劉立輝 鄒 準 周艷林 鐘小清 呂高榮 周志宏 鄒節(jié)明*

1.桂林三金藥業(yè)股份有限公司，廣西 桂林 541004；2. 云南中醫(yī)藥大學中藥學院，云南 昆明 650500

壯藥羊開口為野牡丹科(Melastomaceae)野牡丹屬(MelastomaL.)植物展毛野牡丹MelastomanormaleD.Don的干燥根，為廣西壯醫(yī)藥習用藥材，收載于《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標準(第一卷)》，壯藥名為棵芒難，味甘、酸、澀，微溫，具有收斂、止血、解毒的功效，用于泄痢、崩漏帶下、內(nèi)外傷出血[1]?，F(xiàn)代藥理研究[2]表明，羊開口提取物對艾滋病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA多聚酶活性具有抑制作用。羊開口是中成藥三金片系列產(chǎn)品的重要原料之一，目前關于羊開口化學成分的研究報道并不多，報道的化學成分主要包括β-谷甾醇、鞣花酸、沒食子酸及其衍生物等少數(shù)化合物[3]。文獻[4]報道從展毛野牡丹分離得到一些酚類化學成分，但該化學成分的種類依然還是沒食子酸衍生物和少量的酚苷類化合物。因此，為進一步認識羊開口的化學成分，明確相關活性與藥用物質(zhì)基礎，本實驗對羊開口的化學成分進行了研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV2401PC型紫外可見分光光度計(日本Shimadzu公司)；Finnigan MAT-90型質(zhì)譜儀(美國Finnigan公司)；Bruker AM-400和DRX-500核磁共振儀(德國Bruker公司，TMS為內(nèi)標)； XP 205電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；MILLI-Q密理博超純水儀(德國Merck公司)；LC-20A型島津半制備高效液相色譜儀(日本島津公司)；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；CCA-1112A冷卻水循環(huán)裝置(上海愛郎儀器有限公司)；WFH-201B暗箱式紫外透射反射儀(上海精科實業(yè)有限公司)。

1.2 材料 柱色譜硅膠(200～300目)和薄層層析硅膠板G(青島海洋化工廠)；反相C18填料(40～60 μm)(日本Fuji公司)；MCI CHP-20(75～150 μm)(日本Mitsubishi Chemical公司)；Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences公司)；提取用乙醇為市售食品級，其余化學試劑均為市售色譜純或分析純。羊開口采自廣西桂林市永?？h，其原植物經(jīng)中國科學院廣西植物研究所蔣水元研究員鑒定為展毛野牡丹MelastomanormaleD.Don。植物標本存放于桂林三金藥業(yè)股份有限公司企業(yè)技術中心。

