艾 默，楊宏，曲冬穎，姚愛林

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110016

腸道是對電離輻射較敏感的器官。有研究表明，放射性腸損傷的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的主要原因包括腸上皮細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)過度激活等［1-2］。目前，臨床上治療放射性腸損傷的效果不佳，主要是對癥治療。人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是200 多種不易消化和非營養(yǎng)性碳水化合物的復(fù)雜混合物［3］。其可調(diào)節(jié)腸道菌群環(huán)境，促進有益菌群的生長，還可以作為抗粘附抗菌劑，阻礙病菌與人體腸道黏膜細(xì)胞的結(jié)合，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)［4-7］。HMOs 可以作為粘膜表面病原體的誘餌受體，影響宿主的健康狀況，同時亦可通過增強腸道屏障功能改善宿主防御機制［8］。本研究旨在探討HMOs 預(yù)處理對大鼠結(jié)直腸組織放射性損傷的保護作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 HMOs 購自惠誠生物公司（中國），二甲苯、乙醇、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）購自國藥化學(xué)試劑有限公司，抗Ki-67 抗體購自BD 公司，切割的caspase-3 抗體購自Cell Signaling 公司，CD31 抗體購自Abcam，F(xiàn)Hs74Int 細(xì)胞來源于美國型培養(yǎng)物庫，CCK-8 試劑盒購自美國Biotool 公司，多功能微孔板讀取器購自美國分子器件公司，顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2 實驗動物及樣品采集 6 周齡雄性C57BL/6大鼠30 只，體質(zhì)量20～25 g，購自上海SLAC 實驗動物有限公司（中國），在無特定病原體條件下飼養(yǎng)。所有動物實驗均獲得北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。將實驗動物隨機分為空白對照組10 只，放射（irradiation，IR）組10 只，IR+HMOs 組10 只。IR 組及IR+HMOs 組予12 Gy 的60Co γ 射線一次性全腹照射，HMOs 組照射前3 d 口飼HMOs（10 mg/kg）。IR 后1 周處死大鼠。收集十二指腸（小腸上部）、空腸（小腸中部）和回腸（小腸下部），用10% 福爾馬林固定12 h，切取組織，脫水，石蠟包埋，切片。

1.3 蘇木精伊紅染色 組織切片在70℃烘箱中烘烤30 min，二甲苯脫蠟5 min，通過梯度濃度乙醇（100%、95%、90% 和85% 各1 min）再水化，并用血紅素染色3 min。清洗切片，在100% 乙醇中浸泡1 min，伊紅復(fù)染20 s，染色后用梯度濃度乙醇脫水（75%、80%、85%、90%、95% 和100%，各1 min），貼于載玻片上，用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.4 腸絨毛長度測量及腸隱窩數(shù)計數(shù) 用光鏡（200 倍放大鏡）對組織切片進行分析，每組至少測量20 條腸絨毛的長度。組織切片采用光鏡（200 倍放大鏡）分析，每組10 個腸道標(biāo)本計數(shù)，得到平均隱窩數(shù)。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 對各組大鼠小腸組織切片進行免疫組織化學(xué)染色，切片在室溫下與10%BSA（含0.3%tritonx-100）孵育1 h。加入相應(yīng)的一級抗體抗TNF-α（1∶1 000）、抗IL-6（1∶2 000），4℃孵育過夜，PBS 洗滌后，加入二抗，室溫下無光孵育2 h。PBS 洗滌后，加入DAPI 染色液，并在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 RNA 提取和定量實時PCR 分析 采用Trizol分離來自組織和細(xì)胞的總RNA。然后使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega，美國）將總RNA（2 μg）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green qPCR 預(yù)混液（美國羅氏公司）評估基因表達(dá)。

1.7 蛋白免疫印跡法檢測 回腸組織利用RIPA裂解緩沖液進行裂解。提取后用BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。全部樣品（50 g），用8%～12% 的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后用PVDF 膜吸附蛋白。5% 脫脂牛奶封閉后，用一級抗體Zo-1（1∶800）、Occludin（1∶1 000）、Claudin-1（1∶1 000）孵育，4℃下過夜。次日洗滌后加入二抗，室溫孵育1 h，再次洗滌后，利用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。

1.8 生化測定 取回腸組織，用丙二醛、總超氧化物歧化酶、還原型谷胱甘肽和過氧化氫酶測定試劑盒（南京建城生物工程研究所）進行丙二 醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和過氧化氫酶（catalase，CAT）的生化測定。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料以例（百分率）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMOs 預(yù)處理可減輕放射性腸絨毛損傷和隱窩丟失X 線（10 Gy）照射可引起大鼠小腸絨毛頂端斷裂、絨毛脫落和絨毛長度縮短（約60 μm，P<0.05）以及腸隱窩數(shù)目下降（P<0.05）。與僅接受放射治療的大鼠比較，HMOs 預(yù)防治療大鼠絨毛長度縮短程度降低，腸隱窩數(shù)目損傷較小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

圖1 HMOs對放射性腸損傷的影響（a.各組大鼠小腸組織染色圖像，HE×200；b.HMOs對放射引起的腸絨毛長度的影響；c.HMOs對放射引起的腸隱窩數(shù)的影響）

