吳振村, 周艷

1張家口市婦幼保健院檢驗科(河北張家口 075000)；2河北北方學院免疫教研室(河北張家口 075000)

乳腺癌(breast cancer，BC)是最常見的危害女性健康的惡性腫瘤，是全世界婦女癌癥死亡的第二大原因[1]。據(jù)統(tǒng)計，全球每年約有160多萬婦女被診斷患有乳腺癌，雖然乳腺癌的早期診斷和早期治療取得了顯著進展，但每年仍有約52萬人死于該疾病，約占所有癌癥死亡人數(shù)的25%[2]。可能原因包括發(fā)現(xiàn)晚、易復發(fā)轉移[3-5]等。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移與多種基因的調控密切相關[6]。目前，乳腺癌高危人群的基因檢測和靶向基因治療正在迅速出現(xiàn)[7]，是除常規(guī)療法之外又一新的重要治療方法。近年來，采用RNA干擾技術沉默特定基因在乳腺癌治療研究中取得了良好的效果。郭智慧等[8]采用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術沉默乳腺癌細胞DEK基因、管海濤等[9]利用siRNA技術沉默survivin的表達均可顯著抑制乳腺癌細胞增殖和誘導凋亡。我們前期研究發(fā)現(xiàn)人類白細胞抗原-E(human leukocyte antigen-E，HLA-E)基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)生相關[10-12]，基于前期研究，2021年1—12月本研究設計并合成了HLA-E siRNA序列，探討siRNA技術沉默人乳腺癌細胞HLA-E基因表達對乳腺癌細胞增殖與凋亡及對裸鼠移植瘤生長的影響，為乳腺癌靶向治療奠定理論基礎。本研究得到張家口市婦幼保健院實驗動物倫理委員會批準(編號：KYLL-2020-001)。

1 材料與方法

1.1 材料 Vigofect轉染試劑(北京威格拉斯生物技術有限公司); DMEM干粉(Gibco公司); SuperRT cDNA Synthesis Kit(北京康為世紀生物有限公司)；UltraSYBR Mixture(Low ROX) (北京康為世紀生物有限公司)；鼠抗人HLA-E單克隆抗體(ab11821，Abcam公司)；CCK-8試劑盒(碧云天)；ECL化學發(fā)光試劑盒(碧云天)；乳腺癌MDA-MB-231細胞(本室保存)，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(DMEM-10)，5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；雌性BALB/c 裸鼠20只，4～6周齡(中國食品藥品檢定研究院)。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設計 從ncbi數(shù)據(jù)庫中獲取人HLA-E mRNA序列(GenBank:X56841.1)，利用siRNA在線設計軟件及RNA二級結構分析軟件，設計并篩選與預測HLA-E mRNA容易結合的siRNA序列，作為HLA-E siRNA，采用隨機打亂的方法設計陰性對照siRNA序列。

1.2.2 轉染siRNA至乳腺癌細胞 實驗分3組,空白對照組不加任何試劑;陰性對照組轉染陰性對照siRNA;HLA-E siRNA組轉染HLA-E siRNA。取對數(shù)生長期乳腺癌細胞MDA-MB-231，接種于6孔板，培養(yǎng)細胞達60%～80%融合度。取5 μg HLA-E siRNA序列或陰性對照siRNA序列分別與2 μL VigoFect 轉染試劑混勻于100 mL生理鹽水，室溫靜置15 min后逐滴加入培養(yǎng)細胞液中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。

1.2.3 Real-time PCR檢測HLA-E mRNA水平 收集轉染48 h各組細胞，TRIZOL裂解法提取細胞總RNA，Eppendorf核酸定量測定儀檢測RNA濃度和純度，行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。取1 μg總RNA，反轉錄合成cDNA，采用UltraSYBR Mixture(Low ROX)進行 Real-time PCR檢測HLA-E mRNA表達。

1.2.4 Western blot分析HLA-E 蛋白水平 收集轉染48 h各組細胞，用預冷的RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。按80 μg/孔上樣量進行12%SDS-PAGE凝膠電泳，分離后蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，鼠抗人HLA-E單抗(1∶2 000)4℃孵育過夜，PBS-T洗滌后，加入羊抗鼠二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，PBS-T洗滌后，加入ECL底物顯色。

