高建， 金亦， 林潔， 林圣， 段山△

1南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院婦幼醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室(廣東深圳 518040)； 2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科(廣東廣州 510630)； 3深圳市衛(wèi)生健康發(fā)展研究和數(shù)據(jù)管理中心分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室(廣東深圳 518028)

乳腺癌(breast neoplasms)是威脅全球女性健康的最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致女性死亡的主要惡性腫瘤之一[1]。有數(shù)據(jù)表明，全球新確診的每100例乳腺癌患者中，有12例來自中國，新發(fā)病例增長的速度是世界平均水平的2倍；另外，中國乳腺癌的平均診斷年齡為45～55歲，平均發(fā)病年齡亦比西方國家早10～15年[2-3]。由于乳腺癌是一種高度異質(zhì)性疾病，具有獨(dú)特且復(fù)雜的組織病理學(xué)模式和臨床行為，盡管有很多的研究成果，但其發(fā)生機(jī)制仍不完全清楚。非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)是人類基因轉(zhuǎn)錄組的主要組成部分，在細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用，且與許多病理狀況特別是癌癥有關(guān)[4-5]。ncRNA的亞類包括microRNA(miRNA)和多種長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)，如lincRNA、反義RNA、假基因和環(huán)狀RNA等；miRNA長約22個(gè)核苷酸，通過與靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的特定位點(diǎn)結(jié)合而執(zhí)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物降解或翻譯抑制[6-7]。lncRNA為大于200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄物，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，但不翻譯成蛋白質(zhì)，在哺乳動(dòng)物基因組中的數(shù)量最多[8]。競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)的機(jī)制表明，lncRNA可以通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合靶mRNA上的miRNA反應(yīng)元件(microRNA response elements, MRE)來抑制其功能，從而充當(dāng)天然miRNA的誘餌來調(diào)節(jié)基因表達(dá)；這些相互作用通常是相互關(guān)聯(lián)的，任何網(wǎng)絡(luò)組件的異常表達(dá)都可能破壞復(fù)雜的調(diào)節(jié)通路，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)展和進(jìn)展[9-11]。已有研究表明，ceRNA機(jī)制在乳腺癌中的作用是多樣的。Chi等[12]發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG5可削弱miR-154-5p對(duì)靶基因PCNA的抑制作用，進(jìn)一步增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的增殖；Yang等[13]的研究結(jié)果表明，miR-204能夠與參與乳腺癌上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的Sox4結(jié)合，而雌激素受體陰性患者體內(nèi)誘導(dǎo)的lncRNA ARNILA可作為miR-204的ceRNA來增強(qiáng)Sox4的表達(dá)，進(jìn)而參與了乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。Dong等[14]發(fā)現(xiàn)lncRNA TINCR在耐曲妥珠單抗乳腺癌患者中高表達(dá)，它可作為miR-125b調(diào)節(jié)HER2表達(dá)的“分子海綿”，敲低TINCR后，miR-125b表達(dá)增加，HER2表達(dá)降低，反之亦然，表明TINCR可能是預(yù)測(cè)和治療HER2陽性乳腺癌的潛在靶點(diǎn)。為此，我們采用人類全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)譜芯片和miRNA芯片來篩選異常表達(dá)的lncRNA、miRNA和mRNA，進(jìn)而構(gòu)建乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的特異性ceRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而為深入了解該病的發(fā)病機(jī)制提供新的研究思路。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2016年3月至2018年3月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院就診，行手術(shù)切除且經(jīng)病理確診的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織標(biāo)本68例，所選乳腺癌患者全部為女性，中位年齡50.5歲，年齡范圍24～81歲；癌組織的分子分型標(biāo)準(zhǔn)參考圣加侖國際專家共識(shí)[13]和中國抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診療指南和規(guī)范(2013版)。

入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病例均由兩名副主任醫(yī)師及以上級(jí)別的醫(yī)師核實(shí)確認(rèn)；(2)乳腺癌病理學(xué)分型及組織學(xué)分級(jí)參照乳腺腫瘤世界衛(wèi)生組織分類(2012版)進(jìn)行，所有標(biāo)本均為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(Ⅰ級(jí)～Ⅲ級(jí))；(3)術(shù)前均未行放療和化療；(4)獲得患者及家屬的知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)確診為非乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者；(2)術(shù)前已進(jìn)行乳腺癌相關(guān)治療的患者；(3)相關(guān)資料不完整者；(4)合并有其他部位惡性腫瘤或其他嚴(yán)重疾病的患者。

同時(shí)收集同期乳腺良性組織標(biāo)本14例。標(biāo)本離體30分鐘內(nèi)置超低溫冰箱保存。該研究已獲得深圳市衛(wèi)生健康發(fā)展研究中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：2019-004)。

