李軍鴿 王永春 孟珈同 邱智東 唐秋竹

長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117

經(jīng)典名方是近年來的研究熱點(diǎn)之一[1]，是古代醫(yī)者通過實(shí)踐與檢驗(yàn)得到的智慧成果，是留給后人的寶貴財(cái)富。自2018年起隨著關(guān)于經(jīng)典名方相關(guān)政策、法規(guī)、技術(shù)指導(dǎo)文件的頒布[2-3]，經(jīng)典名方已經(jīng)到了實(shí)質(zhì)開發(fā)階段[4]，主要包括本草考證研究、物質(zhì)基準(zhǔn)研究和制劑研究，其中本草考證和物質(zhì)基準(zhǔn)研究應(yīng)秉著遵古原則，應(yīng)按古代方法進(jìn)行研究，但是隨著歷史的發(fā)展和演變有些經(jīng)典名方在藥材基源[5]、飲片的炮制選擇、臨床劑量、煎煮方法、用法等方面記載存在差別。為了后期的制劑研究，有些傳統(tǒng)方法、制劑劑型等需要重新選擇與考量，還原經(jīng)典的同時(shí)還要注重傳承可用，使經(jīng)典名方標(biāo)準(zhǔn)化，因此有必要考慮現(xiàn)代的科學(xué)技術(shù)與中醫(yī)藥理論結(jié)合，合理選擇劑量、劑型與用法等，為得到有效的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，工藝設(shè)計(jì)很重要，例如可以先從對古代煎煮與現(xiàn)代煎煮差異進(jìn)行對比研究入手，確定關(guān)鍵工藝參數(shù)，有利于經(jīng)典名方量化生產(chǎn)，應(yīng)用于市場，早日成為適用于現(xiàn)代生活的中成藥產(chǎn)品。

黃連解毒湯最早記載于東晉葛洪撰寫的《肘后備急方》，但方中只有藥味組成和制法，后由唐代王燾在《外臺(tái)秘要》第一卷崔氏方一十五首中命名為黃連解毒湯[6-9]，原文“黃連三兩，黃芩、黃柏各二兩，梔子十四杖擘，以水六升，煮取二升”。黃連解毒湯是一個(gè)清熱解毒的經(jīng)典名方，其主要功效為清熱解毒，主治三焦實(shí)熱火毒證[10]。目前對黃連解毒湯藥效物質(zhì)基準(zhǔn)研究較少，提取工藝研究各不相同，但關(guān)于黃連解毒湯一直存在劑量爭議，根據(jù)《中國度量衡史》和《經(jīng)典名方開發(fā)指引》中唐代“一兩”折合現(xiàn)代13.8g，因此“黃連三兩”折算為黃連41.4 g，“黃芩，黃柏各二兩”折算為各27.6 g，“梔子十四杖擘”折算為15 g，唐“一升”折合現(xiàn)代200 mL，因此古法煎煮方法為：黃連41.4 g，黃芩27.6 g，黃柏27.6 g，梔子15 g，加水1200 mL，煮取400 mL?，F(xiàn)代一些名老中醫(yī)及教科書上認(rèn)為古代一兩約為3 g，黃連、黃柏、黃芩為苦寒之藥，量不適多。現(xiàn)代臨床常用黃連解毒湯：黃連9 g，黃芩6 g，黃柏6 g，梔子9 g，加水1200 mL，煮取400 mL。即3∶2∶2∶3比例配伍劑量被普遍認(rèn)知和應(yīng)用[11-13]。本研究將古法與現(xiàn)代方法分別煎煮，得到標(biāo)準(zhǔn)湯的凍干粉，從化學(xué)角度為黃連解毒湯“物質(zhì)基準(zhǔn)”中劑量的確定提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀(島津LC2030)，真空冷凍干燥機(jī)(Epsilon 2-4 LSCplus)，超聲波清洗機(jī)(昆山KQ-250B)，萬分之一電子天平(梅特勒XS105DU)。

1.2 材料 鹽酸小檗堿(批號：111638-201907)、鹽酸巴馬汀(批號：110723-201913)、鹽酸黃連堿(批號：112026-201802)、黃柏堿(批號：111895-201805)、黃芩苷(批號：110715-201318)、梔子苷(批號：110749-201919)等對照品購自中國食品藥品檢定研究院，試藥表小檗堿對照品(批號：B20108，源葉生物)。甲醇、乙腈(Fisher，色譜純)；水為超純水；其它試劑均為分析純。

