曲延玉, 黃金鳳, 劉祥偉, 李煒霞

1佛山市第二人民醫(yī)院病理科(廣東佛山 528000)； 2廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院病理科(廣東佛山 528300)； 3佛山市第一人民醫(yī)院乳腺外一科(廣東佛山 528000)

乳腺癌(breast carcinoma，BC)是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，2020年GLOBOCAN更新數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌首次超過(guò)肺癌成為全球發(fā)病率最高的癌癥，發(fā)病率占總體癌癥發(fā)病率的11.7%，占總體癌癥死亡的6.9%。因此，腫瘤的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程的研究顯得尤為重要。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)受多種因素調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，是機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖調(diào)控紊亂的結(jié)果[1]。腫瘤組織細(xì)胞較高的增殖能力、侵襲及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致惡性腫瘤死亡的重要因素[2]。研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[3]。趨化因子是一類(lèi)能趨化細(xì)胞定向移動(dòng)的小分子分泌蛋白，具有趨化和激活白細(xì)胞的作用，現(xiàn)已證實(shí)，趨化因子在過(guò)敏性疾病、自身免疫性疾病和病毒感染等自身免疫系統(tǒng)疾病病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用；同時(shí)有人還發(fā)現(xiàn)其參與腫瘤形成和轉(zhuǎn)移[3]。在趨化因子家族中，CXCR2做為CXC族趨化因子配體1(CXCL1)和CXC趨化因子配體2(CXCL2)的共同受體，在多種惡性腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演重要角色[4-5]。但其在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是否有相關(guān)的作用目前未確定。查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，鮮見(jiàn)有關(guān)于對(duì)CXCR2在不同類(lèi)型IBC-NST的臨床意義的研究報(bào)道，本文旨在通過(guò)免疫組化法檢測(cè)在IBC-NST中CXCR2蛋白的表達(dá)，初步探討CXCR2在IBC-NST發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的病理臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院2019年1月至2020年6月IBC-NST標(biāo)本87例(IBC-NST組)，其中無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移IBC-NST 44例(無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移IBC-NST 43例(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組)，良性乳腺腺病組織50例(乳腺腺病組)，并對(duì)乳腺癌原發(fā)灶進(jìn)行ER、PR、HER2、Ki-67免疫組化檢測(cè)，對(duì)HER2(++)進(jìn)行FISH檢測(cè)，并根據(jù)2013年ST Gallen共識(shí)對(duì)乳腺癌原發(fā)灶進(jìn)行分子分型，分為L(zhǎng)uminal A型(37例)、Luminal B型(17例)、HER2過(guò)表達(dá)型(23例)、TNBC(10例)，患者年齡33～81歲，患者均為女性，術(shù)前均未接受放療和化療，所有病例診斷均經(jīng)HE染色和免疫組化確認(rèn)。本研究已經(jīng)過(guò)廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2 主要試劑 兔抗人CXCR2多克隆抗體濃縮型購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物有限公司，ER抗體、PR抗體、HER2抗體、Ki-67抗體、二抗試劑盒 DAB 染色液(聚合物法)、PBS磷酸鹽緩沖液(粉劑)、粉劑型抗原修復(fù)液(檸檬酸法)均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化(max vision HRP法) 標(biāo)本石蠟切片脫蠟、水化、流水沖洗，檸檬酸抗原高壓修復(fù)(pH=6.0)25 min，室溫冷卻 30 min；除去PBS，滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，室溫孵育30 min，PBS沖洗(3×3 min)；除去PBS，滴加一抗(CXCR2稀釋比例1:100)，室溫孵育60 min，PBS沖洗(3×3 min)；除去PBS，切片上滴加max vision HRP試劑，室溫孵育15 min，PBS沖洗(3×3 min)；除去PBS，滴加新鮮配制的DAB顯色劑顯色；流水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS返藍(lán)，DAB顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.3.2 免疫組化結(jié)果判定 CXCR2表達(dá)部位：細(xì)胞漿。所有評(píng)分均由2名高年資病理醫(yī)生進(jìn)行雙盲閱片，每張切片隨機(jī)取5 個(gè)(10×10)倍視野，進(jìn)行著色強(qiáng)度記分及陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分。著色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，25%<陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤50%為2分，50%<陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤75%為3分，>75%為4分；兩者相加之和<2分為(-)，2～3分為(+)，4～5分為(++)，6～7分為(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間資料采用2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCR2蛋白的表達(dá)部位 CXCR2可見(jiàn)表達(dá)于良性乳腺組織導(dǎo)管上皮細(xì)胞、部分肌上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞。

2.2 CXCR2蛋白在良惡性組織中的表達(dá) CXCR2 蛋白在乳腺腺病組、IBC-NST組均有表達(dá)，且表達(dá)程度不同，見(jiàn)圖1。CXCR2在乳腺腺病組表達(dá)大部分呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在IBC-NST組表達(dá)降低，乳腺腺病組與IBC-NST組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 CXCR2蛋白在良惡性組織中的表達(dá) 例

注：A:乳腺腺病CXCR2表達(dá);B:乳腺癌CXCR2表達(dá)(強(qiáng)陽(yáng)性);C:乳腺癌CXCR2表達(dá)(陽(yáng)性);D:乳腺癌CXCR2表達(dá)(弱陽(yáng)性)

2.3 CXCR2在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移IBC-NST中的表達(dá) CXCR2在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的IBC-NST及伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的IBC-NST中均表達(dá)下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 CXCR2在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移IBC-NST中的表達(dá) 例

