李登科，宋鈴榆，何錫東，胡越，楊紅，劉琦

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴陽 550004)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是全球最常見的慢性肝臟疾病，該病包括從單純非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFL)發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)再演變?yōu)橹拘愿斡不恼麄€過程。NASH是NAFLD發(fā)展為肝硬化、原發(fā)性肝癌及肝衰竭的主要原因[1]。NASH以肝細胞損傷、肝臟脂肪變、炎癥、伴或不伴肝臟纖維化為主要病理特征。近20年來，隨著人們生活水平的提高、肥胖發(fā)生率的升高，全球NASH發(fā)病率不斷攀升。流行病學(xué)研究顯示，我國普通成人NAFLD患病率6.3%～45%，其中10%～30%為NASH[2]。預(yù)計不久的將來，NASH所致肝硬化可能成為全球肝移植最常見的原因[3]。然而，目前尚無被推薦用于治療NASH的藥物。因此，尋找有效的干預(yù)措施對NASH有重要意義。

南蛇藤醇(celastrol，cel)又稱雷公藤紅素，是從中藥雷公藤中分離出的一種三萜類生物活性物質(zhì)[4]。既往研究表明，南蛇藤醇在改善肝臟代謝損傷方面具有重要作用，該藥還可改善高脂飲食所致肝臟損傷[5]。南蛇藤醇還可以通過激活磷酸腺苷激活的蛋白激酶和沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(adenosine phosphate-activated protein kinase-sirtuin 1，AMPK-SIRT1)信號傳導(dǎo)來抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕肝纖維化，而肝纖維化是NASH主要病理表現(xiàn)之一[6]。此外，南蛇藤醇能改善氧化應(yīng)激[7]，氧化應(yīng)激通過誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化發(fā)生，在NASH發(fā)生及進展中發(fā)揮重要作用[8]。然而，南蛇藤醇能否改善NASH目前尚不清楚。筆者在本實驗觀察南蛇藤醇對小鼠NASH的治療作用，以期為NASH的治療提供新思路與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 南蛇藤醇購自Aladdin公司(含量：98%，批號：C107672)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號：C0105)；Masson's染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(批號：G1340)；兔抗小鼠Ⅰ型膠原蛋白α1(COL1A1)抗體購自Abcam公司(批號：ab34710)；組織細胞三酰甘油(TG)酶法測定試劑盒(批號：E1013)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測試盒(批號：C010-3-1)均購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測試盒購自南京建成生物工程研究所有限公司(批號：C009-3-1)；巨噬細胞特異性表面抗原F4/80、白細胞介素1β(IL-1β)引物設(shè)計并購買于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2動物的飼養(yǎng)、分組及處理 6周齡C57BL/6雄性小鼠，購自貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(黔)2018-0001。分籠飼養(yǎng)于相對濕度40%、溫度約28 ℃清潔級動物房，自由進食、進水。本研究動物實驗流程經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審查批準。

將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，按隨機數(shù)表法分為正常對照組、模型對照組及南蛇藤醇組，每組6只。正常對照組喂養(yǎng)蛋氨酸-膽堿充足(methionine-choline-sufficient，MCS)飲食，模型對照組喂養(yǎng)蛋氨酸-膽堿缺乏(methionine-choline-deficiency，MCD)飲食，南蛇藤醇組給予MCD飲食喂養(yǎng)+南蛇藤醇腹腔注射(1 mg·kg-1，隔天1次)[9-10]。均持續(xù)喂養(yǎng)5周，每周記錄小鼠體質(zhì)量變化。戊巴比妥鈉麻醉小鼠，取血后處死。記錄肝質(zhì)量，收集組織進行后續(xù)實驗。

1.3檢測指標與檢測方法

1.3.1HE染色及NAFLD活動度評分(NAFLD activity score，NAS) 處死小鼠，取肝組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成厚4 μm石蠟切片，H&E染色試劑盒染色；根據(jù)Kleiner/Brunt標準[11]進行組織學(xué)NAS評分。肝細胞脂肪變程度0～3分，肝細胞氣球樣變程度0～2分，小葉內(nèi)炎癥程度0～3分，合計值為最終NAS得分。NAS總分0～8分，>4分診斷為NASH。

