李軍, 黃梅, 林曼迪, 吳代陸

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺科(廣東廣州 510405)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率較高，是危害女性健康的頭號殺手。銀杏葉提取物(extract of Ginkgo biloba，EGB)的主要成分為銀杏黃酮類化合物、萜內(nèi)酯類化合物，諸多研究顯示EGB能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，且能增強(qiáng)化療藥物的抑瘤作用[1-3]，但其在乳腺癌中的作用及機(jī)制研究鮮有報(bào)道。細(xì)胞焦亡是近年來發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的一種新的程序性細(xì)胞死亡方式，涉及炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等途徑[4]。NLRP3 炎性小體是目前公認(rèn)的在經(jīng)典焦亡途徑中具有關(guān)鍵作用的焦亡因子，在GSDMD 焦亡通路中也發(fā)揮作用[5-6]。有研究顯示，乳腺結(jié)節(jié)和乳腺腫瘤之間是存在遞進(jìn)關(guān)系的，而形成乳腺結(jié)節(jié)期間，結(jié)節(jié)局部會(huì)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，此時(shí)NLRP3 炎性小體存在異常的高表達(dá)，因此推斷，NLRP3 炎性小體可能作為早期乳腺腫瘤診斷的潛在標(biāo)志物[7]。鈣激活中性蛋白酶(calcium-activated neutral protease，calpain)可通過水解特定的酶以及蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)活動(dòng)，與多種惡性生物學(xué)行為的發(fā)生密切相關(guān)，有研究表明Calpain活性上調(diào)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。研究顯示，在乳腺癌患者中Th17/Treg存在失衡現(xiàn)象，且 Th17/Treg 比值變化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，因此，Th17/Treg 的平衡失調(diào)可能在乳腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移中起著很重要的作用[9]?；诖耍狙芯坑?019年3月至2021年10月，通過觀察 EGB 對乳腺癌 MCF-7細(xì)胞增殖、焦亡的影響，探討 EGB 可能的抗腫瘤作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 藥物與試劑 EGB(17.5 mg/5 mL，德國威瑪舒培博士藥廠生產(chǎn)，批號：1710711)；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國 Gibco 公司，批號：110316，110310)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(美國Sigma 公司，批號：110210)；碘化丙啶(PI)(美國Sigma 公司，批號100619)；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20130620)；凋亡檢測試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司，批號：100806)；Calpain-1、NLRP3、Th17、Treg、caspase-1、cleaved caspase-1、GSDMD、β-actin抗體(美國 Abcam 公司，貨號：ab39170、ab263899、ab169809、ab239517、ab179515、ab74279、ab219800、ab8226)。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司，型號：NAPCO 8000DH)；流式細(xì)胞儀(美國 Becton Dickinson公司，型號：FACSIO1)；倒置顯微鏡(日本Olympus，型號：IX-70)；酶標(biāo)儀(瑞士Tecan，型號：Infinite M200 PRO)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞置于 10% 胎牛血清、2% 青霉素和鏈霉素的 RPMI-1640 液體培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 傳代 1 次，選用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行下一步試驗(yàn)。取50 mg EGB 溶解于100 mL含 0.1% 的DMSO的培養(yǎng)基中，用 0.22 μm 濾膜過濾，置于4℃冰箱中備用。

1.5 MTT 法測定細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的 MCF-7 細(xì)胞制成1×106·mL-1細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 24 h，加入EGB 100 μL，使其終濃度分別為0、10、20、40、80、160 mg/L，其中以0 mg/L為對照組，每個(gè)濃度重復(fù) 3 孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入 20 μL MTT 溶液(5 g/L)培養(yǎng) 4 h，吸去全部上清液，然后每孔加入200 μL二甲基亞砜，振蕩搖勻終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在490 nm 處測吸光度(A)。每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算增殖抑制率。抑制率(%)=[1-(A藥物組-A對照組)/A對照組]×100%

1.6 細(xì)胞形態(tài)觀察 取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞制成1×106·mL-1細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板中，加入EGB 使其終濃度分別為 0、10、20、40、80、160 mg/L。培養(yǎng)48 h 后，取出6孔板在 3 目倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞焦亡 取對數(shù)生長期的 MCF-7 細(xì)胞制成 1×106·mL-1細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，加入EGB 使其終濃度分別為 0、10、20、40、80、160 mg/L，培養(yǎng)48 h 后，取1 mL細(xì)胞懸液，離心 10 min(1 000 r/min，4℃)棄去上清液，加入1 mL冷PBS重懸細(xì)胞，再次離心，棄去上清，加入 200 μL 結(jié)合緩沖液重懸，然后加入 cleaved caspase-1試劑，避光室溫孵育20 min；加入 10 μL PI，加入300 μL 結(jié)合緩沖液，30 min 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測，cleaved caspase-1 (+)/PI(+)占總細(xì)胞的百分比乳腺癌細(xì)胞焦亡率[10-11]。每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 檢測LDH釋放量 取對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞制成1×106·mL-1細(xì)胞懸液，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)液，更換為含1 %血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后加入試劑盒提供的乳酸脫氫酶釋放試劑15 μL，按照LDH試劑盒說明書測量 LDH 釋放量。每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