1.2 主要試劑和儀器 GeneChipTMHuman Transcriptome Assay 2.0、GeneChipTMWT PLUS Reagent Kit、GeneChipTMHybridization, Wash, and Stain Kit、GeneChipTMmiRNA4.0 Aaary、FlashTagTMBiotin HSR RNA Labeling Kit以及基因芯片雜交、洗滌和掃描系統(tǒng)均購自美國Thermo Fisher公司；AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal Kit和IPA(Ingenuity Pathway Analysis)應(yīng)用軟件購自德國Qiagen公司。

1.3 芯片操作和差異表達(dá)分析 組織總RNA的提取根據(jù)AllPrep DNA/RNA Mini Kit說明書操作。對(duì)于HTA2.0芯片，采用WT PLUS Reagent Kit對(duì)總RNA依次反轉(zhuǎn)錄合成cDNA、體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA、生物素標(biāo)記和cRNA片段化后，與HTA2.0芯片進(jìn)行雜交；對(duì)于miRNA4.0芯片，采用Biotin HSR RNA Labeling Kit對(duì)總RNA中的miRNA進(jìn)行加尾和生物素標(biāo)記后，與miRNA 4.0芯片進(jìn)行雜交。雜交后的芯片經(jīng)洗滌工作站洗滌、染色后，置于芯片掃描儀掃描，采用配套軟件TAC4.0對(duì)芯片質(zhì)量和數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測(cè)和分析，當(dāng)同時(shí)滿足ANOVAP<0.05且|Fold Change (linear)|>2時(shí)認(rèn)為RNA分子存在差異表達(dá)。

1.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理和ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 從Affymetrix官網(wǎng)獲得HTA-2.0芯片的注釋文件，找到對(duì)應(yīng)的基因組位置信息，然后在NONCODE數(shù)據(jù)庫中搜索對(duì)應(yīng)基因組位置的lncRNA轉(zhuǎn)錄本作為探針對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本，如果一個(gè)探針對(duì)應(yīng)多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，則選擇最長的轉(zhuǎn)錄本。利用R軟件中的“DCRNATools”包[14]構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)，該包中整合了SpongeScan、StarBase v.2.0、mirTarBase以及 miRcode四個(gè)數(shù)據(jù)庫中miRNA與lncRNA、mRNA的互作關(guān)系，其中StarBase v.2.0數(shù)據(jù)庫具有更多和更全面的lncRNA-miRNA和mRNA-miRNA的關(guān)系對(duì)。ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)lncRNA與mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，判斷標(biāo)準(zhǔn)為相關(guān)系數(shù)>0.3和P<0.05；(2)lncRNA和mRNA具有與某個(gè)miRNA結(jié)合的相同MRE；(3)從構(gòu)建好的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中篩選受到同一個(gè)miRNA調(diào)控的mRNA和lncRNA，作為特異性ceRNA的子網(wǎng)絡(luò)，用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化。

1.5 利用IPA軟件分析失調(diào)表達(dá)mRNA的生物學(xué)功能 IPA是一個(gè)基于云計(jì)算的一體化的商業(yè)應(yīng)用軟件，其所有解決方案都依賴Ingenuity Knowledge Base，它是一個(gè)由專家編譯的生物學(xué)相互作用以及功能注釋的知識(shí)庫，來源于蛋白、基因、復(fù)合物、細(xì)胞、組織、藥物以及疾病間獨(dú)立的建模關(guān)系，還包括人工閱讀提取的幾百萬條公開發(fā)表的科研成果和報(bào)告。本文利用該軟件來分析上調(diào)和下調(diào)表達(dá)mRNA所參與的經(jīng)典通路、生物學(xué)功能以及疾病關(guān)聯(lián)情況。

2 結(jié)果

2.1 受試者臨床資料 本研究所收集到的68例女性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌樣本中，涵蓋了乳腺癌常見的分子分型，典型的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖1，其中Luminal A型有17例(圖1-A)、Luminal B型有32例(圖1-B)、HER2過表達(dá)型有9例(圖1-C)和三陰性乳腺癌有10例(圖1-D)。組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)有24例，Ⅱ級(jí)有25例，Ⅲ級(jí)有19例。