2.4 CXCR2在不同分子分型IBC-NST中的表達(dá) 與LuminalA型組、LuminalB型組、HER2過(guò)表達(dá)組相比，CXCR2在TNBC中表達(dá)最低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LuminalA型組、LuminalB型組與HER2過(guò)表達(dá)組之間相互比較，CXCR2表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 CXCR2蛋白在乳腺腺病、非特殊類(lèi)型浸潤(rùn)型乳腺癌中的表達(dá) 例

3 討論

近年來(lái)，研究者們對(duì)趨化因子受體在腫瘤中的作用日益重視，目前已經(jīng)鑒定的趨化因子受體至少有20種[6]。CXCR2作為趨化因子CXCR家族中的1個(gè)重要成員，主要在特定炎癥細(xì)胞中表達(dá)，如中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞等，其可與CXCR家族其他成員結(jié)合，彼此形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。在調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)、細(xì)胞發(fā)育、新生血管生成和對(duì)腫瘤細(xì)胞和組織細(xì)胞的趨化等方面發(fā)揮重要功能。其主要功能是通過(guò)G蛋白變構(gòu)激活下游的效應(yīng)分子并進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生遷移、脫顆粒等一系列生物學(xué)效應(yīng)[7]。CXCR2是CXCL8的配體，對(duì)CXCL8具有高親和力，CXCL8是由中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞等分泌的一種小分子多肽，其不僅是一種重要的炎癥因子，同時(shí)具有促進(jìn)血管新生的特性，并具有致瘤性，兩者可通過(guò)受體-配體途徑介導(dǎo)CXCL8發(fā)揮生物學(xué)功能。

目前有文獻(xiàn)報(bào)道，CXCR2在多種腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用，如 可見(jiàn)CXCR2表達(dá)于前列腺癌、胃癌和部分乳腺癌等實(shí)體腫瘤中[8]。如將小鼠惡性黑色素瘤CXCR2基因進(jìn)行敲除后，其生長(zhǎng)速度、肺轉(zhuǎn)移率以及腫瘤血管生成明顯低于對(duì)照組[9]。也有研究表明[10-11]，骨髓來(lái)源的抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)已被證明有助于腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。Zhu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中，CXCR2+MDSCs(Ly6GmiLy6CloCD11b+CXCR2+)主要在系統(tǒng)和局部腫瘤微環(huán)境中擴(kuò)增和聚集，導(dǎo)致乳腺癌腫瘤組織的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。CXCR2+MDSC促進(jìn)乳腺癌的生長(zhǎng)和體內(nèi)轉(zhuǎn)移到肺和(或)淋巴結(jié)。趙曉婷等[13]研究，CXCR1和CXCR2在乳腺癌癌旁正常組織、IBC-NST和TNBC均有表達(dá)，呈強(qiáng)陽(yáng)性、中度陽(yáng)性陰性遞減，且兩者在TNBC中表達(dá)呈顯著正相關(guān)。

我們的研究結(jié)果表明，CXCR2蛋白在乳腺良性對(duì)照組、IBC-NST均有表達(dá)，且表達(dá)程度不同。CXCR2在良性對(duì)照組表達(dá)大部分呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在IBC-NST組呈較低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示CXCR2蛋白的表達(dá)與IBC-NST的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，與趙小婷等[13]研究結(jié)果相似。可能的作用機(jī)制是CXCR2 是CXCL8的配體，兩者可通過(guò)受體-配體途徑發(fā)揮生物學(xué)功能，在IBC-NST中，CXCR2與CXCL8結(jié)合減少，使得乳腺癌瘤體中CXCL8介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)減弱，使得體內(nèi)炎癥因子對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視減弱，而使得乳腺癌腫瘤組織得到了免疫逃逸，從而促進(jìn)了腫瘤組織的形成。

本研究顯示，與LuminalA型組、LuminalB型組、HER2過(guò)表達(dá)組相比，CXCR2在TNBC中表達(dá)最低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TNBC是IBC-NST的一種亞型，具有很強(qiáng)的異質(zhì)性，具有惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)和生存率低的特點(diǎn)，經(jīng)常發(fā)生骨轉(zhuǎn)移及腦轉(zhuǎn)移，對(duì)內(nèi)分泌治療和抗HER2靶向藥治療無(wú)效，化療是TNBC的主要治療手段，本研究結(jié)果提示CXCR2表達(dá)與腫瘤的侵襲性有一定的相關(guān)性，CXCR2表達(dá)降低促進(jìn)了腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。同時(shí)也有研究顯示，較高水平的CXCR2預(yù)示復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較低[14]，與其研究結(jié)果較一致。而對(duì)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行CXCR2檢測(cè)及評(píng)估，需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)。

趨化因子與趨化因子受體結(jié)合后，可參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移以上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)為基礎(chǔ)，EMT是指上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上向間質(zhì)轉(zhuǎn)變的過(guò)程，同時(shí)獲得遷移的能力，EMT參與組織愈合、器官纖維化和癌癥發(fā)生過(guò)程，腫瘤細(xì)胞在EMT的過(guò)程中發(fā)生了明顯變化，主要是腫瘤細(xì)胞急性改變，與周?chē)?xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)系接觸減少[15]。CXCR2+MDSCs促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展中的EMT作用[12]，而本研究發(fā)現(xiàn)CXCR2在IBC-NST表達(dá)降低，特別是在TNBC中表達(dá)最低，CXCR2在促進(jìn)了癌細(xì)胞的EMT中的作用需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

利益相關(guān)聲明：該論文不存在財(cái)務(wù)關(guān)系及作者間的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：曲延玉參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、閱片、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及論文撰寫(xiě)工作；黃金鳳參與了研究設(shè)計(jì)指導(dǎo)、閱片工作；劉祥偉參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、臨床資料質(zhì)控、數(shù)據(jù)分析及論文書(shū)寫(xiě)指導(dǎo)工作；李煒霞參與了免疫組化染色工作。