1.3.2油紅染色 稱取油紅粉末0.5 g，溶于異丙醇100 mL，攪拌至完全溶解，得油紅飽和溶液，4 ℃長期保存。使用前，油紅飽和溶液與超純水以3：2配比，混勻后中性濾紙過濾，2 h內(nèi)使用。油紅染色：將小鼠肝臟取出后迅速以最佳切削溫度(optimum cutting temperature，OCT)包埋，液氮冷凍，制成冰凍切片厚5 μm，油紅染色前取出復(fù)溫，再用配好的油紅染液進行組織染色。

1.3.3生化檢測 肝臟TG、血清ALT、血清AST水平分別采用試劑盒檢測。

1.3.4實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR，qPCR) 根據(jù)本課題組既往研究步驟[12]。取少量上述處理后凍存于-80 ℃的小鼠肝組織，研磨后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR 擴增，檢測F4/80、IL-1β表達，并計算目的基因mRNA相對表達量。目的基因及引物序列見表1。

表1 qPCR目的基因及引物序列

1.3.5Masson's染色 ①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；②Weigert鐵蘇木素染色液染色9 min，純化水沖洗；③酸性乙醇分化液分化15 s，水洗；④Masson藍化液返藍5 min，水洗；⑤純化水洗1 min；⑥麗春紅品紅染色液染色10 min；⑦用配制的弱酸工作液洗1 min(比例為純化水：弱酸溶液=2：1)；⑧磷鉬酸水溶液洗2 min；⑨用已配制的弱酸工作液洗1 min；⑩放入苯胺藍染色液染色2 min，弱酸工作液洗1 min；95%乙醇、無水乙醇脫水；二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.6免疫組化 小鼠肝組織石蠟切片，經(jīng)烤片、脫蠟、水化，3%過氧化氫(H2O2)消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，檸檬酸鹽溶液抗原修復(fù)，血清封閉，分別滴加兔抗小鼠COL1A1抗體(1：100)，4 ℃孵育過夜，二抗孵育1 h，3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(3，3'-diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，晾干，封片，光學(xué)顯微鏡觀察，隨機選取5個200倍視野進行圖片采集。

2 結(jié)果

2.1南蛇藤醇對小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠干預(yù)后體質(zhì)量及肝質(zhì)量均顯著降低(P<0.01)，肝質(zhì)量/體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型對照組比較，南蛇藤醇組小鼠干預(yù)后體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝質(zhì)量/體質(zhì)量均差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 3組小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝質(zhì)量/體質(zhì)量測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型對照組小鼠肝細胞大量脂肪變；與模型對照組比較，南蛇藤醇組小鼠肝臟脂肪變明顯改善。見圖1。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.南蛇藤醇組。

與正常對照組比較，模型對照組小鼠肝臟NAS評分明顯升高(P<0.01)；與模型對照組比較，南蛇藤醇組小鼠肝臟NAS評分顯著降低(P<0.01)。見圖2。

①與正常對照組比較，t=10.26，P<0.01；②與模型對照組比較，t=3.64，P<0.01。

與正常對照組比較，模型對照組小鼠肝臟脂滴及TG沉積顯著增加(P<0.01)；與模型對照組比較，南蛇藤醇組肝臟脂滴及TG含量明顯降低(P<0.05)。見圖3、圖4。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.南蛇藤醇組。

①與正常對照組比較，t=4.64，P<0.01；②與模型對照組比較，t=2.57，P<0.05。

2.2南蛇藤醇對小鼠肝臟炎癥反應(yīng)的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠F4/80、IL-1β水平升高(P<0.01)；與模型對照組比較，南蛇藤醇組小鼠F4/80、IL-1β水平降低(P<0.05)。提示南蛇藤醇能減輕模型小鼠肝臟炎癥反應(yīng)(圖5)。

