何坤, 王芳潔, 鄭瑞利

鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科(河南鄭州 450000)

川崎病(Kawasaki disease，KD)即小兒皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征，是一種急性自限性血管炎，好發(fā)于嬰幼兒，其最主要的臨床癥狀為持續(xù)高熱，且抗生素治療無(wú)效。近年來(lái)，KD發(fā)病的嬰幼兒越來(lái)越多，其發(fā)病可能與免疫、感染等多種因素相互作用有關(guān)。盡管經(jīng)靜脈注射免疫球蛋白后多數(shù)預(yù)后良好，但仍有部分患兒存在冠狀動(dòng)脈病變等后遺癥，不利于心臟發(fā)育，并且可能會(huì)增加成年后心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[1]。因此，尋找與KD發(fā)病及冠狀動(dòng)脈損傷發(fā)生相關(guān)的指標(biāo)，對(duì)個(gè)體化治療KD及避免或降低冠狀動(dòng)脈損傷具有重要的臨床意義。相關(guān)研究顯示[2-3]，微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)及長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸(long noncoding RNAs，LncRNA)在心血管系統(tǒng)中具有強(qiáng)大的生物學(xué)功能，在多種心血管疾病的診療中發(fā)揮重要作用。微小核糖核酸-223(microRNA-223，miR-223)是作用較廣泛的一種miRNAs，參與血管生成、動(dòng)脈粥樣硬化形成等多個(gè)過(guò)程[4]。已有研究證實(shí)[5]，微小核糖核酸-223-3p是KD血管內(nèi)皮損傷的重要調(diào)控因子。而FGD5-AS1作為一種LncRNA，被證實(shí)在血管內(nèi)皮損傷、缺血再灌注損傷等心血管損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[6]。但miR-223及FGD5-AS1在KD發(fā)病及患兒冠狀動(dòng)脈損傷發(fā)生中的作用尚不十分明確。因此，本研究連續(xù)選取75例KD患兒作為研究對(duì)象，著重探討血漿miR-223、FGD5-AS1的表達(dá)水平及與冠狀動(dòng)脈損傷發(fā)生的關(guān)系，旨在為KD的防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 連續(xù)選取2019年4月至2021年4月本院收治的KD患兒75例作為KD組，其中男46例，女29例；年齡1～4歲，平均(2.83±0.90)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均符合KD診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)均為急性期入組；(3)臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入院前接受治療者；(2)KD復(fù)發(fā)者；(3)合并其他感染者；(4)存在自身免疫性疾??；(5)存在先天性畸形；(6)伴隨其他心血管疾病。另選取同期在本院體檢的健康兒童60例作為健康對(duì)照組，及本院收治的感染發(fā)熱患兒60例作為發(fā)熱對(duì)照組。健康對(duì)照組男34例，女26例；年齡1～4歲，平均(3.03±0.91)歲。發(fā)熱對(duì)照組男31例，女29例；年齡1～4歲，平均(2.97±0.95)歲。發(fā)熱對(duì)照組患兒納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)肺炎或上呼吸道感染者；(2)臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他感染者；(2)存在自身免疫性疾?。?3)存在先天性畸形；(4)存在心臟功能障礙；(5)入組前接受過(guò)治療。3組間性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019000-12)，且取得所有研究對(duì)象家長(zhǎng)的知情同意。

1.2 冠狀動(dòng)脈損傷診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]KD患兒均接受靜脈注射免疫球蛋白和口服阿司匹林治療，于病程的第14天行心臟超聲心動(dòng)圖檢查，并根據(jù)冠狀動(dòng)脈Z值將75例KD患兒分為無(wú)冠狀動(dòng)脈損傷組(Z值<2，n=59)和冠狀動(dòng)脈損傷組(Z值≥2，n=16)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集 采集健康對(duì)照組兒童體檢時(shí)，及發(fā)熱對(duì)照組和KD組患兒入院當(dāng)天外周靜脈血，另收集治療第14天時(shí)KD組患兒外周靜脈血，每例3 mL并置于肝素抗凝管中，30 min內(nèi)離心，3 000 r/min離心10 min，提取血漿并分為2份，保存于-80℃低溫環(huán)境中。1份用于檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)(blood platelet，PLT)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、氨基末端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，另1份用于檢測(cè)血漿miR-223、FGD5-AS1表達(dá)水平。