黃連飲片產(chǎn)地為四川，吉林省北藥藥材加工有限公司(批號：20210511)；黃芩飲片產(chǎn)地為內(nèi)蒙古，吉林省北藥藥材加工有限公司(批號：20201005)；黃柏飲片產(chǎn)地為四川，吉林省北藥藥材加工有限公司(批號：20200712)；梔子飲片產(chǎn)地為四川，吉林省北藥藥材加工有限公司(批號：20201115)，以上藥材飲片經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)翁麗麗教授鑒定及檢驗(yàn)均合格。

2 方法

2.1 黃連解毒湯樣品制備

2.1.1 古代方法煎煮 唐代《外臺(tái)秘要》記載“黃連三兩，黃芩、黃柏各二兩，梔子十四杖擘，以水六升，煮取二升，分二服”。唐“一兩”折合現(xiàn)代13.8 g，唐“一升”折合現(xiàn)代200 mL[14-15]，故折算后取黃連41.4 g、黃芩27.6 g、黃柏27.6 g、梔子15 g，加水1200 mL，用武火保持沸騰，后文火煎煮，煎煮40 min，用2層200目紗布趁熱過濾，得藥液400 mL，冷凍干燥72 h，得凍干粉，稱重，平行制備兩份。

2.1.2 現(xiàn)代方法煎煮 參考臨床常用劑量及《方劑學(xué)》教材[16-17]，一錢約為3 g，確定黃連9 g、黃芩6 g、黃柏6 g、梔子9 g，加水1200 mL，浸泡30 min，用武火保持沸騰，后文火煎煮，煎煮50 min，用2層200目紗布趁熱過濾，得藥液400 mL，冷凍干燥72 h得凍干粉，稱重，平行制備兩份。

2.2 化學(xué)成分指標(biāo)含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 分別取表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、黃柏堿、黃芩苷、梔子苷對照品[18-19]，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含90 μg、90 μg、120 μg、90 μg、100 μg、60 μg、30 μg的對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液制備 表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿含量測定按2020版《中國藥典》黃連項(xiàng)下處理供試品溶液，精密稱定黃連飲片粉末(過二號篩)0.2 g和兩種煎煮方法凍干粉各0.6 g，分別置具塞錐形瓶中，精密加甲醇-鹽酸(100∶1)的混合液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理 30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過濾，精密吸取續(xù)濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，備用，平行制備兩份。

黃芩苷含量測定按2020版《中國藥典》黃芩項(xiàng)下處理供試品溶液，精密稱取黃芩飲片粉末0.3 g和兩種煎煮方法凍干粉各0.6 g，各加70%乙醇40 mL，加熱回流3 h，放冷，濾液置100 mL量瓶中，用少量70%乙醇分次數(shù)洗滌容器和殘?jiān)?，洗液濾入同一量瓶中，加70%乙醇搖勻，精密量取1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，備用，平行制備兩份。

黃柏堿含量測定按2020版《中國藥典》黃連項(xiàng)下處理供試品溶液，精密稱取黃柏飲片粉末0.5 g和兩種煎煮方法凍干粉各1.0 g，分別置具塞錐形瓶中，加乙腈-0.1%磷酸(13∶87)混合溶液25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，用乙腈-0.1%磷酸(13∶87)混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，即得，平行制備兩份。

梔子苷含量測定按2020版《中國藥典》梔子項(xiàng)下處理供試品溶液，精密稱取梔子飲片粉末0.1 g和兩種煎煮方法凍干粉各0.3 g，分別置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理 20 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，即得，平行制備兩份。

2.3 色譜條件

2.3.1 表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿含量測定 按2020版《中國藥典》黃連項(xiàng)下[20]，Apollo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(以磷酸調(diào)pH為4.0)(25∶75)，檢測波長354 nm，柱溫35 ℃，各對照品進(jìn)樣量5 μL，供試品10 μL。

2.3.2 黃芩苷含量測定 按2020版《中國藥典》黃芩項(xiàng)下，Apollo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)，檢測波長280 nm，柱溫35 ℃，對照品和供試品進(jìn)樣量10 μL。