1.2.5 CCK-8法檢測轉染后細胞生長抑制率 取對數(shù)生長期細胞，調整密度為2×104個/mL，取100 μL懸液接種于96孔板內，設立空白對照組、陰性對照組和HLA-E siRNA組，每組設6個平行孔。轉染48 h后，每孔細胞加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀測定450 nm處吸光度值(OD450)。

1.2.6 流式細胞術檢測轉染后細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞按4×105個/mL接種于6孔板，設立空白對照組、陰性對照組和HLA-E siRNA組，轉染48 h，收集各組細胞，調整細胞濃度為1×106·mL-1，Annexin V-FITC/PI(碘化丙啶)雙染色后，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.2.7 裸鼠移植瘤實驗 取對數(shù)生長期MDA-MB-231細胞，消化成單細胞懸液，生理鹽水稀釋至2×107·mL-1，取0.2 mL接種于裸鼠右腋皮下，待觸摸到接種部位有瘤組織形成時，將裸鼠隨機分為空白對照組、陰性對照組和HLA-E siRNA組，每組6只，分別瘤內注射生理鹽水、陰性對照siRNA(1 mg/kg)和HLA-E siRNA(1 mg/kg)。每隔1 d觀察記錄瘤體大小。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，單因素方差分析進行數(shù)據(jù)分析，兩組之間比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HLA-E siRNA的設計合成 根據(jù)HLA-E mRNA序列，利用siRNA在線設計軟件(http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html)及RNA二級結構分析軟件，篩出一條與HLA-E mRNA預測結構容易結合的HLA-E siRNA，序列為：5′-CACUCAUGUUGAGACUUAAUC-3′(正義鏈)，5′-UUAAGUCUCAACAUGAGUGUU-3′(反義鏈)；陰性對照siRNA序列為：5′-UCAGUCGUATTUUGCCAGGCCGG-3′(正義鏈)，5′-GCCGUGAUCAGGUGCUCACAGC-3′ (反義鏈)。兩種siRNA序列由上海生工合成。

2.2 轉染后細胞HLA-E mRNA表達水平 細胞總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，電泳圖有3條清晰帶，即是28 s、18 s和5 s，說明提取的每組細胞總RNA完整性較好(圖1)。Real-time PCR結果顯示，HLA-E siRNA組細胞HLA-E mRNA水平(0.53±0.07)顯著低于空白對照組(1.03±0.08)和陰性對照組(0.90±0.04)(P<0.01)，空白對照組和陰性對照組HLA-E mRNA水平?jīng)]有明顯差異。轉染課題組設計的HLA-E siRNA序列可顯著沉默乳腺癌細胞HLA-E表達。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取的細胞總RNA完整性

2.3 轉染后細胞HLA-E蛋白表達水平 Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，轉染48 h后，HLA-E siRNA組未檢測到HLA-E蛋白表達，空白對照組和陰性對照組HLA-E 表達沒有明顯差異(圖2)。轉染HLA-E siRNA可沉默乳腺癌細胞HLA-E蛋白表達。

圖2 Western blot 檢測轉染后乳腺癌細胞HLA-E 蛋白表達水平

2.4 轉染后細胞生長抑制率 CCK-8法檢測結果顯示，陰性對照組細胞生長抑制率是(8.18±0.83)%，HLA-E siRNA轉染組的細胞生長抑制率為(50.84±5.60)%，顯著高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。轉染HLA-E siRNA可明顯抑制乳腺癌細胞增殖。

2.5 轉染后細胞凋亡率 流式細胞術檢測轉染HLA-E siRNA后MDA-MB-231細胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)空白對照組細胞凋亡率為(2.14±0.98)%，陰性對照組細胞凋亡率為(3.21±1.05)%，轉染組細胞凋亡率為(12.63±1.50)%，顯著高于空白對照組和陰性對照組。轉染HLA-E siRNA可誘發(fā)乳腺癌細胞凋亡。

2.6 裸鼠移植瘤生長情況 裸鼠體內實驗結果顯示，至接種30 d時，空白對照組、陰性對照組和HLA-E siRNA組小鼠瘤組織體積分別為(423±18)mm3、(393±18)mm3、(156±9)mm3。HLA-E siRNA組小鼠瘤組織體積顯著小于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3 討論

