints of the total flavonoids ofwere determined to have 15 peaks common to all chromatograms, and the similarity analysis of the fingerprints showed that the similarity was greater than 0.61, the peaks were identified as auriculoside, quercetin, rutin and sannaphene, indicating that the chemical composition of the 10 batches of samples was consistent, but there were differences in the content of each component. The clustering analysis showed that when the Euclidean distance was 25, the 10 batches of samples could be clustered into 2 classes, S1 and S7 into one class, and the rest into one class; when the Euclidean distance was 5, they could be clustered into 5 classes, namely S3, S5, S6, S8—S10 into one class, and S1, S2, S4, S7 into one class each. After the principal component analysis, the cumulative variance contribution of the four principal component factors was 88.659%, with the highest overall score of the principal component factors for S5 samples.The extraction and purification conditions of the total flavonoids ofwere optimized by response surface analysis. The HPLC fingerprint was able to easily and efficiently reflect most of the chemical information in the extract ofChoisy, which could provide reference for the quality evaluation and related study of.

Choisy; total flavonoids; extraction; process optimization; central composite design response surface method; fingerprinting; hyperoside; quercetin; rutin; kaempferol

R283.6

A

0253 - 2670(2022)16 - 5010 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.010

2022-04-18

國家自然科學(xué)基金面上項目（82174232）；黑龍江省自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年項目（YQ2019H031）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)“優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計劃”項目（2018年）；黑龍江省博士后研究人員落戶黑龍江科研啟動資助項目（2020年）

井中旭（1983—），助理研究員，碩士，主要從事中藥產(chǎn)業(yè)化研究。Tel: (0451)87977001 E-mail: xuri_00001@163.com

馮宇飛（1982—），女，教授，從事中藥新劑型和新技術(shù)研究。Tel: (0451)87266893 E-mail: fuf-002@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]