1.3.2 血漿miR-223、FGD5-AS1表達(dá)水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)研究對(duì)象血漿miR-223、FGD5-AS1表達(dá)水平。以Trizol法(試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司)提取細(xì)胞總RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司)說(shuō)明書(shū)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。FGD5-AS1上游引物：5′-AACAGTGCCTATGTGGACGG-3′，下游引物：5′-CCCATCACAGAGGTCCACAC-3′；FGD5-AS1內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGATTTC-3′。miR-223上游引物：5′-CGGACGTGTATTTGACAAGC-3′，下游引物5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′；miR-223內(nèi)參U6上游引物：5′-TTTATGCTTGAGCCTTGA-3′，下游引物5′-CTTGCCTGAAATACTTGC-3′。反應(yīng)條件為：95℃、5 min，95℃、10 s，60℃、45 s，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。利用公式2-ΔΔCt計(jì)算研究對(duì)象血漿miR-223、FGD5-AS1的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 相關(guān)指標(biāo)水平檢測(cè) 采用血細(xì)胞分析儀(型號(hào)：邁瑞B(yǎng)C-5000，武漢科爾達(dá)醫(yī)療科技有限公司)檢測(cè)PLT水平。采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(型號(hào)：羅氏Cobas-E411，上海羅氏制藥有限公司)及酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(貨號(hào)：IB-E2006，江西艾博因生物科技有限公司；貨號(hào)：KIT10395A，北京義翹神州科技股份有限公司)檢測(cè)血漿NT-proBNP、IL-6水平。采用全自動(dòng)血沉分析儀(型號(hào)：Vision-C，上海涵飛醫(yī)療器械有限公司)檢測(cè)ESR水平。

2 結(jié)果

2.1 3組研究對(duì)象血漿miR-223、FGD5-AS1表達(dá)及相關(guān)指標(biāo)水平的比較 3組研究對(duì)象血漿miR-223、FGD5-AS1表達(dá)及相關(guān)指標(biāo)水平相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。KD組、發(fā)熱對(duì)照組患兒PLT、ESR及血漿miR-223、IL-6、NT-proBNP表達(dá)水平均明顯高于健康對(duì)照組兒童(P<0.05)，F(xiàn)GD5-AS1表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組兒童(P<0.05)。KD組患兒PLT、ESR及血漿miR-223、IL-6、NT-proBNP表達(dá)水平均明顯高于發(fā)熱對(duì)照組患兒(P<0.05)，F(xiàn)GD5-AS1表達(dá)水平明顯低于發(fā)熱對(duì)照組患兒(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組研究對(duì)象血漿miR-223、FGD5-AS1表達(dá)及相關(guān)指標(biāo)水平的比較

2.2 KD患兒治療前后血漿miR-223、FGD5-AS1表達(dá)水平比較 治療后KD患兒血漿miR-223表達(dá)水平明顯降低，F(xiàn)GD5-AS1表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 KD患兒治療前后血漿miR-223、FGD5-AS1表達(dá)水平比較

2.3 KD患兒血漿miR-223、FGD5-AS1表達(dá)與相關(guān)指標(biāo)水平的相關(guān)性 KD患兒血漿miR-223

與FGD5-AS1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.407，P=0.000)，見(jiàn)圖1。經(jīng)ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，miR-223與FGD5-AS1的3′UTR存在相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖2。KD患兒血漿miR-223表達(dá)水平與血漿IL-6、NT-proBNP表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.565、0.622，P<0.05)，與PLT、ESR無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.205、0.198，P>0.05)；KD患兒血漿FGD5-AS1表達(dá)水平與血漿IL-6、NT-proBNP表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.510、-0.487，P<0.05)，與PLT、ESR無(wú)明顯相關(guān)性(r=-0.201、-0.175，P>0.05)。見(jiàn)表3。

圖1 KD患兒血漿miR-223表達(dá)與FGD5-AS1表達(dá)水平相關(guān)性

圖2 miR-223與FGD5-AS1靶向關(guān)系預(yù)測(cè)

表3 KD患兒血漿miR-223、FGD5-AS1表達(dá)與相關(guān)指標(biāo)水平的相關(guān)性

2.4 KD患兒有無(wú)冠狀動(dòng)脈損傷血漿miR-223、FGD5-AS1及相關(guān)指標(biāo)水平的比較 冠狀動(dòng)脈損傷組患兒PLT、ESR及血漿miR-223、IL-6、NT-proBNP表達(dá)水平均明顯高于無(wú)冠狀動(dòng)脈損傷組患兒(P<0.05)，F(xiàn)GD5-AS1表達(dá)水平明顯低于無(wú)冠狀動(dòng)脈損傷組患兒(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 KD患兒有無(wú)冠狀動(dòng)脈損傷血漿miR-223、FGD5-AS1及相關(guān)指標(biāo)水平的比較

