◎ 周瑩瑩，劉定舟，張丹鶴，李 帥，崔倩倩，朱欣欣，賈松濤，趙林萍

（1.河南中標(biāo)檢測服務(wù)有限公司，河南 鄭州 450001；2.鄭州中道生物技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450001）

隨著人們生活水平的提高，肉、蛋、奶畜禽產(chǎn)品在人們的飲食結(jié)構(gòu)中所占比例越來越大，畜禽產(chǎn)品質(zhì)量受到了更多的關(guān)注[1]。養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中，為了預(yù)防和治療疾病或為了縮短出欄時間會使用獸藥，但是過量使用獸藥會造成獸藥在動物體內(nèi)蓄積，一經(jīng)食用，會給人體健康帶來無法挽回的傷害。氯霉素是一種常用的具有旋光活性的廣譜抗生素，治療畜禽腸道感染十分有效，但長期食用含氯霉素殘留的動物產(chǎn)品或乳汁，就會對人體健康造成極大的威脅，嚴(yán)重者會引起再生障礙性貧血和灰嬰綜合癥等，甚至危及生命[2]。地塞米松又名氟美松、氟甲強(qiáng)地松龍、德沙美松，是由腎上腺皮質(zhì)部分所分泌的一種固醇類化合物。超生理劑量的地塞米松具有很強(qiáng)的抗炎和一定的抗過敏作用，在獸醫(yī)臨床上被廣泛用于抗炎、抗毒、抗過敏和抗風(fēng)濕等治療[3]。激素的頻繁使用會在畜禽體內(nèi)殘留，不僅給動物源食品安全帶來隱患，而且對人體健康及環(huán)境危害嚴(yán)重[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：冷凍或新鮮的陰性牛肉、鯉魚、雞蛋、牛奶；0.22 μm微孔有機(jī)相濾膜。

試劑：甲醇（色譜級，格里斯），乙腈（色譜級，格里斯），乙酸乙酯（色譜級，格里斯），正己烷（色譜級，格里斯），氯化鈉（AR），去離子水；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品（批號G974527，純度99.80%，美國DR）；氯霉素-D5（批號210696，含量100 mg·L-1，Anpel）；地塞米松（批號G1069503，純度99.82%，美國DR）。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Vantage UPLC-MS/MS（美國賽默飛）；天平：0.01 mg；振蕩器、均質(zhì)器、漩渦混合器、離心機(jī)、水浴氮吹儀和移液槍。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制。精確稱10 mg（需折算成純物質(zhì)）氯霉素和地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品到100 mL的容量瓶內(nèi)，甲醇溶解并定容，配成100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18 ℃溫度下保存。

（2）中間工作溶液的配制。氯霉素-D5中間工作液（100 ng·mL-1）：準(zhǔn)確移取100 μL氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)品溶液到100 mL容量瓶內(nèi)用甲醇定容，-18 ℃溫度下保存；氯霉素、地塞米松中間工作液（100 ng·mL-1）：分別準(zhǔn)確移取100 μL地塞米松和氯霉素儲備液到100 mL容量瓶內(nèi)并用甲醇定容，-18 ℃溫度下保存。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的配制。分別吸取氯霉素、地塞米松中間工作液0.05 mL、0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、5.00 mL和10.00 mL于50 mL容量瓶中，分別加入2.5 mL氯霉素-D5中間工作液后用甲醇溶液（甲醇∶水體積比=1∶1）定容，得到氯霉素、地塞米松濃度為0.1 ng·mL-1、0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1，氯霉素-D5濃度為5.0 ng·mL-1。

1.3.2 樣品前處理

（1）提取。取制備均勻的試樣，準(zhǔn)確稱量樣品2.000 00 g（精確至0.01 mg），于50 mL具塞離心管中，加入氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)溶液（100 ng·mL-1）50 μL，加標(biāo)管再加入適量外標(biāo)溶液，漩渦混合器上渦旋30 s，加入乙酸乙酯20 mL，均質(zhì)30 s，具塞，振蕩15 min，高速低溫離心300 s，上清液全部取出待處理，20 mL乙酸乙酯加入殘渣中再次進(jìn)行上述步驟，合并全部上清液，45 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，? mL甲醇溶液（甲醇∶水=1∶1）定容，渦旋混合，待進(jìn)行下一步。