2 提取和分離

羊開口干燥根10 kg，粉碎后加75%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，濾過，濾液合并濃縮成浸膏加水混懸，靜置，出現(xiàn)大量沉淀，濾過，得沉淀(87 g)，濾液用等體積三氯甲烷萃取3 次，三氯甲烷萃取液合并濃縮得到三氯甲烷萃取部位浸膏(11 g)。將三氯甲烷萃取部位浸膏與前所得沉淀分別取樣加適量溶劑溶解，通過在TLC上用相同溶劑系統(tǒng)展開對比，三氯甲烷萃取部位浸膏色譜中，在與前所得沉淀色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。將三氯甲烷萃取部位浸膏與前所得沉淀合并，經(jīng)硅膠柱色譜(石油醚-丙酮梯度、三氯甲烷-甲醇梯度)洗脫，合并得到5 個組分(Fr.1～Fr.5)。Fr.2(40 g)經(jīng)硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇梯度)洗脫，合并得到2 個組分(Fr.2.1～Fr.2.2)。Fr.2.1(2g)經(jīng)硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇梯度)反復洗脫、MCI 柱色譜(甲醇-水梯度)洗脫，最后經(jīng)重結(jié)晶，得化合物Ⅱ(63 mg)和Ⅵ(66 mg)；Fr.2.2(3g)經(jīng)硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇梯度)反復洗脫，再經(jīng)重結(jié)晶，得到化合物Ⅰ(220 mg)。Fr.4(20 g)經(jīng)硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇梯度)洗脫，合并得到3 個組分(Fr.4.1～Fr.4.3)。Fr.4.3(1g)經(jīng)硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇梯度)反復洗脫、反相C18柱色譜(甲醇-水梯度)洗脫，最后經(jīng)重結(jié)晶，得到化合物Ⅲ(10 mg)和Ⅴ(77 mg)。三氯甲烷萃取剩余水層經(jīng)MCI 柱色譜(甲醇-水梯度)、硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇梯度)、Sephadex LH - 20 柱色譜(甲醇-水梯度)洗脫，最后經(jīng)重結(jié)晶，得到化合物Ⅳ(45 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ：白色粉末(甲醇)，UVλmax nm (MeOH):198，246。ESI-MS m/z：599 [M+Na]+，分子式為C35H60O6。1H-NMR (DMSO) δ:5.32(1H,s,H-6)，4.90(1H,d,J=8.0 Hz,H-1)，4.42(1H,t,H-3)，0.93(3H,s,H-19)，0.65(3H,s,H-18);13C-NMR (DMSO) δ:140.9(C-5)，121.7(C-6)，101.3(C-1′)，77.4(C-5′)，77.4(C-3)，77.2(C-3′)，73.9(C-2′)，70.6(C-4′)，61.6(C-6′)，56.6(C-14)，55.9(C-17)，50.1(C-9)，45.6(C-24)，42．3(C-13)，40.6(C-4)，39.4(C-16)，37.3(C-1)，36.7(C-10)，36.7(C-20)，33.8(C-22)，31.9(C-7)，31.8(C-8)，29.7(C-2)，29.2(C-12)，28.3(C-25)，25.9(C-28)，24.3(C-15)，23.1(C-23)，21.1(C-26)，20.2(C-27)，19.6(C-11)，19.4(C-21)，19.1(C-19)，12.2(C-29)，12.2(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[5]報道的胡蘿卜苷數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為胡蘿卜苷。

化合物Ⅱ：白色針晶(甲醇)，UVλmax nm (MeOH):246。 EI-MS m/z：455 [M-H]-，分子式為C30H48O3。1H-NMR (C5D5N) δ:4.95, 4.76(each 1H, m, CH2-29 ), 3.45(1H, m, H-3 ), 1.77, 1.21, 1.07, 1.06, 1.01, 0.83(each 3H,s,CH3×6);13C-NMR (C5D5N) δ:178.6 (C-28), 151.1(C-20), 109.7(C-29), 77.9 (C-3), 56.4 (C-17), 55.7(C-5), 50.7(C-9), 49.5(C-19), 47.5(C-18), 42.6(C-14), 40.9(C-8), 39.3(C-4), 39.0(C-1), 38.4(C-13), 37.3(C-10), 37.3(C-22), 34.6(C-7), 32.6(C-16), 31.0(C-15), 30.0(C-21), 28.4(C-23), 28.1(C-2), 25.9(C-12), 21.0(C-11), 19.2(C-30), 18.5(C-6), 16.1(C-24), 16.2(C-25), 16.2(C-26), 14.7(C-27)，以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道的白樺脂酸數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為白樺脂酸。