LDH 釋放量(%)=上清液 LDH 量/(上清液LDH量+裂解液 LDH 量)×100%

1.9 WB檢測MCF-7細(xì)胞中Calpain-1、NLRP3、Th17、Treg、caspase-1、cleaved caspase-1、GSDMD的蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞制成1×106·mL-1細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 24 h，然后加入EGB 100 μL，使其終濃度分別為0、10、20、40、80、160 mg/ L，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，收集各組細(xì)胞置于1.5 mL EP管，加入RIPA裂解液提取蛋白，使用BCA方法測定蛋白濃度，取 40 μg 蛋白加入緩沖液變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜上、封閉，分別加入一抗Calpain-1(1∶500)、NLRP3(1∶400)、Th17(1∶500)、Treg(1∶500)、caspase-1(1∶1 000)、cleaved caspase-1(1∶1 000)、GSDMD(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)，4℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育1 h，采用ECL顯色，拍照并用 Image J 1.48 u軟件進(jìn)行灰度值分析，每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 EGB對MCF-7 細(xì)胞增殖的影響 在10～160 mg/L濃度范圍內(nèi)，EGB可顯著抑制 MCF-7 細(xì)胞的增殖(P<0.01)，且抑制作用隨著EGB濃度的增加、作用時(shí)間的延長逐漸增強(qiáng)。見表1。

表1 不同時(shí)間不同濃度EGB對MCF-7細(xì)胞生長抑制率(n=3)

2.2 EGB對MCF-7 細(xì)胞形態(tài)的影響 未經(jīng)EGB處理的細(xì)胞生長狀況良好，透明度大，折光性強(qiáng)，并可見許多分裂期細(xì)胞；經(jīng)過EGB(40、80、160 mg/L)處理的細(xì)胞，生長狀況明顯變差，折光性弱，貼壁細(xì)胞皺縮，與未處理細(xì)胞比較有顯著差異。見圖1。

注：A: 0 mg/L EGB; B: 10 mg/L EGB; C: 20 mg/L EGB; D: 40 mg/L EGB; E: 80 mg/L EGB; F: 160 mg/L EGB

2.3 EGB對MCF-7 細(xì)胞焦亡的影響 在10～160 mg/L濃度范圍內(nèi)，EGB可使MCF-7細(xì)胞發(fā)生焦亡，且與0 mg/L組(空白組)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，且隨著EGB濃度的增加MCF-7細(xì)胞的焦亡率明顯增加。見表2、圖2。

注：A～F分別為EGB濃度0、 10、 20、 40、 80、 160 mg/L

表2 不同濃度EGB對MCF-7細(xì)胞焦亡的影響(n=3)

2.4 EGB對MCF-7 細(xì)胞LDH釋放量的影響 在10～160 mg/L濃度范圍內(nèi)，EGB可明顯增加 MCF-7 細(xì)胞的LDH釋放量(P<0.01)，且隨著EGB濃度的增加MCF-7 細(xì)胞LDH釋放量明顯增加。見表3。

表3 不同濃度EGB對MCF-7細(xì)胞LDH釋放量的影響(n=3)

2.5 EGB對MCF-7 細(xì)胞caspase-1、cleaved caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)的影響 在20～160 mg/L濃度范圍內(nèi)，EGB可明顯增加 MCF-7 細(xì)胞中GSDMD、caspase-1、cleaved caspase-1蛋白表達(dá)(P<0.01)，且隨著EGB濃度的增加作用更強(qiáng)。見表4、圖3。

圖3 不同濃度EGB對MCF-7細(xì)胞GSDMD、caspase-1、cleaved caspase-1蛋白表達(dá)的影響

表4 不同濃度EGB對MCF-7細(xì)胞GSDMD、caspase-1、cleaved caspase-1蛋白表達(dá)的影響(n=3)

2.6 EGB對MCF-7 細(xì)胞Calpain-1、NLRP3蛋白表達(dá)的影響 在20～160 mg/L濃度范圍內(nèi)，EGB可明顯降低 MCF-7 細(xì)胞中Calpain-1、NLRP3蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，且隨著EGB濃度的增加作用更強(qiáng)。見表5、圖4。