注：A：Luminal A型；B：Luminal B型；C：HER2過表達(dá)型；D：三陰性乳腺癌

2.2 差異表達(dá)分析 數(shù)據(jù)經(jīng)過驗(yàn)證和去重復(fù)處理后，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織與乳腺良性組織相比，差異表達(dá)的mRNAs有513個(gè)，其中上調(diào)的有353個(gè)，下調(diào)的有160個(gè)(圖2-A)；差異lncRNAs有293個(gè)，其中上調(diào)的有156個(gè)，下調(diào)的有137個(gè)(圖2-B)；差異表達(dá)的miRNAs有165個(gè)，其中上調(diào)的有29個(gè)，下調(diào)的有136個(gè)(2-C)；其中差異表達(dá)最顯著的上調(diào)和下調(diào)的mRNA、lncRNA和miRNA各10個(gè)的列表見表1。

注：A為差異表達(dá)mRNAs火山圖；B為差異表達(dá)lncRNAs火山圖；C為差異表達(dá)miRNAs火山圖。藍(lán)點(diǎn)標(biāo)記為下調(diào)的RNA分子，紅點(diǎn)標(biāo)記為上調(diào)的RNA分子。|Fold Change (linear)|>2且P<0.05的RNA分子被認(rèn)為存在差異表達(dá)。

表1 差異表達(dá)最顯著的上調(diào)和下調(diào)mRNAs、lncRNAs和miRNAs各10個(gè)列表

2.3 差異表達(dá)mRNAs的生物學(xué)功能分析 利用IPA分析預(yù)測(cè)差異表達(dá)mRNAs所參與的經(jīng)典通路和已知疾病以及生物學(xué)過程，上調(diào)表達(dá)的代表性mRNAs有STAT1、TGFB3、EDN1、FN1、TLR9、SOCS和PRL等，主要參與的經(jīng)典通路有樹突狀細(xì)胞成熟、先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞之間的通訊、同種異體排斥信號(hào)、B細(xì)胞發(fā)育和T輔助細(xì)胞分化等，其中樹突狀細(xì)胞成熟處于激活狀態(tài)；細(xì)胞學(xué)功能主要涉及腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞損害、細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移、細(xì)胞生長和增殖、晚期惡性腫瘤、細(xì)胞間信號(hào)和相互作用等(圖3-A和3-C)。下調(diào)表達(dá)的代表性mRNA有STST3、SP1、RELA、ERBB2、EGF、SP1和SMARC4等，主要參與的經(jīng)典通路有腫瘤微環(huán)境通路、HIF1α通路、HOTAIR調(diào)控通路、軸突導(dǎo)向信號(hào)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制通路等，其中前3個(gè)通路處于抑制狀態(tài)，基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制作用處于激活狀態(tài)；細(xì)胞學(xué)功能主要涉及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、有絲分裂、細(xì)胞骨架生長、細(xì)胞周期、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞生長和增殖和翻譯后修飾等(圖3-B和3-D)。

注： A為表達(dá)上調(diào)mRNAs在通路和分子過程中的相互關(guān)系；B為表達(dá)下調(diào)mRNAs在通路和分子過程中的相互關(guān)系；C為表達(dá)上調(diào)mRNAs對(duì)疾病和功能的影響； D為表達(dá)下調(diào)mRNAs對(duì)疾病和功能的影響。紅色表示激活，藍(lán)色表示抑制。

2.4 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中ceRNA網(wǎng)絡(luò)及特異性子網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過R軟件中的“GDCRNATools”包和Cytoscape軟件構(gòu)建了差異表達(dá)lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)(圖4-A)。受到同一個(gè)miRNA調(diào)控的mRNA和lncRNA的特異性ceRNA子網(wǎng)絡(luò)結(jié)果表明，4個(gè)lncRNAs，即TC16001656.hg.1、TC15002548.hg.1、TC22001008.hg.1和TC22001009.hg.1，分別通過與hsa-miR-152-3p、hsa-miR-758-3p和hsa-miR-378d結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控61個(gè)mRNAs的表達(dá)(圖4-B)。

注： A為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌差異表達(dá)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)；B為差異表達(dá)特異性ceRNA子網(wǎng)絡(luò)。紅色菱形代表差異lncRNA，綠色圓形代表差異mRNA，藍(lán)色箭頭代表差異miRNA

3 討論

不同類型RNA分子之間的相互作用對(duì)轉(zhuǎn)錄組的穩(wěn)定、維持和調(diào)控至關(guān)重要[15]。在病理狀態(tài)下，很多基因的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生顯著的改變，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)異常。因此，篩選和鑒定轉(zhuǎn)錄組中異常表達(dá)的RNA分子是闡明疾病分子機(jī)制的有效途徑之一[16]。近年來，全基因組表達(dá)分析已經(jīng)成為一種常規(guī)的分析工具，尤其是為研究和理解關(guān)鍵基因在癌癥進(jìn)展中的功能提供了一個(gè)很好的解決方案[17-18]。在本研究中，采用人類全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)芯片和miRNA芯片來檢測(cè)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中表達(dá)異常的RNA分子，不但可以一次性檢測(cè)所有已知基因(包括編碼基因和非編碼基因)水平的表達(dá)譜，而且可以準(zhǔn)確分析幾乎所有已知的轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體，檢測(cè)效率和準(zhǔn)確度都非常高。另外，本研究所納入的樣本組織特性均一、代表性強(qiáng)，基本涵蓋了浸潤性乳腺癌的所有分子分型，使得差異表達(dá)的結(jié)果可靠性較強(qiáng)。