HLA-E是非經(jīng)典的HLA-I類基因(HLA-Ib)，其多態(tài)性有限、組織分布廣泛、正常細胞表面低表達、但病理條件如腫瘤或自身免疫病細胞表面高表達[13]。Huang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，結直腸癌組織HLA-E表達顯著高于結直腸正常和腺瘤組織，且認為HLA-E高表達促進了早期結直腸癌的免疫逃逸；?zgül ?zdemir等[15]也發(fā)現(xiàn)結直腸瘤組織非經(jīng)典HLA-G和HLA-E表達顯著高于非癌性組織，HLA-G和HLA-E表達增加可能是腫瘤免疫逃逸的一種方式， 因此HLA-G和HLA-E可能是結直腸瘤免疫治療的潛在靶點；Gooden等[16]分析卵巢癌和宮頸癌組織HLA-E表達發(fā)現(xiàn)，HLA-E在這些腫瘤中高表達，HLA-E的存在可中和卵巢癌內浸潤的細胞毒性T細胞(CTL)的保護作用；非小細胞肺癌的一項研究也發(fā)現(xiàn)[17]，HLA-E高表達阻礙了肺腺癌內浸潤CD8+T細胞的有益作用，HLA-E高表達是肺腺癌總體生存期的一個獨立的負預后因素。目前HLA-E在乳腺癌組織表達的相關研究發(fā)現(xiàn)，約27%乳腺浸潤性導管癌組織高表達HLA-E，且約21%高異型性核病變中高表達HLA-E[18-19]；de Kruijf等[20]研究認為，瘤組織HLA-E高表達可顯著影響乳腺癌的預后，乳腺癌可通過上調或下調經(jīng)典HLA-Ia類基因和非經(jīng)典HLA-Ib類基因逃避宿主免疫系統(tǒng)對腫瘤的清除。我們前期分析也發(fā)現(xiàn)HLA-E等位基因可能是乳腺癌的易感基因[10-11]。這一系列的研究表明，HLA-E基因參與了多種腫瘤的發(fā)展，與腫瘤逃逸相關，可能是腫瘤免疫治療潛在靶點。因此，我們首次選用HLA-E基因，探討抑制HLA-E基因對乳腺癌細胞增殖與凋亡的影響，以期為乳腺癌免疫治療提供新的靶點。

siRNA是由外源或內源性雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)導入細胞而引起的與dsRNA同源的mRNA降解，進而高效、特異地阻斷體內相應基因的表達[21]。目前siRNA技術治療的主要目標之一是癌癥。因為癌基因、突變的抑癌基因和許多不同基因參與了腫瘤的發(fā)展，是潛在的siRNA沉默的靶目標，通過siRNA下調突變基因或沉默不需要的基因正成為一種抑制腫瘤細胞生長和侵襲的非常有吸引力的方法[21]。研究發(fā)現(xiàn)，siRNA技術同時沉默HER2基因和uPAR基因顯著抑制乳腺癌細胞增殖并誘導凋亡，可能為乳腺癌治療提供了有效的方法[22]；靶向沉默趨化因子受體CXCR4基因可顯著阻礙乳腺癌細胞的侵襲性和黏附性[23-24]；靶向p-糖蛋白的siRNA技術可下調乳腺癌細胞p-糖蛋白表達，并提高乳腺癌對化療的敏感度，顯著抑制瘤細胞生長[25]。

因此，我們采用siRNA技術靶向沉默乳腺癌細胞HLA-E基因表達，探討了乳腺癌細胞的增殖和凋亡。研究設計并合成了HLA-E siRNA序列，轉染至人乳腺癌細胞系MDA-MB-231，發(fā)現(xiàn)可顯著沉默乳腺癌細胞HLA-E表達，且研究發(fā)現(xiàn)HLA-E siRNA轉染MDA-MB-231細胞后可明顯抑制乳腺癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，并能夠抑制裸鼠移植瘤的生長。因此，靶向HLA-E siRNA技術能有效抑制靶基因的表達和乳腺癌細胞增殖及誘導乳腺癌細胞凋亡，可能是潛在乳腺癌免疫治療的新方法。

我們研究的不足之處是未能分析siRNA技術沉默HLA-E，抑制乳腺癌細胞生長的機制，Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)siRNA技術沉默乳腺癌細胞HER2和uPAR表達引起了MAPK信號通路的抑制，導致ERK活性降低及p38/ERK活性比值升高，從而抑制了癌細胞生長和誘導細胞凋亡。因此后續(xù)需將siRNA靶向沉默HLA-E分子機制作為研究重點。

利益相關聲明：文中所有作者認同無任何利益沖突。

作者貢獻說明：吳振村參與了實驗設計和論文撰寫，周艷參與了實驗操作。