2.5 血漿FGD5-AS1、miR-223表達(dá)水平對(duì)KD患兒冠狀動(dòng)脈損傷診斷價(jià)值分析 血漿FGD5-AS1、miR-223水平聯(lián)合檢測(cè)(并聯(lián))診斷KD患兒冠狀動(dòng)脈損傷的ROC曲線(xiàn)下面積(AUC)為0.907(95%CI：0.845～0.969)，明顯高于血漿FGD5-AS1、miR-223水平單獨(dú)檢測(cè)曲線(xiàn)下面積0.819(95%CI：0.742～0.895)、0.824(95%CI：0.751～0.898)(Z/P=1.973/0.024、1.872/0.031)。見(jiàn)表5、圖3。

表5 血漿FGD5-AS1、miR-223表達(dá)水平對(duì)KD患兒冠狀動(dòng)脈損傷的診斷價(jià)值

圖3 血漿FGD5-AS1、miR-223對(duì)KD患兒冠狀動(dòng)脈損傷診斷價(jià)值的ROC曲線(xiàn)

3 討論

KD的主要病理改變?yōu)槿硇园l(fā)生血管炎癥，易累及冠狀動(dòng)脈，其治療的主要原則為控制全身血管炎癥及減少冠狀動(dòng)脈病變。研究發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白的早期使用可明顯降低KD患兒冠狀動(dòng)脈損傷的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但由于許多家長(zhǎng)擔(dān)心其安全性而未能及時(shí)輸注，致使目前冠狀動(dòng)脈損傷的發(fā)生概率仍居高不下，嚴(yán)重危害患兒的遠(yuǎn)期心臟健康[8]。因此，探討能早期評(píng)估KD患兒冠狀動(dòng)脈損傷發(fā)生情況的有效指標(biāo)，對(duì)降低冠狀動(dòng)脈損傷發(fā)生率、治療方案的制定及改善患兒遠(yuǎn)期心臟功能是非常重要的。

miRNAs是一類(lèi)參與多種基因表達(dá)的單鏈非編碼RNA，在心力衰竭、冠心病等生理和病理過(guò)程中起重要作用。miR-223屬于miRNAs，定位于X染色體q12，在骨髓造血細(xì)胞、粒細(xì)胞等血液系統(tǒng)中廣泛表達(dá)[9]。有研究報(bào)道，急性心肌梗死和慢性心力衰竭患者血清中miR-223高表達(dá)，與心肌細(xì)胞凋亡、冠狀動(dòng)脈病變及心臟損傷存在關(guān)聯(lián)[10-11]。Wang等[5]研究中，發(fā)現(xiàn)KD急性期患兒血清微小核糖核酸-223-3p表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照者。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血漿miR-223表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KD患兒血漿miR-223表達(dá)水平最高，其次為發(fā)熱對(duì)照組患兒，健康對(duì)照組兒童血漿miR-223表達(dá)水平最低，且治療后KD患兒血漿miR-223表達(dá)水平明顯降低，與Wang等[5]研究類(lèi)似，提示血漿miR-223表達(dá)水平升高可能參與KD發(fā)病。