2.2 HMOs 預(yù)處理降低輻射誘導(dǎo)的腸組織中炎癥因子表達(dá) 為進一步驗證HMOs 預(yù)處理對放射性腸損傷的保護作用，利用免疫組織化學(xué)染色對組織中的炎癥因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）進行檢測。輻射可明顯引起大鼠腸組織中TNF-α、IL-6 水平的增加（P<0.05）。IR+HMOs 組大鼠腸組織中TNF-α、IL-6 水平明顯低于IR 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 HMOs 預(yù)處理改善輻射誘導(dǎo)的腸細(xì)胞完整性相關(guān)分子的表達(dá) 放射性腸損傷中，腸上皮細(xì)胞的完整性亦常受到破壞。采用蛋白免疫印跡法檢測腸細(xì)胞中細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1 以及細(xì)胞骨架蛋白Zo-1 水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IR 組大鼠腸上皮細(xì)胞中上述3 種蛋白較空白對照組均明顯減少（P<0.05），說明放射性腸損傷存在腸上皮細(xì)胞緊密連接受損，其細(xì)胞完整性受到損傷；IR+HMOs 組Occludin、Claudin-1 以及Zo-1 蛋白水平較IR 組均有較明顯升高（P<0.05）。見圖3。

圖3 HMOs預(yù)處理改善輻射誘導(dǎo)的腸細(xì)胞受損［a.腸切片免疫熒光染色（400倍）；b.蛋白免疫印跡法檢測Occludin、Claudin-1以及Zo-1的表達(dá)；c.各組大鼠小腸組織中Occludin表達(dá)水平；d.各組大鼠小腸組織中Zo-1表達(dá)水平；e.各組大鼠小腸組織中Claudin-1表達(dá)水平］。

2.4 HMOs 預(yù)處理降低輻射誘導(dǎo)的腸組織氧化應(yīng)激反應(yīng) 生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)，發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為MDA，這會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，具有細(xì)胞毒性。內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，包括酶促抗氧化劑（如SOD）以及非酶抗氧化劑（如GSH），其可清除或減少多種氧化劑［9］。通過生化檢測發(fā)現(xiàn)，IR 組與空白對照組相比較，MDA 水平明顯增高（P<0.05），SOD 及GSH 水平明顯下降（P<0.05），說明放射性腸損傷存在氧化應(yīng)激反應(yīng)過度激活；IR+HMOs 組與IR 組相比較，MDA 水平明顯下降（P<0.05），SOD 及GSH 明顯增高（P<0.05）。結(jié)果表明，HMOs 預(yù)處理可在一定程度上降低輻射誘導(dǎo)的腸組織氧化應(yīng)激反應(yīng)。見圖4。

圖4 HMOs預(yù)處理降低輻射誘導(dǎo)的腸組織氧化應(yīng)激反應(yīng)（a.各組大鼠小腸MDA水平；b.各組大鼠小腸GSH水平；c.各組大鼠小腸SOD水平）

3 討論

目前，近40% 生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和結(jié)直腸腫瘤患者曾接受放射治療，而消化道是腹腔放療中較常見的損傷部位，其中，近50% 的盆腔放射治療患者存在明顯的消化道癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［10-12］。射線殺傷的成熟上皮細(xì)胞死亡損傷高峰大約會在其輻射后的第3 日出現(xiàn)［13-14］；且射線對分化、增殖能力強大的腸上皮干細(xì)胞更具殺傷力，能直接導(dǎo)致腸道屏障功能受損、腸道菌群失調(diào)、腸黏膜損傷、通透性增加等病變，嚴(yán)重者可出現(xiàn)細(xì)菌感染導(dǎo)致的全身炎癥、膿毒血癥、多器官功能障礙綜合征等［15］。本研究結(jié)果顯示，輻射可致大鼠腸絨毛損傷及隱窩明顯減少、炎癥因子表達(dá)明顯增加、腸上皮細(xì)胞完整性明顯下降以及腸免疫應(yīng)激過度激活。HMOs 是存在于母乳中的一類重要低聚糖，其成分復(fù)雜且豐富，含有許多生物分子，如免疫球蛋白、先天性糖蛋白、生物活性肽、抗體、糖脂、游離脂肪酸、細(xì)胞因子和趨化因子等［16］。有研究表明，HMOs 的一個重要特性是免疫調(diào)節(jié)，通過直接調(diào)節(jié)腸細(xì)胞的基因表達(dá)，使細(xì)胞表面聚糖和其他細(xì)胞反應(yīng)的表達(dá)發(fā)生變化，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞因子的產(chǎn)生，使免疫反應(yīng)更加平衡［17］；另有研究顯示，HMOs 可通過調(diào)節(jié)腸道微生物菌群來預(yù)防壞死性小腸結(jié)腸炎、念珠菌病和一些免疫相關(guān)疾病的發(fā)生［18］。本研究中，用HMOs 預(yù)防治療與僅接受放射治療的大鼠相比較，絨毛長度縮短程度降低，腸隱窩數(shù)目損傷較??；IR+HMOs 組與IR 組相比較，腸組織中炎癥因子TNF-α、IL-6 水平明顯降低；HMOs 預(yù)處理可改善輻射誘導(dǎo)的腸細(xì)胞受損，明顯降低輻射誘導(dǎo)的腸組織氧化應(yīng)激反應(yīng)。這說明，HMOs 預(yù)處理可在一定程度上降低輻射對腸道的損傷作用。

綜上所述，HOMs 作為一種多聚糖，在放射性腸損傷疾病中能發(fā)揮抗炎、修復(fù)損傷以及免疫調(diào)節(jié)作用，在一定程度上對RE 具有保護作用。