競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源ceRNA學(xué)說揭示了RNA分子間相互作用的新機(jī)制。在生理和病理?xiàng)l件下，各種相關(guān)基因和ceRNA網(wǎng)絡(luò)緊密交織在一起。不同類別的ncRNA的功能多樣性及其相互作用的可塑性增加了可能在惡性腫瘤中脫軌的多層調(diào)控通路，最終導(dǎo)致了癌癥的發(fā)展和進(jìn)展[19]。多項(xiàng)研究表明，ceRNA網(wǎng)絡(luò)可調(diào)控乳腺癌的方方面面。Linc-ROR通過miR-194-3p靶向MECP2促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展并降低對(duì)雷帕霉素的敏感性[20]；長非編碼RNA LINC00511通過誘導(dǎo)miR-185-3p/E2F1/Nanog軸參與乳腺癌的發(fā)生和莖化[21]；LncRNA-CDC6通過miRNA-215作為靶向CDC6的ceRNA促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)程[22]；LINC00673被YY1激活后通過miR-515-5p/MARK4/Hippo信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖[23]；最近的一項(xiàng)在乳腺浸潤性癌中的研究表明，兩個(gè)NEAT1相關(guān)ceRNA的異常表達(dá)可能導(dǎo)致TP53突變患者對(duì)他莫昔芬治療的不良反應(yīng)，提示ceRNA網(wǎng)絡(luò)可以作為預(yù)測(cè)不同癌癥藥物反應(yīng)的工具[24]。在本研究所構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中，位于關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的3個(gè)miRNAs在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中均下調(diào)表達(dá)，與多篇文獻(xiàn)報(bào)道一致。miR-152作為腫瘤抑制因子在乳腺癌中下調(diào)表達(dá)，可通過靶向PIK3CA來抑制AKT和RPS6的激活，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞系HCC1806的增殖，也可通過負(fù)調(diào)控褪黑素來抑制三陰性乳腺癌血管生成因子，還可靶向SPIN1通過上調(diào)藥物代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)增強(qiáng)乳腺癌的阿霉素耐藥性[25-27]。miR-378d可經(jīng)化療產(chǎn)生，通過激活 EZH2/STAT3 信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌的干性和耐藥性, 因此，在化療期間阻斷這種適應(yīng)機(jī)制可能會(huì)減少化療耐藥性的發(fā)展并最大限度地提高乳腺癌的治療效果[28]。miR-758-3p以lncRNA DANCR-miR-758-3p-PAX6的ceRNA分子網(wǎng)絡(luò)形式調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的凋亡和自噬[29]。ceRNA的作用機(jī)制提示，本文所構(gòu)建的特異性ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)RNAs，很有可能是參與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵因子。

綜上所述，lncRNA可以調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程，它們作為競(jìng)爭(zhēng)性miRNA的誘餌作用，通過ceRNA網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)各種癌癥中的基因表達(dá)。本研究成功構(gòu)建了乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中關(guān)鍵lncRNA相關(guān)的ceRNA特異性網(wǎng)絡(luò)，這些發(fā)現(xiàn)有利于為進(jìn)一步研究乳腺癌基因間的調(diào)控機(jī)制提供了新的思路和研究方向。下一步，我們將繼續(xù)探索與這4個(gè)lncRNAs分別發(fā)生作用的miRNAs以及mRNAs，采用體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證它們?cè)谌橄侔┑墓δ堋?/p>

利益相關(guān)聲明：全體作者都閱讀并同意最終的文本，所有作者均沒有利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：高建是本研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)者和負(fù)責(zé)人，完成數(shù)據(jù)分析和論文初稿的寫作，金亦負(fù)責(zé)標(biāo)本的收集、臨床診斷和臨床表型分析以及臨床資料的整理和隨訪，林潔負(fù)責(zé)芯片實(shí)驗(yàn)的操作，林圣完成數(shù)據(jù)的挖掘分析，段山指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并參與論文的校對(duì)和定稿等。中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院是本研究的合作單位，主要負(fù)責(zé)樣本的提供。