2.3.3 黃柏堿含量測定 按2020版《中國藥典》黃柏項(xiàng)下，Apollo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸水(13∶87)，檢測波長284 nm，柱溫35 ℃，對照品和供試品進(jìn)樣量10 μL。

2.3.4 梔子苷含量測定 按2020版《中國藥典》梔子項(xiàng)下，techmate C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈-水(13∶87)，檢測波長238 nm，柱溫35 ℃，對照品進(jìn)樣量5 μL，供試品10 μL。

2.4 出膏率、浸出物、各化學(xué)成分指標(biāo)轉(zhuǎn)移率及日服用量的計(jì)算 出膏率是制劑研究的一個(gè)重要指標(biāo)，其穩(wěn)定性與量值直接影響成型工藝研究；轉(zhuǎn)移率是反映提取方法和指標(biāo)成分被提取效率的一個(gè)重要指標(biāo)，轉(zhuǎn)移率越高，反映該提取方法越合理，工藝更有利于實(shí)際生產(chǎn)。通過出膏率、各化學(xué)成分指標(biāo)轉(zhuǎn)移率及日服用量來對比古法煎煮與現(xiàn)代煎煮差異。

出膏率=煎煮液凍干粉量/總飲片量×100%。

化學(xué)成分指標(biāo)轉(zhuǎn)移率=(方中飲片總量×出膏率×凍干粉中化學(xué)成分指標(biāo)含量)/(方中相應(yīng)飲片用量×飲片化學(xué)成分指標(biāo)含量)。

化學(xué)成分指標(biāo)日服用量=日服方凍干粉量×凍干粉中化學(xué)成分含量。

3 結(jié)果

3.1 飲片及不同煎煮方法凍干粉中化學(xué)成分指標(biāo)含量測定 平行兩份煎煮樣品凍干粉，各平行制備兩份供試品溶液，按照2.3色譜條件測定，飲片和不同煎煮方法凍干粉中的表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿、黃柏堿、黃芩苷、梔子苷化學(xué)成分色譜峰型良好，分離度都大于1.5，方法穩(wěn)定可靠，各飲片含量符合2020版《中國藥典》要求，具體化學(xué)成分指標(biāo)含量見表1，色譜圖如圖1、圖2、圖3、圖4。黃連解毒湯古法煎煮與現(xiàn)代煎煮提取液凍干粉中各化學(xué)成分含量差異不大，嚴(yán)格說古法煎煮略高于現(xiàn)法煎煮，表小檗堿含量古法為1.35%，現(xiàn)法為1.02%；黃連堿含量古法為1.41%，現(xiàn)法為1.07%；巴馬汀含量古法為1.19%，現(xiàn)法為0.70%;小檗堿含量古法為6.18%，現(xiàn)法為4.69%；黃芩苷含量古法為8.99%，現(xiàn)法為7.47%；黃柏堿含量古法為0.35%，現(xiàn)法為0.24%；梔子苷含量古法為2.19%，現(xiàn)法為1.95%。從結(jié)果看，古法和現(xiàn)法中小檗堿含量均高于黃連飲片，是因?yàn)辄S柏飲片中也含有小檗堿。導(dǎo)致兩種煎煮方法各化學(xué)成分差異不大的原因可能是因?yàn)橐陨匣瘜W(xué)成分無揮發(fā)性，水溶性都較好，且都易溶于水，容易煎出。

表1 飲片及不同煎煮方法中化學(xué)成分指標(biāo)的含量

1.表小檗堿；2.黃連堿；3.巴馬??；4.鹽酸小檗堿

1.黃芩苷

1.黃柏堿

1.梔子苷

3.2 不同煎煮方法中出膏率和化學(xué)指標(biāo)轉(zhuǎn)移率比較 平行制備的古法煎煮和現(xiàn)法煎煮出膏量重復(fù)性良好，古法煎煮平均出膏量為17.86 g，出膏率為15.99%，現(xiàn)法煎煮平均出膏量為7.42，出膏率為24.34%，從出膏率看，現(xiàn)法煎煮優(yōu)于古法煎煮，從指標(biāo)轉(zhuǎn)移率看現(xiàn)法煎煮表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿、黃柏堿、黃芩苷、梔子苷的轉(zhuǎn)移率均大于古法煎煮。見表2。因此從飲片利用率方面考慮，現(xiàn)法煎煮比古法煎煮好。