化合物Ⅲ：柱狀晶片(甲醇)，UVλmax nm (MeOH):246，364。EI-MS m/z：491 [M-H]-，分子式為C22H20O13。1H-NMR (DMSO) δ:7.78(1H, s,H-5′), 7.49(1H, s,H-5), 5.12(1H, d,J=9.0 Hz,H-1″), 4.04(3H, s,OCH3-3′), 4.00(3H, s,OCH3-3);13C-NMR (DMSO) δ:158.3(C-7 and 7′), 152.8(C-4′), 151.5(C-4), 141.8(C-3′), 141.6(C-3), 140.9(C-2′), 140.2(C-2), 114.1(C-1), 112.7(C-6), 111.9(C-5), 111.8(C-5′), 111.6(C-6′), 111.1(C-1′), 101.4(C-1″), 77.2(C-5″), 76.5(C-3″), 73.3(C-2″), 69.5(C-4″), 60.5(C-6″), 61.6(3-OCH3), 60.9(3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道的3,3′-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為3,3′-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物Ⅳ：白色粉末(甲醇)，UVλmax nm (MeOH):246, 364。ESI-MS m/z:529 [M+Na]+，分子式為C23H22O13。1H-NMR (C5D5N) δ:8.47(1H, s, H-5′), 7.82(1H, s, H-5), 5.93(1H, d,J=7.8 Hz, H-1″), 4.25, 4.15(6H, s, 3,3′-2 × OCH3), 3.87(3H, s, 4′-OCH3);13C-NMR (C5D5N) δ:158.8(C-7), 158.6(C-7′), 154.8(C-4′), 152.8(C-4), 142.6(C-3), 141.8(C-2), 141.8(C-2′,3′), 113.9(C-1), 113.3(C-6), 113.1(C-1′), 113.1(C-5), 112.6(C-6′), 108.0(C-5′), 102.7(C-1″), 78.9(C-2″), 78.31(C-3″), 74.6(C-4″), 70.86(C-5″), 62.10(C-6″)，61.7(3-OCH3), 61.3(3′-OCH3), 56.4(4′-OCH3)，以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道的3,3′,4′-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為3,3′,4′-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物Ⅴ：淺黃色晶體(甲醇)，UVλmax nm (MeOH):274。分子式為C8H8O5。1H-NMR (MeOD) δ:7.06(2H,s), 3.83(3H, s);13C-NMR (MeOD) δ:169.1(C-7), 146.4(C-3,5), 139.8(C-4), 121.4(C-1), 110.1(C-2,6)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道的沒食子酸甲酯數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為沒食子酸甲酯。

化合物Ⅵ：針狀晶體(甲醇)，通過在TLC上用3種溶劑系統(tǒng)展開對比，與沒食子酸對照品斑點顏色及Rf值均一致，故鑒定為沒食子酸。

4 討論

研究從羊開口的乙醇提取物中分離鑒定了6個化合物，包括1個甾體類化合物，1個三萜類化合物，2個鞣酸類化合物，2個酚酸類化合物，進一步證實了可水解鞣酸類成分為本屬植物的特征性成分之一[10]。

文獻[11]報道，胡蘿卜苷具有良好的抗腫瘤、抗氧化以及保護神經(jīng)等藥理作用。白樺脂酸具有一定的抗腫瘤、抗病毒、抗氧化應激、抗炎等藥理活性，尤其是在抗腫瘤、抗HIV、抗黑色素瘤方面，展現(xiàn)出良好的開發(fā)前景。白樺脂酸通過抑制COX-2介導的NF-κB和ERK1/2通路抑制丙肝病毒復制，可作為一種治療HCV感染患者潛在的藥物開發(fā)先導化合物[12]。鞣花酸苷類物質(zhì)3,3′-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在1～500 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對人胃癌MGC細胞、人肝癌HepG-2細胞、人盲腸癌Hce-8693細胞增殖均有一定的抑制作用，隨著劑量的增大和作用時間的延長，呈較好的劑量-時間-效應關系[13]。沒食子酸甲酯具有一定的抗氧化活性，其IC50值為8.99 μmol·L-1[14]。沒食子酸甲酯還可以通過抑制Akt和ERK1/2磷酸化，抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長和遷移，顯示出一定的抗腫瘤作用[15]。沒食子酸具有一定的生物活性，包括抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎作用等。沒食子酸可以抑制促細胞炎性因子腫瘤壞死因子、白介素-6和白介素-1的分泌，間接抑制革蘭陰性菌細胞壁中的脂多糖誘發(fā)炎性反應[16]。

根據(jù)研究分離得到的化學成分及相關活性報道，初步證實了羊開口具有一定的抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌、抗炎的活性物質(zhì)基礎，同時也初步證實了羊開口的收斂、止血、解毒的中醫(yī)功效以及泄痢、崩漏帶下、內(nèi)外傷出血的臨床應用具有一定的合理性，為完善羊開口的藥效物質(zhì)基礎及進一步的研究開發(fā)提供了理論依據(jù)。關于該植物更多的化學成分和深入的藥理作用機制仍有待更進一步的研究。