（2）凈化。加入5 mL正己烷混勻（由于樣品中脂肪含量過高，需要去除脂肪，減少干擾，更有助于樣品檢測），靜待分層，吸取下層液體到已加入正己烷5 mL的離心管內(nèi)，在下層甲醇溶液中加入稍微過量的氯化鈉，渦旋混合30 s，10 000 r·min-1下低溫離心5 min（如果此時還渾濁，可放冰箱冷凍10 min），然后取下層清液過濾膜，供UPLC-MS/MS測定。

1.3.3 儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：waters BEH C18，粒徑1.7 μm， 2.1 mm×50 mm；流動相：純水+乙腈，流速：0.25 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：2 μL，洗脫時間：5 min。

（2）質(zhì)譜條件的選擇和優(yōu)化。采用直接進(jìn)入質(zhì)譜儀的方式，在負(fù)離子模式下，對氯霉素、氯霉素-D5以及地塞米松母離子及子離子進(jìn)行優(yōu)化。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制。配制氯霉素、地塞米松濃度為0.1 ng·mL-1、0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1，其中氯霉素-D5濃度為5 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（4）試樣溶液的測定。采用自動進(jìn)樣的方式，標(biāo)曲溶液進(jìn)入UPLC-MS/MS中，以氯霉素濃度為橫坐標(biāo)，氯霉素和氯霉素-D5峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)標(biāo)法定量；以地塞米松色譜峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量[5-6]。樣品溶液以保留時間及兩對離子（定性離子對/定量離子對）色譜峰相對豐度比雙重定性，以氯霉素和氯霉素-D5峰面積比值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，而地塞米松則是以峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果

對質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，選取1個母離子和2個最優(yōu)子離子，碰撞能、定性離子對和定量離子對結(jié)果見表1，總離子流圖見圖1，提取的定性離子對色譜圖見圖2、圖3和圖4。離子源：電噴霧離子源ESI；掃描模式：負(fù)離子模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；噴霧器溫度：320 ℃；毛細(xì)管溫度：320 ℃；鞘氣壓力40 Arb；輔助氣壓力15 Arb；噴霧電壓3 000 V。

表1 氯霉素、氯霉素-D5、地塞米松多反應(yīng)監(jiān)測檢測條件表

2.2 線性范圍、定量限

在優(yōu)化好的液相和質(zhì)譜條件下，通過自動進(jìn)樣的方式，用上述的地塞米松和氯霉素的工作曲線，以信噪比＞10∶1確定定量限。在0.1～20.0 ng·mL-1的線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r2＞0.999 0，本方法氯霉素定量限為0.1 μg·kg-1，地塞米松為0.2 μg·kg-1。

2.3 方法回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取陰性的牛肉、鯉魚、雞蛋、牛奶這4種基質(zhì)的樣品各18份，每6份為1組（n=6），分為3組，各自添加氯霉素和地塞米松，添加水平0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1，平均回收率和批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表2。從表2可以看出，4種不同基質(zhì)中待測物回收率均在78.2%以上，RSD均在10.4%以下。

表2 不同基質(zhì)結(jié)果數(shù)據(jù)表

2.4 實(shí)際樣品的檢測

采用本方法對本公司某地市抽取的約40余批次的雞蛋、水產(chǎn)品、畜禽肉及內(nèi)臟（豬肉、雞肉、牛肉、羊肉等及其內(nèi)臟等種類隨實(shí)際情況而定）進(jìn)行檢測，均未發(fā)現(xiàn)陽性樣品。

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中氯霉素和地塞米松藥物殘留的方法，該檢測方法可同時、快速、準(zhǔn)確測定動物源性食品中的氯霉素和地塞米松的藥物殘留，不僅精簡了前處理步驟，縮短了前處理時間，并且縮短了分析時間，同時該方法靈敏度高、精密度高、重復(fù)性好，充分滿足日常檢測需求。