表2 兩種煎煮方法化學(xué)成分指標(biāo)轉(zhuǎn)移率比較/%

通過各化學(xué)成分轉(zhuǎn)移率可知，梔子苷的轉(zhuǎn)移率最高，可能與梔子苷易溶于水有關(guān)，有文獻(xiàn)報(bào)道梔子苷30 min提取完全[21]。另外從日服提取物用量方面看，古法煎煮每日服17.86 g，現(xiàn)法每日服用7.42 g，古法是現(xiàn)法的2.4倍，如按后期制成顆粒劑考慮，從服用劑量角度看現(xiàn)法煎煮比古法煎煮好。

3.3 不同煎煮方法化學(xué)成分日服用量比較 古方煎煮一日服用生藥量為111.6 g，是現(xiàn)代煎煮一日服用生藥量(30 g)的4.6倍。經(jīng)計(jì)算，不同煎煮方法的各化學(xué)成分日服用量差異小于日服生藥量差異。見表3。從數(shù)據(jù)看，表小檗堿古法煎煮日服量為233.99 mg是現(xiàn)法煎煮73.16 mg的3.2倍；黃連堿古法煎煮日服量為246.17 mg是現(xiàn)法煎煮76.77 mg的3.2倍；巴馬汀古法煎煮日服量為208.18 mg是現(xiàn)法煎煮46.75 mg的4.4倍；小檗堿古法煎煮日服量為1070.32 mg是現(xiàn)法煎煮337.53 mg的3.2倍；黃芩苷古法煎煮日服量為649.20 mg是現(xiàn)法煎煮540.14 mg的1.2倍；黃柏堿古法煎煮日服量為61.70 mg是現(xiàn)法煎煮17.39 mg的3.5倍；梔子苷古法煎煮日服量為381.34 mg是現(xiàn)法煎煮231.55 mg的1.6倍；可見，不同煎煮方法的各化學(xué)成分日服用量差異與日服生藥量差異不一致，古法煎煮高于現(xiàn)法煎煮，原因可能是各藥材入方劑量、煎煮時(shí)間、各化學(xué)成分轉(zhuǎn)移率不同導(dǎo)致的。

表3 兩種煎煮方法化學(xué)成分指標(biāo)日服用量比較/mg

4 討論

黃連解毒湯療效顯著，應(yīng)用廣泛[22]，臨床上一直沿用湯劑[23]，隨著歷史時(shí)間的推移，黃連解毒湯在劑量上發(fā)生爭議，從而導(dǎo)致煎煮工藝不同。研究從出膏率、有效成分轉(zhuǎn)移率等化學(xué)實(shí)驗(yàn)角度比較古法煎煮和現(xiàn)代煎煮差異，發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯古法煎煮與現(xiàn)代煎煮提取液凍干粉中各化學(xué)成分含量差異不大，現(xiàn)代煎煮的出膏率和化學(xué)成分轉(zhuǎn)移率大于古代煎煮，因此從飲片利用率角度出發(fā)，現(xiàn)代煎煮優(yōu)于古代煎煮。從日服用量上看，如小檗堿和黃芩苷古法煎煮日服量分別為1070.32 mg和649.20 mg是現(xiàn)法煎煮的3.2倍和1.2倍，古法煎煮日服用量有效成分大于現(xiàn)代煎煮。但是，兩種煎煮方法得到的物質(zhì)還需在藥理活性和臨床療效方面進(jìn)一步比較，通過閱讀《外臺(tái)秘要》黃連解毒湯原文“……一服目明，再服進(jìn)粥，于此漸瘥，余以療凡大熱盛煩嘔呻吟錯(cuò)語不得眠”，古代用比現(xiàn)代劑量大4.6倍的原因猜想可能是利用其劑量使療效加快，對應(yīng)急重癥。綜上所述，本研究從化學(xué)角度出發(fā)，為黃連解毒湯“物質(zhì)基準(zhǔn)”研究中劑量及煎煮方法的確定，提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)參考。