①正常對照組比較，t=3.93，P<0.01；②與模型對照組比較，t=2.29，P<0.05。

2.3南蛇藤醇對小鼠肝細胞損傷的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清ALT、AST水平均升高(P<0.01)；與模型對照組比較，南蛇藤醇組小鼠血清ALT、AST水平均降低(P<0.05)。提示南蛇藤醇能減輕模型小鼠肝細胞損害(表3)。

表3 3組小鼠血清ALT與AST水平

2.4南蛇藤醇對小鼠肝臟纖維化的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠肝臟竇周和靜脈周圍出現(xiàn)較多纖維組織增生；與模型對照組比較，南蛇藤醇組小鼠上述表現(xiàn)明顯減輕。見圖6。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.南蛇藤醇組。

與正常對照組比較，模型對照組小鼠肝細胞COL1A1陽性細胞明顯增加(P<0.01)；與模型對照組比較，南蛇藤醇組小鼠上述陽性細胞數(shù)明顯減少(P<0.01)。提示南蛇藤醇能減輕模型小鼠肝細胞纖維化。結(jié)果見圖7、圖8。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.南蛇藤醇組。

①與正常對照組比較，t=8.80，P<0.01；②與模型對照組比較，t=8.34，P<0.01。

3 討論

NASH是NALFD進展為肝硬化甚至肝癌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，NASH主要以肝脂肪變、肝細胞損傷、炎癥、纖維化為病理特征。然而，目前該病尚無較好治療措施。雖然已有研究表明，南蛇藤醇可通過減少脂質(zhì)合成并改善抗氧化和抗炎狀態(tài)來改善NAFLD[5]，但其對于NASH的改善及治療作用鮮見報道。南蛇藤醇對于MCD飼料誘導(dǎo)的小鼠NASH模型作用的研究亦不多見。筆者在本研究初步發(fā)現(xiàn)南蛇藤醇能減輕MCD誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪變、肝細胞損傷、炎癥及纖維化，提示南蛇藤醇具有潛在治療NASH作用。為開發(fā)有效治療及延緩NASH向肝硬化和肝癌進展的藥物提供了新的思路與實驗依據(jù)。

20世紀90年代，DAY等[13]提出的“二次打擊”學(xué)說認為，肝臟中的TG沉積可導(dǎo)致脂肪變性，最終引起肝臟炎癥、纖維化和癌癥。肝細胞內(nèi)脂質(zhì)尤其是TG沉積，是形成NASH的前提[14]。在NASH發(fā)病過程中，大量游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致肝細胞發(fā)生凋亡壞死[15]，肝細胞凋亡與壞死也是NASH的重要病理變化[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，南蛇藤醇不僅可減輕MCD誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，還能減輕肝細胞損傷，提示南蛇藤醇在緩解NASH中具有重要作用。

此外，TG過量蓄積導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)，進而導(dǎo)致肝細胞損傷，促進肝臟纖維化，炎癥還能進一步加重肝臟脂質(zhì)沉積，形成惡性循環(huán)[17]。IL-1β是一種重要的炎癥因子，在NASH中發(fā)揮重要作用[18]，IL-1β可引起Kupffer細胞(肝內(nèi)巨噬細胞)聚集和激活，促進 NASH發(fā)展[19]。F4/80是巨噬細胞特異性抗原，是其常見標記物，參與標記巨噬細胞成熟和活化過程。在NASH發(fā)生發(fā)展過程中，各種促炎因子及炎性細胞激活具有重要作用[20]。為進一步研究炎癥反應(yīng)，筆者在本實驗檢測炎癥因子和巨噬細胞標志物在小鼠肝臟的表達。研究發(fā)現(xiàn)，南蛇藤醇能減輕小鼠肝臟IL-1β及F4/80表達，提示南蛇藤醇對肝臟炎癥具有抑制作用。同時，肝纖維化是NASH發(fā)展到終末期的主要病理表型之一。COL1A1是肝纖維化重要標志物[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，南蛇藤醇可使小鼠肝臟COL1A1表達明顯降低，進一步證明南蛇藤醇在NASH中的潛在治療作用。

本研究結(jié)果表明，南蛇藤醇具有明顯改善NASH的藥效學(xué)效應(yīng)，這為南蛇藤醇在NASH治療中的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。其具體作用機制有待進一步研究。