圖4 不同濃度EGB對MCF-7細(xì)胞Calpain-1、NLRP3蛋白表達(dá)的影響

表5 不同濃度EGB對MCF-7細(xì)胞Calpain-1、NLRP3蛋白表達(dá)的影響(n=3)

2.7 EGB對MCF-7 細(xì)胞Th17、Treg蛋白表達(dá)的影響 在20～160 mg/L濃度范圍內(nèi)，EGB可明顯降低 MCF-7 細(xì)胞中Th17、Treg蛋白表達(dá)(P<0.01)，且隨著EGB濃度的增加作用更強(qiáng)。見表6和圖5。

表6 不同濃度EGB對MCF-7細(xì)胞Th17、Treg蛋白表達(dá)的影響(n=3)

圖5 不同濃度EGB對MCF-7細(xì)胞Th17、Treg蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近年來諸多研究表明，細(xì)胞焦亡在肝癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。NLRP3是經(jīng)典焦亡通路中的關(guān)鍵細(xì)胞焦亡因子，可被腫瘤放療或化療激活，活化的NLRP3可結(jié)合并激活caspase-1，將GSDMD裂解為GSDMD的N端和C端兩個(gè)片段，隨后，GSDMD的N端可與細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸、磷酸肌醇結(jié)合，使細(xì)胞膜形成大量微孔，釋放內(nèi)容物，引起細(xì)胞焦亡[12-14]。馮海玲等[15]研究顯示，在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)NLRP3 后，caspase-1 和 pro-caspase-1 等與焦亡相關(guān)的蛋白相對表達(dá)量顯著升高，乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力、成瘤能力明顯受到抑制，提示 NLRP3 活化介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡也可能參與了乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移過程。Guo等[16]發(fā)現(xiàn)在乳腺腫瘤細(xì)胞中，活化的 NLRP3 炎癥小體可能制造一種腫瘤微環(huán)境，在極大程度上促進(jìn)了早期腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展，反之，在敲除 NLRP3 基因的乳腺腫瘤小鼠中，早期腫瘤得到了明顯的抑制。Calpain能水解特定的酶、蛋白質(zhì)等，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、侵襲、自噬、細(xì)胞凋亡、穩(wěn)定細(xì)胞骨架等作用。有研究報(bào)道，上調(diào)Calpain 活性可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力[17-18]。

在本研究中，給予EGB干預(yù)乳腺癌細(xì)胞后，可以明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，并且抑制程度隨著濃度、作用時(shí)間等明顯增強(qiáng)，提示EGB是一種較好的抗腫瘤藥物。在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞存在腫脹膨大，邊緣不規(guī)則突起等現(xiàn)象，這種細(xì)胞形態(tài)提示EGB不僅僅可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可能存在細(xì)胞焦亡。進(jìn)一步進(jìn)行乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGB干預(yù)后乳酸脫氫酶釋放率明顯增加，證明了乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜破裂。流式細(xì)胞術(shù)FITC 可以將細(xì)胞膜染色，在細(xì)胞膜破裂后PI 可將細(xì)胞核染色，EGB作用 24 h 后，Q2 象限內(nèi)細(xì)胞明顯增多，說明乳腺癌細(xì)胞膜發(fā)生破裂。進(jìn)一步檢測細(xì)胞焦亡相關(guān)通路蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示EGB作用 24 h 后，MCF-7 細(xì)胞中GSDMD、caspase-1、cleaved caspase-1表達(dá)明顯增加，Calpain-1、NLRP3蛋白表達(dá)降低。這提示EGB可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。

在乳腺癌中Th17/Treg 比值變化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，Th17/Treg 的平衡失調(diào)可能在乳腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移中起著很重要的作用[19]。Okita 等[20]研究顯示乳腺癌患者外周血中 Treg 細(xì)胞明顯升高。也有研究報(bào)道，NLRP3 炎性體介導(dǎo)的 IL-1β 的表達(dá)會(huì)誘導(dǎo) T 細(xì)胞向 Th17 分化，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi) Th17/Treg 失衡[21]。在本研究中，EGB干預(yù)乳腺癌細(xì)胞 24 h 后，細(xì)胞中Th17、Treg蛋白表達(dá)明顯降低，提示EGB還可能通過調(diào)控Th17/Treg水平抑制乳腺癌細(xì)胞的生長。

綜上所述，銀杏葉可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，其可能與Calpain-1/NLRP3調(diào)控的細(xì)胞焦亡及Th17/Treg炎癥軸相關(guān)。

利益相關(guān)聲明：各作者之間不存在利益沖突，本文各作者均未涉及其他人或組織的利益，未發(fā)現(xiàn)有潛在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：李軍負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、統(tǒng)計(jì)及論文撰寫。黃梅負(fù)責(zé)論文、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指導(dǎo)。林曼迪負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作。吳代陸負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。