LncRNA是一類(lèi)長(zhǎng)鏈非編碼RNA，在機(jī)體免疫應(yīng)答、細(xì)胞生長(zhǎng)分化等生物進(jìn)程中存在調(diào)控作用參與心腦血管、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展。有研究報(bào)道，急性心肌梗死患者心肌細(xì)胞中LncRNA FGD5-AS1低表達(dá)，上調(diào)FGD5-AS1表達(dá)可通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA水平提高心肌細(xì)胞活力，減少凋亡，改善心肌缺血和缺血再灌注損傷[12]。本研究結(jié)果中，KD組、發(fā)熱對(duì)照組、健康對(duì)照組血漿FGD5-AS1表達(dá)水平依次顯著降低(P<0.05)，且治療后KD患兒血漿FGD5-AS1表達(dá)水平明顯升高，與既往研究[6,13]在心肌損傷、膿毒癥發(fā)生中研究結(jié)果相似，提示血漿FGD5-AS1低表達(dá)可能與KD的發(fā)生有關(guān)。FGD5-AS1低表達(dá)可能促進(jìn)炎癥反應(yīng)增加、血管內(nèi)皮細(xì)胞異常改變等促使心肌細(xì)胞損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)KD的發(fā)生[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GD5-AS1與miR-233間存在靶向調(diào)控作用，與神經(jīng)細(xì)胞增殖和神經(jīng)元損傷有關(guān)[15]。而本研究結(jié)果顯示，KD患兒血漿miR-223與FGD5-AS1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，且經(jīng)ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，miR-223與FGD5-AS1的3′UTR存在相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，表明KD發(fā)生發(fā)展中FGD5-AS1與miR-233間也存在相互調(diào)控作用。陳翠翠等[16]發(fā)現(xiàn)通過(guò)外源miR-223抑制物干預(yù)，有利于減輕KD冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本研究中，冠狀動(dòng)脈損傷組患兒血漿miR-223表達(dá)水平較無(wú)冠狀動(dòng)脈損傷組患兒高，F(xiàn)GD5-AS1表達(dá)水平明顯低于無(wú)冠狀動(dòng)脈損傷組患兒，提示FGD5-AS1、miR-223可能參與冠狀動(dòng)脈損傷發(fā)生，臨床通過(guò)檢測(cè)血漿FGD5-AS1、miR-223表達(dá)水平對(duì)評(píng)估KD患兒冠狀動(dòng)脈損傷情況有所幫助。

IL-6是由成纖維細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等合成并分泌的多功能細(xì)胞因子，可通過(guò)識(shí)別靶細(xì)胞表面的人IL-6受體參與多種疾病進(jìn)展[17]。研究發(fā)現(xiàn)KD發(fā)病后機(jī)體可產(chǎn)生大量的IL-6，引起炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈損傷[18]。NT-proBNP是一種由心肌細(xì)胞合成并分泌的多肽，其水平異常升高可作為判斷心肌損傷的依據(jù)[19]。江雅靜等[20]研究報(bào)道，血清NT-proBNP水平升高與KD患兒冠狀動(dòng)脈損傷有關(guān)。本研究也得出相似的結(jié)果，血漿IL-6、NT-proBNP表達(dá)水平及從高至低依次為KD組患兒、發(fā)熱對(duì)照組患兒、健康對(duì)照組兒童，冠狀動(dòng)脈損傷組患兒血漿IL-6、NT-proBNP表達(dá)水平均較無(wú)冠狀動(dòng)脈損傷組高，提示血漿IL-6、NT-proBNP表達(dá)水平參與KD發(fā)生、發(fā)展。此外，Pearson檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，KD患兒血漿miR-223表達(dá)水平與血漿IL-6、NT-proBNP表達(dá)水平均呈正相關(guān)，F(xiàn)GD5-AS1表達(dá)水平與血漿IL-6、NT-proBNP表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步提示FGD5-AS1、miR-223與IL-6、NT-proBNP一樣，可能作為評(píng)估KD患兒冠狀動(dòng)脈損傷發(fā)生的有效指標(biāo)。而PLT、NT-proBNP在發(fā)熱組患兒血漿中升高，可能原因?yàn)榘l(fā)熱不僅引發(fā)肺炎、上呼吸道感染，還會(huì)導(dǎo)致其他臟器受累，影響心臟功能以及炎癥反應(yīng)增加。本研究還通過(guò)ROC曲線(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，血漿FGD5-AS1、miR-223水平聯(lián)合檢測(cè)診斷KD患兒冠狀動(dòng)脈損傷的曲線(xiàn)下面積為0.907，明顯高于血漿FGD5-AS1、miR-223水平單獨(dú)檢測(cè)曲線(xiàn)下面積，且敏感度較高，提示二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)KD患兒冠狀動(dòng)脈損傷的診斷價(jià)值較高。

綜上所述，miR-223在KD患兒血漿中明顯升高，參與冠狀動(dòng)脈損傷發(fā)生，且與IL-6、NT-proBNP呈正相關(guān)，可能為KD的防治及減少冠狀動(dòng)脈損傷提供幫助。但本研究有一定局限性，樣本量少且未進(jìn)行遠(yuǎn)期隨訪(fǎng)，miR-223在KD發(fā)病機(jī)制中的具體作用，需增加樣本并延長(zhǎng)隨訪(fǎng)進(jìn)一步探討。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：何坤提出研究思路、設(shè)計(jì)研究方案、實(shí)施研究過(guò)程、論文撰寫(xiě)；鄭瑞利資料收集整理，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，王芳潔指導(dǎo)論文修改。